CN111388681B - 一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111388681B
CN111388681B CN201910004569.8A CN201910004569A CN111388681B CN 111388681 B CN111388681 B CN 111388681B CN 201910004569 A CN201910004569 A CN 201910004569A CN 111388681 B CN111388681 B CN 111388681B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
beta
chitosan
asarone
modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910004569.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111388681A (zh
Inventor
刘梅
胡凯莉
徐晓璐
余双文
吴晓俊
陈晓冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201910004569.8A priority Critical patent/CN111388681B/zh
Publication of CN111388681A publication Critical patent/CN111388681A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111388681B publication Critical patent/CN111388681B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/075—Ethers or acetals
    • A61K31/085—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon
    • A61K31/09—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon having two or more such linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种β‑细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用，所述β‑细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒包括壳聚糖纳米粒、以及修饰在壳聚糖纳米粒上的β‑细辛醚。

Description

一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域。
背景技术
石菖蒲为天南星科植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.)的干燥块茎，具有芳香开窍、醒脑益智的功效，是芳香开窍的代表性药物。β-细辛醚(β-asarone，β-Asa)是石菖蒲的主要有效成分之一，除本身易透过鼻腔粘膜和血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)进入脑组织，还可对其他药物起到促透作用，同时还具有改善BBB功能和保护脑组织的作用。
鼻腔给药是一种非侵入性、无痛、无无菌要求且操作简单的给药方式。且从鼻腔给药是绕过血脑屏障达到脑靶向的有效方法，经鼻给药入脑涉及分别起始于脑终止于嗅觉神经上皮或呼吸上皮的嗅神经和三叉神经系统，作为中枢神经系统唯一暴露的部位，它是非侵入性直接脑部递送的典型途径。
壳聚糖(Chitosan，CS)是自然界中唯一的天然碱性多糖，具有独特的生物粘附性、生物相容性、可降解性以及表面可修饰性等特性。将壳聚糖用作制备纳米粒的材料有许多优势，包括：1)它是一个包含许多的游离氨基的线状聚胺，便于交联反应；2)控制有效成分释放；3)由于其溶解于酸性水溶液中所以在制造载体时能避免毒性有机试剂的使用；4)阳离子特征可以使其强烈地结合携带负电荷的材料，细胞表面和粘膜等，其中与带负电荷的细胞膜的相互作用，有助于打开紧密连接5)具有粘膜粘附性，可以延长其在靶点的停留时间从而增加吸收等。壳聚糖纳米粒是一种理想的鼻腔给药纳米载体，但是其脑部渗透率仍有待提高。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种物理稳定性好的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米载体及其制备方法和其在药物制剂领域中的应用，以解决因血脑屏障的阻碍而引起的脑部渗透率低的问题。
第一方面，本发明提供一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒，其包括壳聚糖纳米粒、以及修饰在壳聚糖纳米粒上的β-细辛醚。
根据本发明，β-细辛醚不仅本身易透过鼻腔粘膜和BBB进入脑组织，还可对其他药物起到促透作用，同时还具有改善BBB功能和保护脑组织的作用，将其修饰在壳聚糖纳米粒上，不仅显著提高了鼻粘膜细胞对纳米粒的摄取，也提高了纳米粒的脑部渗透率，通过鼻腔递送可显著提高脑部渗透率。
本发明中，所述β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的粒径可为150nm以下。
本发明中，所述β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的电位可在10～40mV。
