CN111394312A - 基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面、其制法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面、其制法与应用。所述CTC捕获界面包括TiO2纳米纤维界面,连接于TiO2纳米纤维界面表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子。本发明通过构建无机材料掺杂有机材料的复合纳米纤维,经过煅烧工艺的加工,构筑TiO2纳米纤维三维界面,引入抗粘附分子降低细胞在界面的非特异粘附,以及,利用CTC亲和捕获分子,实现CTC细胞的特异性捕获。本发明的CTC捕获界面制备工艺简便、修饰过程稳定、成本低廉,可给CTC捕获提供仿ECM结构的三维环境,并能实现对核仁素高表达的CTC在三维TiO2纳米纤维上的特异性捕获。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米生物技术领域,具体的涉及一种基于TiO2纳米纤维界面及其制备方法,以及基于适配体修饰的TiO2纳米纤维CTC捕获界面在CTC特异性捕获方面的应用,属于医学临床CTC分离技术领域。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)作为诊断癌症是否转移和检测预后是否复发的生物标志物之一,引起了大批科研工作者的关注;在临床上,CTC在检测癌症转移中具有重要的指示性和预测性,但其本身的稀少性和异质性为CTC检测方法的建立带来了极大的挑战。对CTC的检测是在数十亿的血细胞中进行的,巨大的背景细胞(血细胞)的存在不仅使得靶细胞(CTC)的富集变得极其困难,而且对后续的分子分析的纯度要求也难以满足。因此基于CTC表面生物标志物过表达的特征,采用灵敏度比较高的核仁素适配体对CTC进行捕获具有一定的可行性。AS1411是一段单链寡核苷酸序列,具特殊四链体结构,能够与肿瘤细胞表面高表达的核仁素进行特异性结合,并具有很强亲和力,AS1411适配体能够识别特定肿瘤细胞,并可抑制肿瘤细胞增殖,且已被用于II期临床试验研究中。
目前对于CTC的分离捕获技术大部分依赖于上皮特性的生物特性,然而,当肿瘤细胞处于EMT阶段或低表达上皮特性膜蛋白时,则无法捕捉这类细胞。正是这些“隐身”的肿瘤细胞致使癌症发生了转移,推进了癌症进程。同时,近期研究表明核仁素蛋白高表达的CTC作为生物标志物在耐药机制的研究中比上皮特性CTC更有意义;若利用核仁素蛋白作为生物标志物进行CTC捕获,则其使用范围更为广泛。
另外随着纳米材料领域的快速发展,与平面基底相比,纳米结构基底的比表面积更大,细胞与基底接触的机会也相应增加,同时纳米结构基底修饰的亲和捕获分子更多,更有利于CTC的捕获。然而采用针对CTC的核仁素生物标志物蛋白修饰的三维纳米结构-TiO2纳米纤维技术还没有应用于CTC的捕获研究,因此,如何构建可以实现捕获核仁素高表达的CTC的纳米纤维基底尤为重要。
另外随着纳米材料领域的快速发展,与平面基底相比,纳米结构基底的比表面积更大,细胞与基底接触的机会也相应增加,同时纳米结构基底修饰的亲和捕获分子更多,更有利于CTC的捕获。然而采用针对上皮特性CTC和EMT特性CTC的生物标志物蛋白修饰的三维纳米结构基底-PLGA纳米纤维技术还没有应用于两种表型CTCs的捕获研究,因此,如何构建可以实现同时捕获上皮特性CTC和EMT特性CTC的纳米纤维基底尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于适配体修饰TiO2纳米纤维界面的CTC特异性捕获界面,该界面在纳米纤维表面上对分子识别作用进行设计,将抗粘附分子与亲和捕获分子的作用进行有效结合,能够有效抑制细胞的非特异性粘附和有效识别靶细胞的特异性捕获,进而实现CTC的特异性捕获。
本发明的另一目的在于提供一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面的制备方法,该方法制备工艺简便、成本价格低廉、修饰过程稳定,对不同性质的材料具有普适性,并可给CTC捕获提供仿ECM结构的三维附着环境。
本发明的又一目的在于提供所述基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面的应用。
为实现前述发明目的,本发明采用的技术方案包括:
本发明实施例提供了一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面,其包括TiO2纳米纤维界面,连接于TiO2纳米纤维界面表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子,所述TiO2纳米纤维界面包括主要由分布在基材表面的直径为50~100nm的纳米纤维构成,所述纳米纤维由锐钛矿型TiO2纳米颗粒堆积而成,且具有三维网格多孔式拓扑结构。
在一较佳实施方案之中,所述TiO2纳米纤维界面是由前驱体钛酸四正丁酯和载体聚合物形成的复合纳米纤维通过煅烧,实现晶型转变获得。
本发明实施例还提供了一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面的制备方法,其包括:
(1)使钛酸四正丁酯、聚合物、无机盐和醇类溶剂混合均匀,形成粘稠、透明的醇盐-聚合物前驱物溶液,采用酸性物质对所述前驱物溶液进行老化处理,并搅拌得到电纺液;
(2)以静电纺丝装置将所述电纺液通过静电纺丝方式施加于基材表面,形成复合纳米纤维构建的界面,之后进行煅烧处理,获得TiO2纳米纤维界面,所述TiO2纳米纤维界面包括主要由分布在基材表面的直径为50~100nm的纳米纤维构成,所述纳米纤维由锐钛矿型TiO2纳米颗粒堆积而成,且具有三维网格多孔式拓扑结构;
(3)在所述TiO2纳米纤维表面连接抗粘附分子;
(4)将CTC亲和捕获分子与连接在所述TiO2纳米纤维表面的抗粘附分子偶联,获得基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面。
本发明实施例还提供了前述基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面在CTC特异性捕获中的应用。
与现有技术相比,本发明至少具有如下有益效果:
1)本发明提供的基于适配体DNA修饰的TiO2纳米纤维的CTC特异性捕获界面,为细胞捕获提供了可以与细胞纳米结构更为匹配的仿生界面,该界面使用锐钛矿型TiO2纳米颗粒构成的纤维网格结构,能够改善细胞与基底的亲和力,使得该基底能够较好的与细胞表面的微、纳米结构匹配和作用;
2)该CTC捕获界面通过静电纺丝工艺,将钛酸四正丁酯前驱体和高分子聚合物载体PVP通过电纺装置构建成复合纳米纤维,再经过煅烧工艺,使无机材料发生晶型转变和有机材料发生性变,得到三维网络多孔式拓扑结构,纤维分布均匀,界面形貌整洁;
3)该CTC捕获界面在修饰特异性捕获分子的基础上,引入抗粘附分子能够保证高效捕获靶细胞的前提下降低非靶细胞的非特异性粘附;
4)利用本发明的制备方法,所述静电纺丝纳米纤维的制备方法对不同性质的材料具有普适性;采用静电纺丝工艺,该技术具有多功能性、灵活性、工艺可控性、装置简单、成本低廉等特点,并可容易生产纤维组件;且制作工艺简单,整体成本低廉,实用性强,且适合于科学研究中;
5)利用本发明的制备方法,通过煅烧,简便快捷的实现了物质的相转变,制得的TiO2纳米纤维界面具有一定的透明度,在CTC捕获基底的应用中实用性强;
6)本发明的TiO2纳米纤维结构具有比表面积大、孔隙率高、纤维形貌均匀、纤维交织方式独特等优点,同时煅烧过后得到的TiO2纳米纤维通过纤维之间的交互连接形成三维网架结构,这种结构相似于细胞外基质(ECM)骨架蛋白的连接方式,通过这种结构效应,纳米纤维形貌改善了细胞与基底之间的作用方式,促进了细胞的粘附作用,更有利于细胞在基底上停留。
附图说明
图1是本发明一典型实施例中利用一种基于适配体修饰TiO2纳米纤维的CTC特异性捕获界面进行捕获的过程示意图。
图2是本发明一典型实施例中用以进行静电纺丝的静电纺丝设备组成示意图。
图3是本发明一典型实施例中以静电纺丝工艺制备的TBOT-PVP复合纳米纤维的扫描电镜图像。
图4是本发明一典型实施例中以静电纺丝工艺制备的TBOT-PVP复合纳米纤维煅烧后得到的TiO2纳米纤维的扫描电镜图像。
图5是本发明一典型实施例中对TiO2纳米纤维进行界面化学修饰的原理图。
图6a是本发明一典型实施例中不同端基适配体修饰的TiO2纳米纤维上细胞捕获效率图。
图6b是本发明一典型实施例中不同界面化学修饰的TiO2纳米纤维上对不同类型细胞捕获特异性的考察结果图。
图7a是本发明一典型实施例中不同界面化学修饰的TiO2纳米纤维上细胞捕获时的孵育时间对捕获结果的影响图。
图7b是本发明一典型实施例中不同界面化学修饰的TiO2纳米纤维上细胞孵育40min时捕获结果考察图。
图7c-图7e是本发明一典型实施例中不同界面化学修饰的TiO2纳米纤维上细胞孵育40min时对应界面上的捕获荧光照片。
图8a是本发明一典型实施例中适配体修饰TiO2纳米纤维界面上混合细胞捕获时的捕获行为结果考察图。