较佳地，所述β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒中还含有交联剂，如三聚磷酸钠、戊二醛京尼平等。
本发明中，所述β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒中载有药物。优选地，所述药物为治疗性药物和/或诊断性药物。所述诊断性药物例如为细胞膜深红色荧光探针(DiR)等。所述治疗性药物例如为化疗药和/或治疗神经系统疾病药物。治疗神经系统疾病药物包括但不限于治疗帕金森的药物、治疗多发性硬化症的药物、治疗阿尔茨海默氏病的药物。或者所述治疗性药物为大分子药物、小分子药物、中药有效成分、小分子DNA中的至少一种。
较佳地，所述壳聚糖的分子量为5～62Kda，脱乙酰度大于95％。
第二方面，本发明提供β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将β-细辛醚修饰到壳聚糖上；
b)将β-细辛醚修饰的壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到溶液A；
c)将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到溶液B；
d)在搅拌条件下将溶液A与溶液B混合，调节溶液的pH值为4～6，并加入交联剂溶液，搅拌一段时间，得到β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒。
根据本发明，采用离子交联法制备纳米粒，是一种温和，简便，条件可控性高的方法。
较佳地，步骤a)中，将β-细辛醚修饰到壳聚糖上包括以下步骤：
1)将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与β-细辛醚反应得到中间体D；
2)将壳聚糖与中间体D反应一段时间后，加入乙酰氧基硼氢化钠反应一段时间，得到β-细辛醚修饰的壳聚糖。
较佳地，溶液A中，β-细辛醚修饰的壳聚糖的浓度为0.5～2mg/mL，溶液B中，壳聚糖的浓度为0.5～2mg/mL，溶液A与溶液B的混合体积比为1：9～3：7。
较佳地，步骤d)中，在将溶液A与溶液B混合后，还加入药物溶液。
较佳地，所述交联剂选自三聚磷酸钠、戊二醛、卡拉胶、京尼平中的至少一种。
第三方面，本发明提供上述β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒在制备药物制剂、尤其是脑部递送载体系统中的应用。
附图说明
图1为本发明一实施方式的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的结构示意图。
图2是实施例1制得的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的粒径分布图。
图3是实施例2制得的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的粒径分布图。
图4为鼻腔粘膜细胞对实施例1、2和对比例制备的壳聚糖纳米粒摄取情况的比较。
图5为实施例1、2和对比例制备的壳聚糖纳米粒经鼻腔给药后入脑情况的比较。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
图1示出本发明一实施方式的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的结构示意图。如图1所示，β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒包括壳聚糖(CS)和β-细辛醚(β-Asa)。其中，壳聚糖形成为纳米粒，β-细辛醚修饰在壳聚糖纳米粒表面。β-细辛醚可通过醛胺缩合作用与壳聚糖相连。
β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的粒径在150nm以内，呈高斯分布，粒径分布较窄。粒径在150nm以内时，粒径较小，有助于通过血脑屏障。
β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒表面携带正电荷，电位可在10～40mV，例如19～27mV。由此，该纳米粒可以强烈地结合携带负电荷的材料例如细胞表面和粘膜等，其中与带负电荷的细胞膜的相互作用，有助于打开紧密连接。
β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒中，壳聚糖的分子量可为5～62KDa，例如为10Kda，脱乙酰度可大于95％。这样的壳聚糖具有在稀酸条件下有较好的溶解性的优点。
β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒中，β-细辛醚与壳聚糖的质量比可为1：9～3：7，在该比例范围时，可以得到粒径较小且得率较高的纳米粒。
β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒还可以含有三聚磷酸钠、戊二醛、卡拉胶、京尼平等，在形成壳聚糖纳米粒的过程中充当交联剂的作用。
本发明的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒可作为药物载体，在纳米粒中、尤其是纳米粒内部可载有药物。所载的药物可根据需要选择，可以是治疗性药物、诊断性药物等，例如可为细胞膜深红色荧光探针(DiR)、黄芪甲苷(ASI)等。
例如，本发明的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒可包载化疗药、大分子药物和中药有效成分用于治疗脑胶质瘤，提高药物的疗效；还可应用于包载小分子DNA，通过调节微环境来抑制脑部肿瘤的生长；亦可用于包载乙酰胆碱酯酶抑制剂改善阿尔茨海默氏病引起神经元退化和认知功能损伤；包载治疗帕金森的临床一线药物改善其症状；以及包载黄芪甲苷进入血脑屏障，提高药物的疗效用于治疗多发性硬化症，改善神经损伤的严重程度等。
如图1所示，本发明的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒通过鼻腔递送可显著提高脑部渗透率。
以下，说明本发明一实施方式的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的制备方法。
本发明一实施方式中，采用离子交联法制得β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒。
首先，制备β-细辛醚修饰的壳聚糖。一个示例中，通过化学合成法将β-细辛醚修饰到壳聚糖上。具体方法可如下所述。
先将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与β-细辛醚反应得到中间体D。一个示例中，将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌加入到1,4-二氧六环中，搅拌下溶解，浓度为0.15～0.2g/mL。并且，将β-细辛醚溶于1,4-二氧六环中，浓度为0.4～0.5g/mL，然后滴入到2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌溶液，保持温度不高于30℃。2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与β-细辛醚的摩尔比可为2：1左右。将上述混合溶液在室温下反应，可通过常规监测反应的方法例如LC-MS检测原料消失。反应完毕后，将反应液进行后处理，得到中间体D。后处理例如可包括过滤、浓缩、洗涤、干燥。一个示例中，将反应液过滤，滤液浓缩，加入甲基叔丁基醚，10％氢氧化钠水溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，干燥后得到粗品；然后用甲醇打浆，干燥得到中间体D。
将壳聚糖与中间体D反应一段时间。一个示例中，将壳聚糖的乙酸溶液与中间体D的甲醇溶液混合反应一段时间。壳聚糖的乙酸溶液可通过将壳聚糖加入到5～7％冰醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解而得，其浓度为可10～12mg/mL。中间体D的甲醇溶液的浓度可为28～30mg/mL。壳聚糖与中间体D的投料质量比可为0.25：1～1：1。壳聚糖与中间体D反应的反应温度可为20～60℃，反应时间可为1～24小时。然后，加入乙酰氧基硼氢化钠继续反应。乙酰氧基硼氢化钠与中间体D的投料质量比可为0.8：1～3：1。反应温度可为20～60℃，反应时间可为1～30小时。反应完毕后，将反应液进行后处理，得到β-细辛醚修饰的壳聚糖。后处理例如可包括过滤、洗涤、干燥等。一个示例中，将反应液冷至室温，过滤，产品呈果冻状，水洗，甲醇洗涤，滤干后旋蒸干燥，产品呈深红色固体，依次用水，甲醇，二氯甲烷打浆，至无中间体D残留，干燥后得产品(深红色固体)。
然后，制备β-细辛醚修饰的壳聚糖溶液A。一个示例中，将β-细辛醚修饰的壳聚糖溶于乙酸溶液中，配成溶液A。乙酸溶液的浓度可为1～3％，例如为2％。溶液A中，β-细辛醚修饰的壳聚糖的浓度可为0.5～2mg/mL，例如为1mg/mL。
并且，制备壳聚糖溶液B。一个示例中，将壳聚糖溶于乙酸溶液中，配成溶液B。乙酸溶液的浓度可为1～3％，例如为2％。溶液B中，壳聚糖的浓度可为0.5～2mg/mL，例如为1mg/mL。
并且，制备交联剂溶液C。一个示例中，将交联剂溶于溶剂(例如水、乙醇等)中，配成浓度为0.5～2mg/mL，例如为1mg/mL的溶液C。交联剂例如为三聚磷酸钠、戊二醛、京尼平等。
然后，制备纳米粒溶液。一个示例中，在搅拌条件下将溶液A与溶液B混合，调节溶液的pH值为4～6(例如pH值为5)，继续在搅拌条件下加入溶液C，持续搅拌一段时间(例如20～30分钟)，即得纳米粒溶液。如果要制得载药的纳米粒，则可以在将溶液A与溶液B混合并调节pH后，加入药物溶液，并加入溶液C。
溶液A与溶液B的混合体积比可为1：9～3：7。溶液A中的β-细辛醚修饰的壳聚糖与溶液B中的壳聚糖的质量比可为1：9～3：7。溶液A与溶液B的总体积和溶液C体积比可为1：2～1：6。壳聚糖的总质量与交联剂的质量比可为1：2～1：6。
制得的β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒粒径在150nm以内，呈高斯分布，粒径分布较窄；表面携带正电荷，电位在10～40mV左右。β-细辛醚的修饰不仅显著提高了鼻粘膜细胞对纳米粒的摄取，也提高了纳米粒的脑部渗透率。
对制得的纳米粒溶液进行固液分离，得到纳米粒。固液分离方法例如为离心等。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
以下实施例和对比例中，β-细辛醚购自上海奈启生物科技有限公司、批号为MD008-101-02，壳聚糖的分子量为10KDa、脱乙酰度大于95％、购自浙江金壳药业有限公司、批号为M-TK-1701001，三聚磷酸钠购自国药集团化学试剂有限公司、型号为20041261，DiR购自上海翊圣生物科技有限公司、型号为40757ES25。
实施例1：β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的制备