图8b-图8e是本发明一典型实施例中适配体修饰TiO2纳米纤维界面上混合细胞捕获时的捕获行为荧光图片。
图9a是本发明一典型实施例中适配体修饰TiO2纳米纤维界面上在PBS溶液中CTC细胞捕获灵敏度结果考察图。
图9b是本发明一典型实施例中适配体修饰TiO2纳米纤维界面上在全血中CTC细胞捕获灵敏度结果考察图。
具体实施方式
鉴于现有技术的不足,本案发明人经长期研究和实践,提出了本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
具体而言,本发明的一个方面包括:通过构建无机材料掺杂有机材料的复合纳米纤维,经过煅烧工艺的加工,构筑TiO2纳米纤维三维界面,引入抗粘附分子降低细胞在界面的非特异粘附,以及,利用CTC亲和捕获分子,如不同端基修饰的适配体,实现CTC细胞的特异性捕获(其原理可参阅图1)。
作为本发明技术方案的一个方面,其所涉及的系一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面,其TiO2纳米纤维界面,连接于TiO2纳米纤维界面表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子,所述TiO2纳米纤维界面包括主要由分布在基材表面的直径为50~100nm的纳米纤维构成,所述纳米纤维由锐钛矿型TiO2纳米颗粒堆积而成,且具有三维网格多孔式拓扑结构。
进一步地,所述CTC特异性捕获界面包括主要由分布在载玻片表面的TiO2纳米颗粒堆积而成的三维纳米纤维界面。
在一较佳实施方案之中,所述TiO2纳米纤维界面是由前驱体钛酸四正丁酯和载体聚合物形成的复合纳米纤维通过煅烧,实现晶型转变获得。其中,采用的TiO2纳米纤维界面是通过钛酸四正丁酯(TBOT)前驱体的晶型转变和载体聚合物(如PVP)的支架功能协调作用所获得,首先通过静电纺丝工艺制得复合纳米纤维,随后通过煅烧工艺,将前驱体实现晶型转变并使有机物载体实现彻底碳化,最后得到的TiO2纳米纤维主要由锐钛矿晶型构成,其具有纤维表面粗糙、三维结构稳定的特点。
进一步地,所述抗粘附分子旨在降低细胞在界面上的非特异性粘附,使用的是牛血清白蛋白大分子(BSA)。
进一步地,与抗粘附分子连接的所述CTC亲和捕获分子是核仁素蛋白的适配体修饰产物-生物素化的核仁素适配体AS1411,用以实现对CTC特异性捕获,例如可以是由核仁素适配体的修饰化产物组成,例如DNA-biotin,且不限于此。
作为本发明技术方案的另一个方面,其所涉及的系包括:利用静电纺丝技术将TBOT-PVP电纺溶液构筑成形貌均匀、直径均一且具有三维多孔拓扑结构的纳米纤维基底,经过煅烧工艺实现材料的相转变,形成稳定的TiO2纳米纤维界面;然后将抗粘附分子牛血清白蛋白分子,通过化学交联方式连接在TiO2纳米纤维表面,之后利用戊二醛的双功能醛基作用,将链酶亲和素-生物素化适配体的亲和捕获分子与牛血清白蛋白结合,获得所述适配体修饰的界面。
具体的讲,一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面的制备方法,其包括:
(1)使钛酸四正丁酯、聚合物、无机盐和醇类溶剂混合均匀,形成粘稠、透明的醇盐-聚合物前驱物溶液,采用酸性物质对所述前驱物溶液进行老化处理,并搅拌得到电纺液;
(2)以静电纺丝装置将所述电纺液通过静电纺丝方式施加于基材表面,形成复合纳米纤维构建的界面,之后进行煅烧处理,获得TiO2纳米纤维界面,所述TiO2纳米纤维界面包括主要由分布在基材表面的直径为50~100nm的纳米纤维构成,所述纳米纤维由锐钛矿型TiO2纳米颗粒堆积而成,且具有三维网格多孔式拓扑结构;
(3)在所述TiO2纳米纤维表面连接抗粘附分子;
(4)将CTC亲和捕获分子与连接在所述TiO2纳米纤维表面的抗粘附分子偶联,获得基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面。
进一步地,本发明利用n-型半导体材料钛酸四正丁酯(TBOT)作为前驱体,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)聚合物作为载体,经过静电纺丝技术,制备成TiO2纳米纤维界面,用作细胞捕获的界面。之后引入抗粘附分子,例如牛血清白蛋白(BSA)降低细胞在界面上的非特异粘附;利用亲和捕获分子核仁素蛋白分子的适配体(AS1411),实现CTC细胞的高特异捕获。
在一些优选实施例之中,步骤(1)的具体操作为:
将无机盐固体溶解于溶剂中,配置成无机盐-醇溶液;