a)通过化学合成法将β-细辛醚修饰到壳聚糖上。具体地，1)将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(43.6g，192mmoL)加入到1,4-二氧六环(250mL)中，搅拌下溶解；2)室温下将β-细辛醚(20g，96.2mmoL)溶于1,4-二氧六环(50mL)中，然后滴入反应液，保持温度不高于30℃；3)加毕，室温下搅拌30min后，LC-MS检测原料消失；4)将反应液过滤，滤液浓缩，加入甲基叔丁基醚，10％氢氧化钠水溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，干燥后得到粗品；5)用10mL甲醇打浆，干燥得到1.8g产品，中间体D；6)将300mg壳聚糖加入到水中(30mL)，搅拌下加入227mg冰醋酸，搅拌至完全溶解；7)室温下再加入中间体D(840mg)的甲醇溶液(30mL)，加热到45℃，反应液溶清，呈浅黄色，搅拌1h后，反应液呈粘稠果冻状，补加30mL甲醇，机械搅拌下45℃反应过夜，加入乙酰氧基硼氢化钠(801mg)，有气体放出，加毕，45℃反应8h，补加乙酰氧基硼氢化钠(801mg)，45℃反应过夜；8)反应液冷至室温，过滤，产品呈果冻状，水洗，甲醇洗涤，滤干后至单口瓶中旋蒸干燥，产品呈深红色固体，依次用水，甲醇，二氯甲烷打浆，至无中间体D残留，干燥后得产品(500mg，深红色固体)。
b)在搅拌条件下将2.5mL的1mg/mL的β-细辛醚修饰的壳聚糖溶液(溶剂为2％乙酸溶液)与22.5mL的1mg/mL的壳聚糖溶液(溶剂为2％乙酸溶液)混合，并使用NaOH溶液调节溶液的pH值为5。
c)在搅拌条件下加入0.3mL的1mg/mL DiR乙醇溶液。
d)继续在搅拌条件下加入10mL的1mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，持续搅拌30min后于11000rpm离心40min后弃上清，即得β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒(简称βAsa-DiR-NP1)。
其中，所制备的纳米粒的粒径为115.6±6.8nm，电位为16.54±1.21mV，粒径呈高斯分布且分布较窄，如图2所示。
实施例2：β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的制备
a)通过化学合成法将β-细辛醚修饰到壳聚糖上。具体地，1)将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(43.6g，192mmoL)加入到1,4-二氧六环(250mL)中，搅拌下溶解；2)室温下将β-细辛醚(20g，96.2mmoL)溶于1,4-二氧六环(50mL)中，然后滴入反应液，保持温度不高于30℃；3)加毕，室温下搅拌30min后，LC-MS检测原料消失；4)将反应液过滤，滤液浓缩，加入甲基叔丁基醚，10％氢氧化钠水溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，干燥后得到粗品；5)用10mL甲醇打浆，干燥得到1.8g产品，中间体D；6)将300mg壳聚糖加入到水中(30mL)，搅拌下加入227mg冰醋酸，搅拌至完全溶解；7)室温下再加入中间体D(840mg)的甲醇溶液(30mL)，加热到45℃，反应液溶清，呈浅黄色，搅拌1h后，反应液呈粘稠果冻状，补加30mL甲醇，机械搅拌下45℃反应过夜，加入乙酰氧基硼氢化钠(801mg)，有气体放出，加毕，45℃反应8h，补加乙酰氧基硼氢化钠(801mg)，45℃反应过夜；8)反应液冷至室温，过滤，产品呈果冻状，水洗，甲醇洗涤，滤干后至单口瓶中旋蒸干燥，产品呈深红色固体，依次用水，甲醇，二氯甲烷打浆，至无中间体D残留，干燥后得产品(500mg，深红色固体)。
b)在搅拌条件下将2.5mL的1mg/mL的β-细辛醚修饰的壳聚糖溶液(溶剂为2％乙酸溶液)与22.5mL的1mg/mL的壳聚糖溶液(溶剂为2％乙酸溶液)混合，并使用NaOH溶液调节溶液的pH值为5。
c)在搅拌条件下加入0.3mL的1mg/mL DiR乙醇溶液。
d)继续在搅拌条件下加入8mL的1mg/mL的卡拉胶水溶液，持续搅拌30min后于11000rpm离心40min后弃上清，即得β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒(简称βAsa-DiR-NP2)。
其中，所制备的纳米粒的粒径为125±5.6nm，电位为35.82±2.32mV，粒径呈高斯分布且分布较窄，如图3所示。
对比例：壳聚糖纳米粒的制备
a)使用NaOH溶液调节25mL的1mg/mL的壳聚糖溶液(溶剂为2％乙酸溶液)的pH值为5。
b)在搅拌条件下加入0.3mL的1mg/mL DiR乙醇溶液。
c)继续在搅拌条件下加入10mL的1mg/mL三聚磷酸钠水溶液，持续搅拌30min后于11000rpm离心40min后弃上清，即得壳聚糖纳米粒(简称DiR-NP)。
效果实施例1：鼻粘膜细胞对纳米粒的摄取
1)鼻粘膜细胞对纳米粒摄取的定性观察
将培养的鼻粘膜细胞(16HBE细胞)，按照2×105个/mL的密度接种至24孔板中，培养一天，吸去培养液。加入HBSS平衡液(37℃，1mL/孔)预先孵育15min，弃去HBSS平衡液后，加入用HBSS稀释后的DiR-NP和βAsa-DiR-NP，考察16HBE细胞对不同纳米粒的摄取情况。给药后，在既定时间点用4℃PBS终止细胞对药物的摄取，并用1mLPBS将细胞清洗3遍。然后加入1mL的4％多聚甲醛溶液孵育10min，用于固定细胞。10min后吸去4％多聚甲醛溶液，并用PBS溶液清洗10遍后加入500μL(100ng/mL)的荧光染色剂DAPI，染色10min后吸去染色剂并用PBS清洗3遍，然后于显微镜下利用高内涵成像分析系统观察16HBE细胞对不同纳米粒的摄取情况。16HBE细胞对βAsa-DiR-NP1的摄取情况如图4中的A所示，16HBE细胞对βAsa-DiR-NP2的摄取情况如图4中的B所示，16HBE细胞对DiR-NP的摄取情况如图4中的C所示。可以看出，16HBE细胞对βAsa-DiR-NP1和βAsa-DiR-NP2的摄取多于DiR-NP。
2)鼻粘膜细胞对纳米粒摄取的定量测定
将培养的16HBE细胞，按照2×105个/mL的密度接种至24孔板中，培养一天，吸去培养液。加入HBSS平衡液(37℃，1mL/孔)预先孵育15min，弃去HBSS平衡液后，加入用HBSS稀释后的DiR-NP和βAsa-DiR-NP，考察16HBE细胞对不同纳米粒的摄取情况。给药后，在既定时间点用4℃PBS终止细胞对药物的摄取，并用1mL PBS将细胞清洗3遍。取400μL 1％Triton-X100裂解液处理细胞，将裂解液置于-20℃储存待测。取100μL裂解液加入900μL乙醇，破坏纳米粒然后10000rpm离心10min，取上清用VarioskanFlash全波长扫描式多功能读数仪测定DiR浓度；另取100μL裂解液在10000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液经BCA试剂盒用酶标仪测定细胞的蛋白浓度。以“摄取指数(IU，Uptake index)”作为评价指标，即药物浓度与细胞蛋白浓度的比值，表示单位浓度细胞蛋白中所含有的药物浓度。如果摄取指数大，则表明细胞对药物的摄取量高。结果发现当DiR浓度为10μg/mL时，16HBE细胞对βAsa-DiR-NP组的摄取显著高于DiR-NP组(参见图4中的D)，说明β-细辛醚的修饰促进了16HBE细胞对纳米粒的摄取。
效果实施例2：载DiR纳米粒在小鼠脑内的分布
小鼠被随机分为3组(n＝4)：
第一组：空白对照组；
第二组：DiR-NP组，DiR的浓度为0.3μg/μL，每只给药70μL；
第三组：βAsa-DiR-NP组，DiR的浓度为0.3μg/μL，每只给药70μL。
给药24h后，颈椎脱臼法处死小鼠，收集脑，生理盐水清洗2遍后置于小动物活体成像仪采集图像。称取小鼠脑组织重量，加入其重量的三倍体积超纯水，功率约200W，冰浴下间隔超声，超5s，停2s匀浆，超声五次。从中取500μL匀浆液，加入十倍体积乙醇，涡旋混匀1min后，于10000rpm离心10min，取全部上清，使用氮吹仪在37℃的水浴下挥干溶剂。然后用200μL乙醇复溶，10000rpm离心10min，取上清，测定DiR的浓度。结果显示β-细辛醚修饰组脑内DiR信号强度显著高于未修饰组(参见图5)。

Claims (4)

1.一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述 β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒包括壳聚糖纳米粒、以及修饰在壳聚糖纳米粒上的β-细辛醚，所述制备方法包括如下步骤：
a) 将β-细辛醚修饰到壳聚糖上；
b) 将β-细辛醚修饰的壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到溶液A；
c) 将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到溶液B；
d) 在搅拌条件下将溶液A与溶液B混合，调节溶液的pH值为4～6，并加入交联剂溶液，搅拌一段时间，得到β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒；步骤a)中，将β-细辛醚修饰到壳聚糖上包括以下步骤：
1）将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与β-细辛醚反应得到中间体D；
2）将壳聚糖与中间体D反应一段时间后，加入乙酰氧基硼氢化钠反应一段时间，得到β-细辛醚修饰的壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，溶液A中，β-细辛醚修饰的壳聚糖的浓度为0.5～2.0mg/mL，溶液B中，壳聚糖的浓度为0.5～2.0mg/mL，溶液A与溶液B的混合体积比为1：9～3：7。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中，在将溶液A与溶液B混合后，还加入药物溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自三聚磷酸钠、戊二醛、卡拉胶、京尼平中的至少一种。
CN201910004569.8A 2019-01-03 2019-01-03 一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用 Active CN111388681B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910004569.8A CN111388681B (zh) 2019-01-03 2019-01-03 一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910004569.8A CN111388681B (zh) 2019-01-03 2019-01-03 一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111388681A CN111388681A (zh) 2020-07-10
CN111388681B true CN111388681B (zh) 2022-09-09

Family

ID=71414992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910004569.8A Active CN111388681B (zh) 2019-01-03 2019-01-03 一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111388681B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101011354A (zh) * 2005-06-07 2007-08-08 中国医学科学院药物研究所 细辛脑亚微乳制剂及其制备方法