将聚合物加入所述无机盐-醇溶液中,并于室温下搅拌20~40min,获得透明均一溶液;之后再加入钛酸四正丁酯溶液,于室温条件下继续搅拌1.5h以上,得到均匀、粘稠、透明的醇盐-聚合物前驱物溶液;以及
向所述醇盐-聚合物前驱物溶液中加入浓度为4~5v/v%的冰醋酸,并于40~60℃搅拌20~40min进行老化处理,在室温条件下自然冷却,得到电纺液。
进一步地,所述无机盐-醇溶液中无机盐的浓度为5~15mMol/L。
进一步地,步骤(1)的具体操作为:将CaCl2固体等无机盐溶于无水乙醇等醇类溶剂中,于室温下搅拌溶解,获得均匀的CaCl2-无水乙醇溶液,所述CaCl2固体使用浓度为5~15mMol/L。
进一步地,作为载体的所述聚合物优选为聚乙烯吡咯烷酮(PVP),但不限于此。
进一步地,所述聚乙烯吡咯烷酮的质均分子量为1200~1400kDa。
进一步地,所述醇盐-聚合物前驱物溶液中聚合物聚乙烯吡咯烷酮的含量为6~8wt%,钛酸四正丁酯的含量为6~8v/v%。
在一些优选实施例之中,步骤(2)的具体操作包括:通过静电纺丝工艺将所述电纺液喷射于基材表面,形成复合纳米纤维构建的界面,获得载有复合纳米纤维界面的基材。
进一步地,所述基材可以是载玻片,但不限于此。
进一步地,如图2所示,所述静电纺丝装置包括高压直流电源、微量进样器、注射器和锡箔接收台。
进一步地,将所述电纺液转移至所述注射器中,调整所述锡箔接收台与所述注射器的平头针头之间的距离为10~15cm,调节所述微量进样器的进样速度为1.3~1.8mL/h,调节所述高压直流电源的电压为15~20kV,将所述载玻片至于所述锡箔接收台上,接通所述高压直流电源,使所述带有电纺液的注射器向载玻片表面的锡箔接收台静电纺丝,获得所述载有复合纳米纤维界面的载玻片。
在一些优选实施例之中,步骤(2)还包括:于400~500℃的条件下,对所述载有复合纳米纤维界面的基材进行煅烧处理2~4h,使钛酸四正丁酯前驱体实现晶型转变并使作为载体的聚合物实现彻底碳化,获得TiO2纳米纤维界面。
进一步地,所述的制备方法包括:载有复合纳米纤维的载玻片置于程控箱式电炉中,进行煅烧,过程如下:升温过程中,加热速度设置为6~8℃/min;煅烧过程中,维持在400~500℃条件下持续煅烧2~4h,用以除去聚合物载体并使TBOT前驱体进行彻底的晶型转变;降温过程中,自然降温至室温即得到由锐钛矿晶型颗粒堆积的TiO2纳米纤维界面。
在一些优选实施例之中,步骤(3)的具体操作包括:将载有所述TiO2纳米纤维界面的载玻片置于浓度为1~2v/v%的硅烷化试剂(APTES)-无水乙醇溶液中活化1.5h以上,之后与浓度为2~3v/v%的戊二醛溶液反应2~4h,再与牛血清白蛋白(BSA)溶液在2~6℃条件下反应过夜,从而在所述的TiO2纳米纤维界面表面连接上抗粘附分子。
在一些优选实施例之中,步骤(4)的具体操作包括:
将步骤(3)所获连接有所述抗粘附分子牛血清白蛋白的TiO2纳米纤维界面置于24孔板中,用浓度为2~3v/v%的戊二醛溶液反应2~4h,然后于浓度为15~25μg/mL的链酶亲和素溶液中2~6℃下反应过夜;之后将所述TiO2纳米纤维界面置于浓度不低于1mol/L的乙醇胺溶液中反应5~10min,以封闭未完全反应的醛基基团;
以及,将所述封闭过的连接有链酶亲和素的TiO2纳米纤维界面与生物素化的AS1411适配体进行配体-受体化学交联反应,获得所述基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面。
在一些具体实施案例中,所述的制备方法具体包括:
步骤一:将氯化钙固体溶解于无水乙醇中,配置成CaCl2-无水乙醇溶液;
步骤二:将分子量为1200~1400kDa的PVP和TBOT溶于步骤一中的溶液,室温条件下搅拌形成均匀、粘稠、透明的聚合物溶液,即醇盐-PVP前驱物溶液;
步骤三:在步骤二的溶液中加入冰醋酸溶液将前驱物溶液老化,40~60℃搅拌即得电纺原液;
步骤四:以静电纺丝装置将步骤三所述电纺液通过静电纺丝方式施加于载玻片表面,形成TBOT-PVP复合纳米纤维构建的界面;
步骤五:将步骤四中制得的TBOT-PVP复合纳米纤维界面在程控箱式电炉中进行煅烧,得到TiO2纳米纤维界面;
步骤六:将抗粘附分子BSA和CTC亲和捕获分子AS1411依次与TiO2纳米纤维表面偶联,最后获得适配体修饰TiO2纳米纤维界面。
在一更为具体的实施案例中,一种基于适配体修饰TiO2纳米纤维界面的CTC特异性捕获界面的制备方法,可以包括如下步骤:
①将氯化钙固体溶于无水乙醇中,配置成10mM的CaCl2-无水乙醇溶液;
②采用分子量为1300kDa的PVP和TBOT溶于①中的溶液,室温条件下搅拌2.5h形成均匀、粘稠、透明的聚合物溶液,即醇盐-PVP前驱物溶液;具体的,先在CaCl2-无水乙醇溶液中溶解PVP聚合物,待搅拌成均匀溶液后再加入TBOT前驱体,继续搅拌成均匀溶液;所述PVP和TBOT使用浓度分别为7wt.%PVP和6.25v/v%TBOT;
③在步骤②中得到的醇盐-PVP前驱物溶液加入冰醋酸,使用浓度为4.5v/v%,使醇盐-PVP前驱物溶液老化,50℃条件下磁力搅拌0.5h,即可得到TBOT-PVP电纺原液;
④将步骤③中的TBOT-PVP电纺原液在静电纺丝装置中进行电纺,得以在载玻片表面收集TBOT-PVP复合纳米纤维,制得TiO2纳米纤维界面的前身;使用的电纺参数为:电源电压为18kV,接收距离是15cm,进样速度为1.5mL/h;
⑤将步骤④制得的TBOT-PVP复合纳米纤维置于程控箱式电炉中进程煅烧,具体过程为:升温过程,加热速度设置为7.5℃/min;煅烧过程,维持在450℃条件下持续煅烧3h;降温过程,自然降温至室温。此步骤用以除去聚合物PVP载体并使TBOT前驱体进行彻底的晶型转变,获得TiO2纳米纤维界面;
⑥将步骤⑤中的TiO2纳米纤维界面置于浓度为1v/v%的的硅烷化试剂(APTES)-无水乙醇溶液中活化2h,之后与浓度为2.5v/v%的戊二醛溶液反应2-4h,再与浓度为10mg/mL的BSA溶液在4℃条件下过夜,从而在所述的TiO2纳米纤维界面连接上抗粘附分子BSA层;
⑦将步骤⑥连接有所述抗粘附分子层的TiO2纳米纤维界面置于浓度为2.5v/v%的戊二醛溶液反应2-4h,然后于浓度为20μg/mL的链酶亲和素溶液中4℃条件下反应过夜,获得链酶亲和素修饰的TiO2纳米纤维界面;
其次,将所述链酶亲和素修饰的TiO2纳米纤维界面置于浓度为1mol/L的乙醇胺溶液中反应10min,以封闭未完全反应的醛基基团;
⑧将步骤⑦获得的封闭后的TiO2纳米纤维界面进行CTC亲和捕获分子的修饰,包括1μmol/L生物素化的AS1411适配体,即制得所述适配体修饰的基底。
综上,该方法制备工艺简便、成本价格低廉、修饰过程稳定,并可给CTC捕获提供仿ECM结构的三维环境。
作为本发明技术方案的另一个方面,其所涉及的系前述基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面在CTC特异性捕获中的应用。
其中进一步地,应用所述TBOT前驱体与PVP进行静电纺丝得到复合纳米纤维,然后煅烧,使得TBOT前驱体发生晶型转变,获得锐钛矿型TiO2纳米纤维界面;再行CTC捕获,方法包括如下步骤:在界面上将核仁素适配体与所述TiO2纳米纤维连接,使其在细胞培养箱中孵育,对基底所捕获CTC进行鉴定并计数。
例如,其中的一种应用方案可以是:一种无机材料的纳米纤维制备方法,其包含前述的任一种复合纳米纤维的制备和无机材料纳米纤维的煅烧。
例如,其中的一种应用方案可以是:一种CTC的捕获方法,包括:将适配体DNA修饰于TiO2纳米纤维界面上,实现捕获高表达核仁素蛋白的循环肿瘤靶细胞。
其中,利用CTC细胞表面与对照细胞表面生物标志物蛋白的表达之间的差异,可获得特异性捕获某类CTC的三维结构界面。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
一、TBOT-PVP纳米纤维电纺溶液的制备:
配置10mM的CaCl2溶液,所述溶液使用的是无水乙醇;将分子量为1300kDa的PVP和前驱体TBOT依次溶解在所述CaCl2-无水乙醇溶液中,控制PVP与TBOT在电纺溶液中的浓度分别为7wt.%PVP和7%TBOT,在室温条件下搅拌2.5h形成醇盐-PVP前驱物溶液。随后加入冰醋酸溶液,将醇盐-PVP前驱物溶液老化,在50℃下用磁力搅拌器继续搅拌30min即得电纺原液,优选地,所述冰醋酸的使用浓度为4.5v/v%。室温条件下静置过夜,使电纺液形成适当粘度的凝胶溶液,并去除气泡即为TBOT-PVP电纺原液。
二、静电纺丝TBOT-PVP纳米纤维的制备:
将载玻片分别用洗洁精、水、工业酒精、无水乙醇超声清洗20min,将洗净的载玻片烘干备用,将制备例1中的TBOT-PVP电纺原液在静电纺丝装置如图2中进行电纺,调整锡箔接收台与注射器平头针头之间的距离为15cm,调节微量进样器的进样速度为1.5mL/h,调节高压直流电源的电压为18kV;配备22#不锈钢平头针头作为喷丝头,将所述载玻片放置于锡箔接收台上,接通高压直流电源进行静电纺丝。则在载玻片上收集的纳米结构层是由直径为252.79±71.66nm之间的TBOT-PVP复合纳米纤维堆积而成,如图3所示,为本实施例中制得的TBOT-PVP复合纳米纤维的扫描电镜图。
三、TBOT-PVP复合纳米纤维煅烧,TiO2纳米纤维界面的制备:
将步骤二中得到的TBOT-PVP复合纳米纤维置于程控箱式电炉中进程煅烧,具体过程为:升温过程,加热速度设置为7.5℃/min;煅烧过程,维持在450℃条件下持续煅烧3h;降温过程,自然降温至室温,使TBOT陶瓷前驱物发生相转变和有机物载体PVP消除,煅烧后获得TiO2纳米纤维界面如图4所示,纤维直径是81.33±25.70nm。
四、TiO2纳米纤维界面的修饰方法具体步骤如下:
步骤(1):将步骤三中得到的TiO2纳米纤维载玻片切割成1cm×1cm大小的小载玻片,即TiO2界面。
步骤(2):将步骤(1)中的TiO2界面置于浓度为1%的的硅烷化试剂(APTES)-无水乙醇溶液中活化2h,之后与浓度为2.5%的戊二醛溶液反应2-4h,再与浓度为10mg/mL的BSA溶液在4℃下过夜,从而在所述TiO2界面连接上抗粘附分子BSA层,即TiO2-BSA界面。
步骤(3):将步骤(2)中的TiO2-BSA界面置于浓度为2.5%的戊二醛溶液反应2-4h,然后于浓度为20μg/mL的链酶亲和素溶液中4℃下反应过夜,获得链酶亲和素修饰的TiO2纳米纤维界面;而后,将所述链酶亲和素修饰的TiO2纳米纤维界面置于浓度为1mol/L的乙醇胺溶液中反应10min,以封闭未完全反应的醛基基团;最后将封闭后的界面进行CTC亲和捕获分子的修饰,包括1mol/L生物素化的AS1411适配体,即制得TiO2-BSA-AS1411界面。其修饰过程的原理图如图5所示。
下面,以实施例1为代表,通过几种项目性能测试展示实施例所获基于适配体修饰TiO2纳米纤维界面的CTC特异性捕获界面的应用优势。
性能测试一
以MCF-7细胞作为核仁素蛋白高表达的细胞系模型,考察了不同界面、不同端基的适配体修饰的TiO2纳米纤维界面上对MCF-7细胞捕获行为的差异。当细胞生长状态良好并长至90%时,对于贴壁细胞MCF-7,采用0.25%胰蛋白酶对细胞进行1min的消化剥离,之后弃去胰蛋白酶液,加入新鲜培养液吹打细胞至分散均匀,形成均一的细胞悬液。取一定数量的细胞,加入10μg/mL的DiI染料加入细胞悬液中,在37℃下对细胞染色20min后,PBS清洗以除去多余染料;对细胞计数,调整细胞悬液至终浓度为0.5×105细胞/毫升。将5种不同修饰界面的TiO2纳米纤维界面置于24孔板中,分别加入制备好的细胞悬液,在细胞培养箱内孵育40min;PBS清洗3-5次,加入1毫升4%多聚甲醛溶液固定样本,在荧光倒置显微镜下观察结果,并随机取样拍照,统计结果。
如图6a所示,对比空白TiO2界面和TiO2-BSA封闭界面,结果说明抗粘附分子BSA能够有效封闭基底并减少非特异性细胞的粘附;而经过不同端基适配体修饰的基底的捕获效率明显得到提升,说明适配体的修饰可以提高靶细胞的捕获作用,但是不同端基DNA修饰的界面之间的差异,说明在界面表面连接有适配体的情况不同,而生物素化的适配体修饰的界面对CTC的捕获结果最佳。通过综合比较最终选择生物素化的适配体修饰的界面作为实验组,既保证了细胞的高效捕获同时尽可能的抑制了细胞的非特异性粘附。
以MCF-7细胞作为核仁素蛋白高表达的细胞系模型,细胞鼠胚胎纤维母细胞(NIH3T3)和人肾上皮细胞(293T)为阴性对照细胞系模型,考察了不同界面的TiO2纳米纤维界面上对不同细胞系模型的捕获行为之间的差异。
图6b分别是不同修饰界面的TiO2纳米纤维界面对不同细胞的捕获结果图,结果显示:TiO2空白基底和TiO2-BSA基底上对不同细胞系的捕获作用差异不大;而TiO2-BSA中BSA作为抗粘附分子,极大的降低了不同细胞系在基底上的非特异性粘附,由此说明,BSA作为抗粘附分子能够有效控制该界面对细胞的粘附。对比TiO2-BSA-Bitoin-AS1411的界面上不同细胞系的捕获结果,对高表达核仁素蛋白的MCF-7细胞系的捕获结果远高于另两种阴性对照细胞的结果,说明适配体修饰的TiO2界面对核仁素高表达的细胞系具有较高的捕获效率,而选择性的捕获低表达核仁素蛋白的细胞系模型。
性能测试二
为研究孵育时间对细胞捕获结果的影响,将不同界面的TiO2纳米纤维包括空白TiO2界面、TiO2-BSA界面、TiO2-BSA-Biotin-AS1411界面置于24孔板中,分别对MCF-7细胞进行捕获,然后在培养箱内孵育不同的时间依次从10min至60min,每间隔10min做一次细胞捕获的结果统计,如图7a所示,随着孵育时间的增加,各界面对细胞的捕获数量也在不断增加,当孵育时间延长至40min时,适配体修饰的界面捕获效率达到饱和,而空白TiO2界面上对细胞仍有上升空间;继续延长孵育时间,适配体修饰的界面捕获效率未发生明显提高,这表明40min时靶细胞与TiO2纳米纤维界面及其适配体的结合过程已较充分,实现了靶细胞的高效率捕获,确定本发明的界面用于靶细胞的捕获过程需要约40min。
参见图7b、7c-图7e所示,表示的是不同TiO2纳米纤维界面与MCF-7细胞孵育40min的捕获效率和对应的荧光图像。由此也可说明靶细胞MCF-7在空白TiO2界面、TiO2-BSA界面、TiO2-BSA-Biotin-AS1411界面捕获效率具有明显差异,BSA与DNA适配体在界面上的功能
作用具有明显的体现,图7c-图7e中红点表示的是DiI染料染色的MCF-7细胞,直观的说明不同界面之间捕获靶细胞的差异。
性能测试三
白细胞悬液的制备:在新鲜全血中加入适量抗凝剂,将等量的PBS溶液加入全血中进行稀释混匀。在新的离心管内加入同全血等体积的淋巴细胞分层液到离心管底部,然后将稀释好的血液沿离心管管壁缓慢加到淋巴细胞分层液上面,使稀释血液漂浮在分层液上,两者之间形成的分界界面越清晰越好;在常温下离心,转速设为2000转/分钟,离心20分钟后,管内可分为四层。将单核细胞层移到新的离心管中,加入4倍体积的PBS,混匀,室温离心2000转/分钟,离心10分钟,去除混杂的血小板等杂质,弃上清,重复洗涤两次,然后加入适量DMEM培养基制备白细胞悬浮液。
将制得的白细胞悬浮液用DiO染料染色,乳腺癌细胞MCF-7用DiI染料染色,各染20min后,PBS清洗除去多余染料后进行计数,调整细胞悬液浓度为105cells/mL,取等体积的白细胞悬液和MCF-7悬液混合均匀,制备成1:1的混合细胞样本以备用。将TiO2-BSA-Biotin-AS1411界面置入新的24孔板内,每孔加入1mL混合细胞悬液,细胞培养箱内孵育一定时间后;PBS清洗3次,在荧光倒置显微镜下观察基底界面捕获到的细胞并随机取样拍照,统计结果。
适配体修饰的TiO2纳米纤维界面对靶细胞具有较高的捕获特异性,如图8a所示。对应的捕获荧光图像如8b-图8e所示,图8b明场表示的是TiO2基底对混合细胞捕获的情况,图8c红色通道显示的是MCF-7细胞捕获情况,图8d绿色通道显示的是WBC细胞捕获情况,图8e(Merge图)表示明场与荧光场之间的融合图。由此可知适配体修饰的TiO2纳米纤维界面对MCF-7细胞的捕获基本不受WBC细胞的影响,而对WBC的捕获也保持在较低的水平,所以TiO2-BSA-Biotin-AS1411界面可以实现对CTC高效、高特异性、高纯度的捕获。
性能测试四
考察了适配体修饰TiO2纳米纤维界面对CTC细胞捕获灵敏度的行为,以适配体修饰TiO2纳米纤维界面为基底,将已染色的MCF-7细胞配置成10cells/mL、20cells/mL、50cells/mL、100cells/mL、200cells/mL一系列浓度的PBS或全血悬液,加入到含TiO2-BSA-Biotin-AS1411界面的孔板里,置于37℃、5%CO2培养箱内孵育40min;而后用PBS清洗3次,在PBS中的捕获灵敏度结果如图9a所示,说明在少数CTC存在于纯PBS中时,适配体修饰的TiO2纳米纤维界面具有较高的捕获灵敏度。继而将不同数量的靶细胞加入到全血当中的捕获灵敏度如图9b所示,结果表明,适配体修饰的TiO2纳米纤维界面基底对全血中的CTC的捕获效率均高于70%,这说明即使全血中的CTC数量极少,利用这种方法修饰的TiO2界面仍能实现对复杂成分中靶细胞的捕获。
综述之,本发明构筑了具有良好三维纳米网架结构的TiO2纳米纤维表面,该界面的制作过程简单快捷,形成的界面稳定性好,且具有较高的细胞捕获选择性和特异性,并可实现对少数量细胞的灵敏性捕获。
应当理解,以上所述实例仅为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面,其特征在于包括TiO2纳米纤维界面,连接于TiO2纳米纤维界面表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子,所述TiO2纳米纤维界面包括主要由分布在基材表面的直径为50~100nm的纳米纤维构成,所述纳米纤维由锐钛矿型TiO2纳米颗粒堆积而成,且具有三维网格多孔式拓扑结构。
2.根据权利要求1所述的基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面,其特征在于:所述TiO2纳米纤维界面是由前驱体钛酸四正丁酯和载体聚合物形成的复合纳米纤维通过煅烧,实现晶型转变获得。
3.根据权利要求1所述的基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面,其特征在于:所述抗粘附分子包括牛血清白蛋白;和/或,所述CTC亲和捕获分子包括核仁素蛋白分子的适配体修饰产物生物素化的核仁素适配体AS1411。
4.一种基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面的制备方法,其特征在于包括:
(1)使钛酸四正丁酯、聚合物、无机盐和醇类溶剂混合均匀,形成粘稠、透明的醇盐-聚合物前驱物溶液,采用酸性物质对所述前驱物溶液进行老化处理,并搅拌得到电纺液;
(2)以静电纺丝装置将所述电纺液通过静电纺丝方式施加于基材表面,形成复合纳米纤维构建的界面,之后进行煅烧处理,获得TiO2纳米纤维界面,所述TiO2纳米纤维界面包括主要由分布在基材表面的直径为50~100nm的纳米纤维构成,所述纳米纤维由锐钛矿型TiO2纳米颗粒堆积而成,且具有三维网格多孔式拓扑结构;
(3)在所述TiO2纳米纤维表面连接抗粘附分子;
(4)将CTC亲和捕获分子与连接在所述TiO2纳米纤维表面的抗粘附分子偶联,获得基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于步骤(1)具体包括:
将无机盐固体溶解于溶剂中,配置成无机盐-醇溶液;
将聚合物加入所述无机盐-醇溶液中,并于室温下搅拌20~40min,之后再加入钛酸四正丁酯,于室温下搅拌1.5h以上,得到醇盐-聚合物前驱物溶液;以及
向所述醇盐-聚合物前驱物溶液中加入浓度为4~5v/v%的冰醋酸,并于40~60℃搅拌20~40min进行老化处理,室温冷却,得到电纺液;
优选的,所述无机盐-醇溶液中无机盐的浓度为5~15mMol/L;尤其优选的,所述无机盐包括CaCl2;尤其优选的,所述醇类溶剂包括无水乙醇;
优选的,所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮;尤其优选的,所述聚乙烯吡咯烷酮的质均分子量为1200~1400kDa;
优选的,所述醇盐-聚合物前驱物溶液中聚合物的含量为6~8wt%,钛酸四正丁酯的含量为6~8v/v%。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于步骤(2)包括:通过静电纺丝工艺将所述电纺液喷射于基材表面,形成复合纳米纤维构建的界面,获得载有复合纳米纤维界面的基材;优选的,所述基材包括载玻片;
优选的,所述静电纺丝装置包括高压直流电源、微量进样器、注射器和锡箔接收台;尤其优选的,所述锡箔接收台与所述注射器的平头针头之间的距离为10~15cm,所述微量进样器的进样速度为1.3~1.8mL/h,所述高压直流电源的电压为15~20kV。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于步骤(2)包括:于400~500℃的条件下,对所述载有复合纳米纤维界面的基材进行煅烧处理2~4h,使钛酸四正丁酯前驱体实现晶型转变并使作为载体的聚合物实现彻底碳化,获得TiO2纳米纤维界面;优选的,所述制备方法还包括:以6~8℃/min的升温速率将煅烧处理的温度升至400~500℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于步骤(3)具体包括:将所述TiO2纳米纤维界面置于浓度为1~2v/v%的硅烷化试剂-无水乙醇溶液中活化1.5h以上,之后与浓度为2~3v/v%的戊二醛溶液反应2~4h,再与牛血清白蛋白溶液在2~6℃反应过夜,从而在所述的TiO2纳米纤维界面表面连接上抗粘附分子;优选的,所述硅烷化试剂包括APTES。
9.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于步骤(4)具体包括:
将步骤(3)所获连接有所述抗粘附分子牛血清白蛋白的TiO2纳米纤维界面与浓度为2~3v/v%的戊二醛溶液反应2~4h,然后于浓度为15~25μg/mL的链酶亲和素溶液中2~6℃下反应过夜;之后将所述TiO2纳米纤维界面置于浓度不低于1mol/L的乙醇胺溶液中反应5~10min,以封闭未完全反应的醛基基团;
以及,将连接有链酶亲和素的TiO2纳米纤维界面与生物素化的AS1411适配体进行配体-受体化学交联反应,获得所述基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面。
10.如权利要求1-3中任一项所述的基于TiO2纳米纤维的CTC捕获界面在CTC特异性捕获中的应用。
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