KR20070105502A (ko) * 2006-04-26 2007-10-31 김도영 캡슐형 구강청결제 및 그 제조방법
CN107029247A (zh) * 2016-04-25 2017-08-11 上海中医药大学 脑部引经药修饰的脑靶向纳米给药系统及其制备方法
CN107050218A (zh) * 2016-12-27 2017-08-18 苏州天茹生物科技有限公司 一种利用短肽超分子水凝胶复合石菖蒲中有效成分的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101011354A (zh) * 2005-06-07 2007-08-08 中国医学科学院药物研究所 细辛脑亚微乳制剂及其制备方法
KR20070105502A (ko) * 2006-04-26 2007-10-31 김도영 캡슐형 구강청결제 및 그 제조방법
CN107029247A (zh) * 2016-04-25 2017-08-11 上海中医药大学 脑部引经药修饰的脑靶向纳米给药系统及其制备方法
CN107050218A (zh) * 2016-12-27 2017-08-18 苏州天茹生物科技有限公司 一种利用短肽超分子水凝胶复合石菖蒲中有效成分的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
壳聚糖纳米粒载体转染Cu-SOD 对缺血再灌注脑组织的作用;贾栋 等;《神经疾病与精神卫生》;20071231;第7卷(第2期);第134-137页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111388681A (zh) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3305310B1 (en) Oncolytic virus formulation and preparation method thereof
CN109837306A (zh) 包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用
JPH08500589A (ja) アストラガルス ポリサッカライド免疫調節剤
CN102260356B (zh) 一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途
CN112080277A (zh) 一种氮掺杂碳量子点及其制备方法和用途
CN111388681B (zh) 一种β-细辛醚修饰的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
CN110897998B (zh) 一种同时载有疏水性药物和亲水性药物的基因工程多肽纳米水凝胶及其制备方法
CN111166882B (zh) 酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料及其制备方法与应用
CN111249235B (zh) 一种载有正电聚合物/miR-195复合物的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用
CN111529695A (zh) 一种环糊精可溶性ace2及其制备方法和应用
CN105879048A (zh) 基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法
CN108619528A (zh) 一种环糊精-介孔硅多功能纳米载药颗粒
CN110898034B (zh) 一种负载抗肿瘤活性药物的血清白蛋白纳米粒及其制备
CN109674763B (zh) 一种单胺氧化酶响应的红景天苷/介孔硅纳米级脑靶向控释系统
CN107349417A (zh) 一种治疗食管鳞癌的ecm复合物以及其在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途
CN113304122A (zh) 一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用
CN101791410B (zh) 抗感染药物-多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用
CN114177302B (zh) 一种用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物及其制备方法与应用
US20220402763A1 (en) Graphene oxide (go)-based composite nanoparticle drug delivery system and preparation method thereof
CN112316142B (zh) 一种半导体聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用
CN111012759B (zh) 负载ngf的花状钌纳米粒子及制备方法以及其在阿尔兹海默症中的应用
CN115025054B (zh) 一种以乳铁蛋白为载体的纳米组合物的制备方法
CN110755634B (zh) 一种抗肿瘤纳米药物及其制备方法
CN108354896B (zh) 一种雷替曲塞水凝胶及其制备方法和用途
Yan et al. Fabrication of Doxorubicin Nanoparticles Mediated by Folic Acid and Its Effect on the Wnt/β-Catenin Signaling to Improve Precancerous Lesions in Gastric Cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant