CN111387193A - 一种抗原用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗原配体用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途，属于农业生物技术领域。所述的抗原配体为从植物野菊(Chrysanthemum indicum)中提取得到，所述野菊多糖抗原配体的分子特征为：重均分子量为3500Da‑10000Da，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6种单糖组成，主链有(1→3)吡喃葡萄糖残基、(1→3)吡喃半乳糖残基，且具有特定的指纹信息。本发明提供了野菊多糖作为抗原分子模拟白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.，S.rolfsii)的PAMPs，与寄主植物特异性受体结合，激发寄主植物的PAMP‑triggered immunity(PTI)，使植物产生广谱的抗病性，预防病害的新用途。本发明的抗原配体辅以常用的药用赋形剂，可制成水剂、乳剂、粉剂等剂型。

Description

一种抗原用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途

技术领域

本发明涉及一种野菊多糖的新用途，本发明涉及在农业与中药材生产中施用野菊多糖作为抗原配体与白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.，S.rolfsii)寄主植物特异性受体结合预防植物病害的新用途，属于农业生物技术领域。

背景技术

白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.，S.rolfsii)引起的花生、黄麻、烟草、茄科、豆科作物、部分根茎类中药材和果树等多种植物的的白绢病，危害根、茎基或果实，产生褐色水渍状病斑，逐渐腐烂，环境潮湿时病部产生大量白色菌丝层，后形成圆形或不规则形菌核，是世界上破坏性最强的植物病原物之一，引起的白绢病是世界性重要病害，每年造成巨大经济损失，仅仅就花生而言中国每年由于病害原因导致花生的产量下降高达30％，严重影响到中国花生的生产和出口，是农业生产上迫切需要解决的重要问题。

近年来，植物免疫系统得到了越来越深入的研究和认识，植物自身存在保护机制，可有效的抵抗病源菌的侵害。纵观研究者发现的众多物理、化学或生物的诱导子均能够激活植物免疫从而产生诱导抗性，尽管在几十种植物的上百种病害上得到了证实，但是考虑到环境兼容、对植物伤害、成本等问题能得到实际应用的种类不多。糖类诱导子因生物来源，功效确切，还能够调节植物的生长发育，环境友好，不仅相关研究工作与日俱增，而且充分利用糖类诱导抗病性也正在成为植物病害可持续治理的一项重要内容。然而，植物对于糖类配体的识别具有结构专一性这使得糖类免疫诱抗剂的应用一直存在局限性，不同形态的分子配体，与受体激酶特异性结合，激发活性传递信号，从而承担调控植物生长、发育、抗病和共生的功能，激发植物免疫的配体也就是抗原的选择是个难点，S.rolfsii是一种腐生型真菌，寄主范围广，已知危害100多科中的200多种植物，致病机理复杂，至今还未找到抗原和有效的防治方法。与发明人曾经提供的“野菊多糖在农业上作为抗病诱导子的应用(授权公告号CN 103783091 B)”的中是针对植物土传病害的防控不同的是：本发明提供的野菊多糖可作为S.rolfsii寄主的抗原配体，与寄主的特异性抗体结合激发植物的PAMP-triggered immunity(PTI)，广谱性的防控作物病害，解决S.rolfsii寄主植物病害防控的难题。本发明还进一步提供了具有抗原特性的野菊多糖的指纹图谱特征(图1)。

本技术提供一种配体，来源于野菊(Chrysanthemum indicum)且具有由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6种单糖组成和特定指纹特征的多糖，其作为抗原分子激活植物先天免疫，预防S.rolfsii寄主植物各种病害。为保障作物和中药材生产的安全提供全新的植物病害绿色防控手段，具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是野菊多糖作为植物来源的配体预防由白绢小菌核菌可致病的植物各种病害的新用途，该野菊多糖可以作为植物来源的疫苗有效预防多种植物的病害，是一种有效的作物菌核病的绿色防治手段。

野菊多糖作为植物疫苗预防植物小菌核病的应用，其特征在于：野菊多糖作为抗原分子，模拟白绢小菌核菌的(Sclerotium rolfsii Sacc.，S.rolfsii)病害真菌的PAMPs分子，能够诱导植物针对S.rolfsii的防御应答(PAMP-triggered immunity，PTI)，进而抵抗病原菌的浸染，降低病情指数，所述抗原配体的这种防控效果具有广谱性，可用于S.rolfsii寄主植物的多种病害的预防。

优选地，所述由白绢小菌核菌引起的植物病害，是指寄主植物对S.rolfsii易感而引发的根腐病、白绢病等。

优选地，所述抗原配体的这种防控效果具有广谱性，是抗原配体模拟白绢小菌核菌的PAMP激发S.rolfsii寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity)，防控此类植物的多种病害，更优选地是指此类植物的土传病害。

以上野菊多糖辅以常用的药用赋形剂，制成水剂、颗粒剂、粉剂等剂型，喷施、灌根或土壤处理，用于花生、烟草、黄麻、茄科、豆科作物和果树等S.rolfsii寄主植物的绿色防控，实现化学农药的减量。

野菊多糖作为作为植物疫苗预防由小菌核菌可致病的植物各种病害的新用途其特征在于，所述的野菊多糖为野菊(Chrysanthemum indicum)经过提取、纯化得到的多糖，且其粗多糖具有特殊的指纹信息见图1，这种特有的指纹信息为在野菊多糖HPLC指纹图谱中共有特征峰有15个，它们的峰面积总和占总峰面积的90％以上，它们的相对保留时间RT(以半乳糖醛酸峰为参照)的相对标准偏差RSD均小于2.0％(图1)，即：

1号峰平均RT为0.51，RSD为1.34％；

2号峰平均RT为0.58，RSD为0.86％；

3号峰平均RT为0.77，RSD为1.47％；

4号峰平均RT为0.86，RSD为0.68％；

5号峰平均RT为1.15，RSD为0.90％；

6号峰平均RT为1.20，RSD为0.88％；

7号峰平均RT为1.473，RSD为0.48％；

8号峰平均RT为1.70，RSD为1.06％；

9号峰平均RT为1.81，RSD为1.30％；

10号峰平均RT为1.97，RSD为1.62％；

11号峰平均RT为2.06，RSD为1.91％；

12号峰平均RT为2.11，RSD为0.81％；

13号峰平均RT为2.22，RSD为0.42％；

14号峰平均RT为2.44，RSD为1.13％；

15号峰平均RT为2.65，RSD为1.92％；

其中2号指纹峰为果糖(Fru)、5号指纹峰为甘露糖(Man)、7号指纹峰为鼠李糖(Rha)、8号指纹峰为葡萄糖醛酸(GluA)、9号峰为半乳糖醛酸(GalA)、10号峰为葡萄糖(Glul)、11号峰为半乳糖(Gal)、12号峰为木糖(Xyl)、13号峰为阿拉伯糖(Ara)。这些糖均依据与野菊多糖样品分析同样的色谱条件下测定的单糖混合标准溶液的PMP衍生物的保留时间对照定性，该单糖混合标准溶液中各种单糖浓度均准确配制为2mg/mL左右。

野菊多糖标准指纹图谱中超过总峰面积10％的为6号峰、9号峰半乳糖醛酸(GalA)、12号峰木糖(Xyl)和13号峰阿拉伯糖(Ara)，超过总峰面积5％的指纹峰有4个，分别为：4号峰、5号峰甘露糖(Man)、8号峰(GluA)和15号峰。9号峰为参照峰：相对保留时间1，相对峰面积1。

野菊多糖作为植物来源的抗原配体预防由白绢小菌核菌可致病的植物各种病害的新用途，其特征在于野菊多糖的制备方法包括以下几个步骤：

a、采集野菊低温烘干，粉碎，过筛；

b、采用通用的水提醇沉法制备得到野菊粗多糖。

c、在野菊粗多糖中加入蒸馏水使溶解，并加入与蒸馏水同体积的混合溶剂三氯乙酸∶正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加一定浓度的NnOH溶液至中性，蒸干，再重复上述步骤多次，除去糖蛋白，再脱色得纯野菊多糖(CIP)纯度为90-99％。

野菊粗多糖也可以通过市场途径购买得到，应具有所述野菊多糖HPLC的如图1的指纹特征，并与标准指纹图比较相似度大于40％以上，优选地70％，更优选地90％。纯度可以是1％-99％，优选纯度为80％，更优选地99％，可据实际情况配制成适用浓度。

野菊多糖作为植物来源的抗原配体预防由白绢小菌核菌可致病的植物各种病害的新用途，其特征还在于其分子特征为：单糖组成分别为果糖，甘露糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖组合的杂多糖，主链有(1→3)吡喃葡萄糖残基、(1→3)吡喃半乳糖残基；所述多糖重均分子量范围为1500Da-100000Da，优选为2000-10000Da，更优选为3500-9000Da。

优选地，所述多糖的红外谱图具有多糖的特征峰，3342或3325cm^-1处附近有O-H的伸缩振动吸收峰，在2953cm^-1、2924cm^-1和2854cm^-1有C-H的伸缩振动峰，1737处cm^-1附近有C＝O的伸缩振动的吸收峰，1122和1095处有较大的吸收峰，说明是由C-O和糖环伸缩振动信号，仍更优选地，所述多糖的红外谱图的主要伸缩振动吸收峰与图2所示的红外谱图中的基本一致。

在本发明中，上述多糖可以进行修饰以在不影响其目标应用效果的情况下进一步改善其性能或拓宽其用途。所述修饰可以为本领域中常规的对于多糖的修饰方法，例如通过荧光标记反应、醚化反应、酯化反应等进行。所述多糖可以根据应用目标进一步修改为上述多糖的荧光标记产物、羧甲基化产物、羟甲基化产物、羟丙基化产物、乙二醇化产物、丙二醇化产物、聚乙二醇化产物等。应当理解的是，上述经修饰的多糖也应当在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果是：寻找特异性的配体或抗原一直是植物免疫手段防控病害的关键技术，至今已有大量适合不同植物、不同病害的抗原分子被发现，但是针对S.rolfsii这种寄主范围广，致病机理复杂的腐生型真菌，至今还未找到抗原和有效的防治方法。本发明提供一种全新的具有广泛应用前景的病害免疫分子调控手段。对促进作物病害的绿色防控，具有极其重要的意义。

附图说明

图1.野菊多糖的粗多糖单糖构成的标准HPLC指纹图谱

图2.野菊多糖红外光谱图

图3.不同活性组分的SR真菌诱导子对白术病情指数的影响(a、b、c、d和e分别是SR-0、SR-1、SR-2、SR-3和SR-4与BCK、CK的对比图)

图4.不同组分的野菊多糖对白术病情的影响[CIP-0、CIP-1，CIP-2，CIP-3，CIP-4与CK₁(接菌组)、CK₂(未接菌)的对比图(注：与CK1对照组比较，*表示显著差(P＜0.05)，**表示极显著差(P＜0.01)]

图5.CIP-3与SR-1碱化白术细胞悬浮液的胞外pH-time变化的动力曲线

图6.CIP诱导子对花生、太子参、烟草、玄参病情指数的影响(CK-清水对照组；CIP-喷施诱导子组；CIP+S-喷施诱导子后接菌组；S-接种S.rolfsii菌组)

图7.21批野菊粗多糖指纹图谱

以下实验例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1野菊多糖标准指纹图谱的建立

1.1仪器Waters高效液相系统(2695 Separations Module，2996 PhotodiodeArray Detector，Empower色谱工作站)

1.2试剂及样品

单糖标准品：果糖(Fru，≥99％)、甘露糖(Man，≥99％)、鼠李糖(Rha，≥99％)、葡萄糖醛酸(GluA，≥99％)、半乳糖醛酸(GalA，≥99％)、葡萄糖(Glul，≥99％)、半乳糖(Gal，≥99％)、木糖(Xyl，≥99％)、阿拉伯糖(Ara，≥99％)均购置于上海源业生物技术公司(中国，上海)；衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮(PMP)，纯度99％(美国Acros Organics公司)；三氟乙酸(TFA)，纯度不低于99％(国药集团化学试剂有限公司)。乙腈，HPLC级(美国Tedia公司)；水，超纯级；其它试剂均为分析纯。

野菊13个批号分别采自河南、安徽、湖南、湖北、贵州、山西、浙江及河北等不同产地。

1.3野菊多糖的提取：

称取野菊粉末采用水提醇沉法得到的粗多糖，60℃烘箱干燥后，备用；

1.4供试溶液的制备：野菊多糖水溶液经三氟乙酸TFA的部分水解，水解产物的PMP衍生化反应制备成供试品溶液，0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析；

1.5.PMP衍生化物的反相高效液相色谱的指纹分析：

反相高效液相色谱分析条件为：色谱柱：Sun fire-C18色谱柱(250mm×4.6mmi.d.，5um，Water，USA).；流动相：(pH 6.0)的0.1M磷酸盐缓冲液∶乙腈 体积比为(81∶19，v/v)柱温：20～35℃；检测波长：245～254nm；流速：0.8～1mL，进样体积：10～50μL；在此条件下进样分析，得到野菊多糖的高效液相色谱指纹图谱。在此条件下分别进样分析单糖混合标样的PMP衍生化产物，得到混合标样的色谱图和野菊多糖的色谱指纹图谱。与9种单糖PMP衍生化样品的HPLC谱图比对，明确各对应峰的特征，以半乳糖醛酸为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性野菊多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积；

1.6.标准指纹图谱的建立：

通过对不同产地的野菊样品(10个以上产地)中多糖成分水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱图进行比较，确定共有特征峰，并将色谱数据导入指纹图谱专用软件得到由其共有特征峰构成的野菊多糖的标准色谱指纹图谱(见图1)，野菊多糖的标准指纹图谱如图1所示。

1号峰平均RT为0.51，RSD为1.34％；

2号峰平均RT为0.58，RSD为0.86％；

3号峰平均RT为0.77，RSD为1.47％；

4号峰平均RT为0.86，RSD为0.68％；

5号峰平均RT为1.15，RSD为0.90％；

6号峰平均RT为1.20，RSD为0.88％；

7号峰平均RT为1.473，RSD为0.48％；

8号峰平均RT为1.70，RSD为1.06％；

9号峰平均RT为1.81，RSD为1.30％；

10号峰平均RT为1.97，RSD为1.62％；

11号峰平均RT为2.06，RSD为1.91％；

12号峰平均RT为2.11，RSD为0.81％；

13号峰平均RT为2.22，RSD为0.42％；

14号峰平均RT为2.44，RSD为1.13％；

15号峰平均RT为2.65，RSD为1.92％；

其中2号峰为果糖，5号峰为甘露糖，7号峰为鼠李糖，8号葡萄糖醛酸，9号峰为半乳糖醛酸，10号峰为葡萄糖，11号峰为半乳糖，12号峰为木糖，13号峰为阿拉伯糖。

实验例2.野菊多糖活性组分与S.rolfsii的PAMPs组分的确定

2.1 S.rolfsii的病原菌相关分子(PAMPs)的制备

2.1.1材料：罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.S.rolfsii)(中国菌种保藏中心ATCC 15205)

2.1.2试验方法

取PDA培养基进行S.rolfsii接菌。接菌后在26℃培养箱中培养约5天即得菌丝体。将具有活性的菌丝体放于高压灭菌锅中灭菌20min之后，用过量的丙酮去毒素。取失活、去毒素后的干净菌丝体匀浆破碎即得SR多糖，经苯酚-硫酸法测定其纯度为99.94％可用于进一步的实验。

2.1.3 SR多糖的离子交换分离

采用DEAE-52离子交换层析分法，分别离依次用蒸馏水，0.05mol/L NaCl，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L NaCl，0.4mol/L NaCl溶液进行洗脱，合并洗脱曲线中的主要峰，干燥得到SR-0、SR-1、SR-2、SR-3、SR-4，采用硫酸苯酚法测定纯度均大于98％。

2.1.4 SRs活性组分的评价：

①白术幼苗的培养

挑选饱满的白术种子用温水浸泡24h后播种于处理过的土壤平整的花盆内(45cm*15cm*10cm)，在此期间进行合理的管理，温室大棚温度始终控制在25℃，湿度在60％。经过4个月的培养成为实验所用材料。

②菌丝悬浮液的制备

S.rolfsii菌种接种到PDA培养基上，25℃培养一周后将菌丝刮下，用去离子水冲洗并制成悬浮液，用于接菌处理。

③真菌诱导子诱导处理

分别取SR-0，SR-1，SR-2，SR-3，SR-4组分，配成2mg/L的真菌诱导子溶液。对每组白术盆栽进行如下处理，见表1

表1对不同白术叶片的处理方法

Table1.The handing methods of different leaves

注：“+”表示喷施不同浓度的真菌诱导子提取液，”-”表示不进行各处理

④SRs对白术病情指数的影响

观察白术的发病情况，根据病情分级，分别计算不同处理组的病情指数，病情统计7次。按以下公式计算病情指数：

0级：无病斑，植株健康；

1级：0.1％-25％的叶片出现病斑；

2级：25.1％-50％的叶片出现病斑；

3级：50.1％-75％的叶片出现病斑；

4级：75.1％以上的叶片出现病斑。

病情指数与相对防效按以下公式计算：

病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)

2.1.4结果与结论

①不同活性组分的SRs真菌诱导子对白术病情指数的影响

通过调查白术的病情指数，比较接菌情况下真菌诱导子活性片段的诱导活性，实验结果见图3，看出经过SR-0、SR-1处理的白术病情指数虽与BCK组无明显差异但明显低于CK组，并且SR-1组的病情指数极显著的低于CK组。其余各组诱导没有抑制病情的发生，甚至对病情的发生有促进作用。盆栽实验表明SR-0和SR-1是SR多糖中诱导白术获得抗性的主要成分。将SR-1明确为真菌诱导子的活性组分为PAMPs分子。

2.2野菊多糖诱导子活性组分(CIPs)的制备及评价

2.2.1在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75-80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸∶正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20-25min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加一定浓度的NaOH溶液至中性，蒸干，再重复上述步骤多次，除去糖蛋白，得纯野菊多糖(CIP)。

2.2.2野菊多糖的分离纯化

用去离子水和预处理好的离子交换树脂混合，称取适量的CIP并用去离子水溶解并定容成10mg/mL的多糖溶液，然后采用湿法装柱，然后依次用蒸馏水，0.05mol/L NaCl，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L NaCl，0.4mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速控制在1.0mL/min，每管收集5mL，并用苯酚-硫酸法测定洗脱液的吸光值，以管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线；合并洗脱曲线中的主要峰，并透析48h除掉NaCl，干燥得到CIP-1，CIP-2，CIP-3，CIP-4，透析后袋外的组分为CIP-0(MW≤3500)，各组分再经凝胶层析纯化后，纯度分析均为99.99％，备用。

2.2.3活性评价

以白术为受试对象，对在致病菌S.rolfsii胁迫下白术病情指数的变化进行考核。通过统计白术不同程度的发病情况和结合公式得到了CIPs对白术病情影响的结果。由图4.可知，经过SPSS数据统计分析发现，在白术接受诱导子诱导后的前21天中的病情统计中，对照组和多糖处理组没有表现出明显的差异。而在诱导后的第28天，CIP-2和CIP-3处理组与CK₁(接菌组)对照组相比有显著差异，此时CK₁的病情指数高达35.69％，而CIP-2和CIP-3的病情仅9.67％和10.25％，此时CK₂(未接菌)为25.01％。在诱导子诱导后的第35天，CIP-3处理组病情指数与极显著的低于CK₁。盆栽实验表明CIP-3是野菊多糖中诱导白术获得抗性的主要活性成分。

实验例3野菊多糖活性组分CIP-3与S.rolfsii的PAMPs分子SR-1结构比较

3.1单糖组成：

分别取CIP-3和SR-1各5mg样品加入3mL 2mol/L的三氟乙酸(TFA)于棕色瓶中，105℃水解8h。水解完成后取出，减压蒸干后再加入3mL甲醇蒸干，重复三次除去TFA后用水定容到5mL。然后取出0.5mL定容好的样品，加入0.5mL 0.3mol/L的NaOH和0.5mL PMP试剂，70℃水浴1h，完成后冷却，

加入0.5mL 0.3mol/L的HCl和1mL的三氯甲烷，涡旋离心，弃去下层溶液，重新加入三氯甲烷重复3次除去PMP，最终将水解的糖液定容至5mL，使用HPLC分析单糖组成。

3.2甲基化反应：

(1)甲基化反应

①多糖溶解。分别称取CIP-3和SR-1各10mg已经用P₂O₅真空干燥过的多糖样品，然后将其溶解于6mL无水DMSO中，磁力搅拌至DMSO中无絮状物为止。最后所得澄清的糖样DMSO溶液。

②然后加入干燥的研磨过的NaOH粉末10mg，室温搅拌30min使其溶解。

③然后改用冰浴，待反应瓶中的溶液完全冰冻后，在氮气保护下逐滴加入4mL碘甲烷(约30min)。搅拌下反应体系解冻，并逐渐澄清，直至成为黄色溶液。

④恢复至室温后，继续磁力搅拌反应30min，然后用蒸馏水透析24h，减压浓缩后冷冻干燥，得到甲基化多糖衍生物。

⑤重复此方法3次可得完全甲基化多糖。然后将甲基化多糖进行IR分析，观察IR谱中羟基峰是否完全消失。

(2)水解

加入0.5mL 2mol/L的TFA，120℃反应2h。冷却至室温，减压蒸干。加入0.1mL甲醇，减压蒸干。

(3)还原

加入0.5mL新配的10mg/mL NaBD4，室温反应2h，期间振荡数次。逐滴加入4mol/L乙酸中和，pH试纸检测。加入0.1mL甲醇，减压蒸干，重复2次。

(4)乙酰化

加入0.5mL新配制的吡啶/乙酸酐(1∶1)，120℃反应30min。冷却至室温，氮气吹干。加入0.5mL甲醇，减压蒸干。加入2mL二氯甲烷，旋涡振荡，离心，取上清液，减压浓缩后进行GC/MS分析。

(5)GC/MS分析

GC/MS条件：色谱柱为EC-1 column(30m×0.25mm)，起始温度140℃，以8℃/min升温至250℃。载气为氦气，EI源，离子化电势70eV，进样量1μL。

将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后水解释放出甲基化单糖，再经NaBH₄还原成糖醇，进而乙酰化水解生成的羟基，得到甲基化的糖醇乙酰衍生物，经GC或者HPLC分析生成的各种单糖的甲基衍生物，根据甲基的数目和位置，判断单糖的组成和连接位置。

3.4部分酸水解：

①样品制备：取CIP-3和SR-1各20mg，分别加入3mL 0.1mol/L的TFA，在100℃水解1h，减压蒸干，加入适量水溶解，透析2d。将透析袋内外的水溶液浓缩冻干，并分别测定透析袋外与透析袋内样品的单糖组成。从这些多糖的主链重复性结构片段、糖醛酸链片段推测多糖链结构特点。

3.5红外光谱分析：

①样品制备：取CIP-3和SR-1各约2mg，分别用溴化钾压片后进行红外光谱分析，而对于甲基化多糖，则采用石蜡油制片法进行红外光谱分析。

3.6结果分析：凝胶渗透色谱与光散射仪(GPCMALLS)联用技术测定CIP-3的均重分子量为8000Da，集合以上对CIP-3和SR-1的各项试验结果分析，推测CIP-3配体分子特征为：重均分子量为8000Da，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6种单糖组成，主链有(1→3)吡喃葡萄糖残基、(1→3)吡喃半乳糖残基；SR-1主要由木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖和半乳糖4种单糖组成，主链有(1→3)吡喃葡萄糖残基、(1→3)吡喃半乳糖残基。推断：野菊多糖在折叠形成空间结构的同时形成了与S.rolfsii的PAMPs分子具有相似的结构保守域。

实验例4盆栽试验考察CIP对S.rolfsii寄主植物的诱抗活性

4.1受试植物

通过文献调研分别选取易感S.rolfsii所致的白绢病植物花生、太子参、烟草、玄参植物种苗，按常规栽培法，进行CIP诱抗病情指数的评价。CIP由实验例2获得。

4.2菌丝悬浮液的制备

分别取供试菌株罗氏白绢小菌核菌于PDA培养基上，25℃培养一周后分别将菌丝刮下，用去离子水冲洗并制成S.rolfsii悬浮液(S)。最后用去离子水将收集到的菌丝配成合适浓度后喷施在受试植物幼苗上。

4.3实验方法

分别取以上植物种苗，随机分组份，每种植物分别盆栽种植，每盆种植十二个块茎或种苗，在发芽长出叶片之后喷施CIP(0.2mg/mL)三次后，每种植物设置喷施CIP不接菌组(CIP)、喷施CIP后接菌组(CIP+S)组、只接菌组(S)、清水组(CK)。并记录出现病斑程度，并按以下方法计算病情指数。

0级：无病斑，植株健康；

1级：0.1％-25％的叶片出现病斑；

2级：25.1％-50％的叶片出现病斑；

3级：50.1％-75％的叶片出现病斑；

4级：75.1％以上的叶片出现病斑。

病情指数与相对防效按以下公式计算：

病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)

4.4实验结果见图6，结果显示，野菊多糖喷施后花生、太子参、烟草、玄参对S.rolfsii的侵染均呈现出良好的抗性，病情指数均小于S对照组。

实验例5分析CIP-3与SR-1白术细胞膜结合位点的竞争关系

5.1白术的细胞悬液

选择白术优良单株健壮、幼嫩的腋芽，进行外植体的表面灭菌，先使用75％的酒精浸泡50s，后使用去离子水冲洗4～5次，然后用0.1％的氯化汞溶液浸泡60s，再用去离子水冲洗3～4次，最后用5％的次氯酸钠溶液浸泡10min，期间不断搅拌，再去离子水冲洗4次，倒出多余的去离子水，将腋芽接种于初代培养基中，培养环境光照时间10～20h/d、光照度1500～2 000lx。接种6～7d后观察腋芽生长情况。培养20d待苗长到3～5cm左右后，于超净工作台上将初代培养苗从培养瓶中取出，置于无菌培养皿中。用高压灭菌后的医用镊子、医用剪刀修剪腋芽后转接到愈伤组织诱导培养基中，培养环境光照时间10～20h/d，光照度1500～2 000lx，接种30d后，将诱导出的愈伤组织(松软的胚型愈伤组织)。取1～5g愈伤组织，用剪碎后接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中进行振荡培养。具体培养条件：培养温度为24～26℃，每天光照12小时，光照强度为1500～2500lx，摇床4h/天。经过2～3次继代可初步形成稳定的悬浮细胞系。

5.2培养基碱化试验(MAR)：将形成的稳定的细胞悬浮液再次继代培养后，取两份份细胞悬浮液分别添加SR-1和CIP-3制成诱导子结合饱和溶液，再依次加入其他不同的诱导子，温育，采用半微量pH电极测定胞外pH变化，绘制胞外pH-time变化的动力曲线，考察CIP-3与SR-1对碱化反应的拮抗作用。

5.3结果：如图5A所示，制备两份细胞悬浮液，预处理先把2mg/L SR-1加入细胞悬浮液中，直到ΔpH变为0，再往细胞悬浮液中分别加入CIP-3(2mg/mL)或SR-1(2mg/L)。图5B，制备两份细胞悬浮液，预处理先把2mg/L CIP-3加入细胞悬浮液中，直到ΔpH变为0，再分别往该细胞悬浮液中加入所述的CIP-3或SR-1溶液。以上两种条件下预处理完再加入诱导子，细胞悬浮液的ΔpH值在0上下波动，两种细胞悬浮液pH均无明显改变。

5.4结论：CIP-3和SR-1可以引起S.rolfsii小菌核菌的寄主(白术)氧爆发引起细胞液碱化，而且CIP-3与SR-1在白术细胞膜上具有相似的结合位点。

实验例6分析CIP-3与SR-1对西红花细胞膜结合位点的竞争关系

取西红花细胞悬浮液依实验例5法MAR试验，结果显示：西红花细胞悬浮液分别加入不同激发子CIP-3、SR-1，pH并均无明显改变。说明CIP-3与SR-1在非寄主植物西红花细胞膜上没有结合位点。进一步说明CIP不能诱导S.rolfsii非寄主植物的PTI。

以下实施例均能实现以上实验例1-5的效果

实施例1野菊多糖指纹图谱特征

1.1材料与方法

1.2供试材料

收集了21个不同的主要野菊花的产地，见表2。

表2.产地信息

1.3主要仪器和试剂

乙腈为色谱纯，Tedia Company；

氢氧化钠、盐酸，磷酸二氢钾，三氟乙酸均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GluA)标准品(纯度≥99％)，上海源叶生物科技有限公司。

1.4实验方法：同实验例1

①野菊多糖的提取及纯化

分别称取不同产地的干燥的野菊花1000g，按实验1的方法其提取及纯化，得到粗多糖备用。

②野菊多糖的水解衍生化：

③精密度考察

精密称定50mg的S1，按上述方法制备供试品溶液，重复进样5次，记录色谱峰信息计算相对保留时间及相对峰面积求标准差。

④重复性考察

分别称取5份50mg S1样品，按上述方法制备供试品溶液，分别进样，记录色谱峰信息计算相对保留时间及相对峰面积求标准差。

⑤稳定性考察

称取50mg的S1样品，按上述方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，24h进样，考察样品在24h内的稳定性。

⑥数据分析及处理

将得到的色谱峰信息导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004年A版(国家药典委员会开发)进行相似性分析，并用SPSS对共有峰的相对峰面积信息进行主成分分析和系统聚类分析。

1.5结果与分析

①不同产地野菊多糖提取结果分析

实验表明不同产地的野菊花其多糖提取率不同，其总糖含量也不同。以葡萄糖含量计，在21批野菊中以干燥品计算总糖含量最高的是S1(河南信阳)，为37.74％，最低的是S4(山西)，为10.96％，其余地区的总糖含量在30％左右。由此看出不同产地的野菊花其中的多糖含量是有差异的，这可能与地理位置的气候有关。

②野菊多糖指纹图谱的建立

21批野菊多糖样品经同一制备方法制备后，在同一色谱条件进行高效液相分析，得21批野菊多糖的色谱图7。将21批样品的色谱图信息导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，设时间窗宽度为0.2，经多点校正生成共有模式的对照指纹图谱(图1)。指纹图谱显示在250nm下，指纹图谱15个色谱峰中，有6个共有峰，其中2号峰为果糖，5号峰为甘露糖，7号峰为鼠李糖，8号葡萄糖醛酸，9号峰为半乳糖醛酸，10号峰为葡萄糖，11号峰为半乳糖，12号峰为木糖，13号峰为阿拉伯糖。在这几个峰中半乳糖醛酸的含量最高。在色谱图中还有1，3，4，6，14，15号峰未能鉴别出来。

1.6相似度分析

样品与对照谱图(图1)之间的相似度通过夹角余弦法计算，结果表明相似度小于0.7的为S7，S10，S6，S11，S21，S19。相似度在0.7到0.85之间的有S4和S17。其余的产地的相似度都在0.85以上。

实施例2野菊多糖诱导子的制备

称取野菊粉末适量加水(w/v，1∶10)，90℃提取3h，反复提取两次，合并滤液，静置后，真空抽滤后收集滤液，浓缩成浸膏状。野菊浸膏冷却到室温后，加入4-5倍体积的95％乙醇醇沉多糖，12h后抽滤得野菊粗多糖。野菊粗多糖加2倍体积的水溶解后再醇沉，抽滤后得到的粗多糖，按实验例1提供的分析方法做HPLC指纹分析并与标准指纹图谱比较相似度大于90％。60℃烘箱干燥后，备用。

在野菊粗多糖中加入75-80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸∶正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20-25min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加一定浓度的NaOH至中性，蒸干，再重复上述步骤多次，除去糖蛋白，再用H₂O₂去色素，得纯野菊多糖(CIP)。

实施例3水剂的制备与应用

取实施例2中提取得到的野菊多糖粗多糖，加水配制成100g/L的水剂，摇匀，密封储藏。取花生(寄主植物)种苗栽入大田后采用土壤处理施用野菊多糖水剂，常规管理，整个生育期不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低花生的病情指数，对花生的多种病害都有防控作用并具有显著的壮苗作用。

实施例4：粉剂的制备与应用

按实施例2法制备得到野菊粗多糖(纯度为30％)，按实验例1提供的分析方法做HPLC指纹分析并与标准指纹图谱比较相似度大于80％，干燥，按照野菊粗多糖∶硅藻土质量比为1∶10的比例加入干燥的硅藻土搅拌混匀，备用。临用时，将该诱导剂按照每亩2kg的量加入普通有机肥中混匀，在番茄(S.rolfsii寄主植物)小苗载入大田时，作为基肥施入土壤，常规栽培管理，整个生育期不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低番茄的病情指数，对番茄的多种病害都有防控作用。

实施例5：水剂的制备与应用

取市场销售的野菊粗多糖(纯度30％)，按实验例1的方法鉴别，与标准指纹图谱比较相似度达到98％，加水配制成10g/L的水剂，摇匀，密封储藏。取茄子种苗栽入大田，土壤喷洒处理(20L/亩)后常规管理，整个生育期不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低茄子的病情指数，并具有显著的壮苗作用。

实施例6：水剂的制备与应用

取市场销售的野菊粗多糖(纯度40％)，按实验例1的方法鉴别，与标准指纹图谱比较相似度达到88％，加水配制成10g/L的水剂，摇匀，密封储藏。取茄子(S.rolfsii寄主植物)种苗栽入大田，土壤喷洒处理(15L/亩)后常规管理，整个生育期不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低茄子的病情指数，并具有显著的壮苗作用。

实施例7：水剂的制备与应用

取市场销售的野菊粗多糖，含量为60％，，按实验例1的方法鉴别，与标准指纹图谱比较相似度达到89％，加水配制成10g/L的水剂，摇匀，密封储藏。取辣椒(S.rolfsii寄主植物)种苗栽入大田，土壤喷洒处理(10L/亩)后常规管理，整个生育期不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低辣椒的病情指数，对辣椒的多种病害都有防控作用并具有显著的壮苗作用。

实施例8；粉剂的制备与应用

称取野菊粉末适量加水(w/v，1∶10)，90℃提取3h，反复提取两次，合并滤液，静置后，真空抽滤后收集滤液，浓缩成浸膏状。野菊浸膏冷却到室温后，加入4-5倍体积的95％乙醇醇沉多糖，12h后抽滤、低温干燥得野菊粗多糖，备用。硫酸-苯酚法测定多糖含量为39％，按实验例1的方法鉴别，与标准指纹图谱比较相似度达到92％。取西瓜(S.rolfsii寄主植物)种苗栽入大田，取上述粗多糖溶解按150g/亩进行土壤喷洒处理，不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低西瓜的病情指数，对西瓜的多种病害都有防控作用。并具有显著的壮苗作用。

实施例9：粉剂的制备与应用

称取野菊粉末适量加水(w/v，1∶10)，90℃提取3h，反复提取两次，合并滤液，静置后，真空抽滤后收集滤液，浓缩成浸膏状。野菊浸膏冷却到室温后，加入4-5倍体积的95％乙醇醇沉多糖，12h后抽滤，低温干燥得野菊粗多糖粉，备用。硫酸-苯酚法测定多糖含量为28％，按按实验例1的方法鉴别，与标准指纹图谱比较相似度达到92％。取太子参(S.rolfsii寄主植物)种苗栽入大田，取上述粗多糖溶解按215g/亩进行土壤喷洒处理，整个生育期不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低太子参的病情指数，对太子参的多种病害都有防控作用，并具有显著的壮苗作用。

实施例10：细胞碱化试验

取上述典型的S.rolfsii寄主植物花生、番茄、茄子、辣子、玄参、按实验例5的方法制备细胞悬浮液，并进行细胞碱化试验、结果均能实现实验例5的效果。CIP-3和SR-1可以引起受试S.rolfsii寄主植物氧爆发，引起细胞液碱化。再分别取S.rolfsii非寄主植物白芍、麦冬、玉米按实验例5方法制备细胞悬浮液，并分别进行细胞碱化试验、结果均未能实现实验例5的效果，而和实验例6的效果一样，加CIP-3和SR-1入相应的细胞悬浮液未观察到细胞液碱化现象。实验结果显示，野菊多糖喷施后可以引发S.rolfsii寄主植物的PTI，而对S.rolfsii非寄主植物的先天免疫影响不显著。

Claims (6)

1.一种抗原配体用于由白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.，S.rolfsii)引起的植物病害防控的用途，其特征在于：所述的抗原配体为野菊多糖，是采用菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum)的根茎或花为原料提取得到，野菊多糖作为抗原分子与白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.，S.rolfsii)的寄主植物特异性受体结合，激活寄主免疫预防病害浸染。所述抗原的这种防控效果对S.rolfsii寄主植物具有广谱性，可用于S.rolfsii寄主植物的多种病害的预防。

2.一种抗原配体用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途，其特征在于，野菊多糖作为抗原配体模拟白绢小菌核菌的PAMPs，激发寄主植物的PT1(PAMP-triggeredimmunity)。

3.一种抗原配体用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途，其特征在于，所述野菊多糖抗原配体的分子特征为：相对分子量为3500Da-10000Da，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6种单糖组成，主链有(1→3)吡喃葡萄糖残基、(1→3)吡喃半乳糖残基。

4.一种抗原配体用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途，其特征在于，所述抗原配体的野菊粗多糖还具有如下的指纹特征：在野菊多糖HPLC指纹图谱中共有特征峰有15个，它们的峰面积总和占总峰面积的90％以上，它们的相对保留时间RT(以半乳糖醛酸峰为参照)的相对标准偏差RSD均小于2.0％，即：

1号峰平均RT为0.51，RSD为1.34％；

2号峰平均RT为0.58，RSD为0.86％；

3号峰平均RT为0.77，RSD为1.47％；

4号峰平均RT为0.86，RSD为0.68％；

5号峰平均RT为1.15，RSD为0.90％；

6号峰平均RT为1.20，RSD为0.88％；

7号峰平均RT为1.473，RSD为0.48％；

8号峰平均RT为1.70，RSD为1.06％；

9号峰平均RT为1.81，RSD为1.30％；

10号峰平均RT为1.97，RSD为1.62％；

11号峰平均RT为2.06，RSD为1.91％；

12号峰平均RT为2.11，RSD为0.81％；

13号峰平均RT为2.22，RSD为0.42％；

14号峰平均RT为2.44，RSD为1.13％；

15号峰平均RT为2.65，RSD为1.92％；

其中2号指纹峰为果糖(Fru)、5号指纹峰为甘露糖(Man)、7号指纹峰为鼠李糖(Rha)、8号指纹峰为葡萄糖醛酸(GluA)、9号峰为半乳糖醛酸(GalA)、10号峰为葡萄糖(Glul)、11号峰为半乳糖(Gal)、12号峰为木糖(Xyl)、13号峰为阿拉伯糖(Ara)。

5.如权利要求1所述的一种抗原用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途，其特征在于，通过喷施、土壤处理处理或添加到其他肥料中作为追肥或基肥施用，用于促进不同苗期S.rolfsii寄主植物的生长和壮苗的形成。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种抗原用于由白绢小菌核菌引起的植物病害防控的用途，其特征在于，野菊多糖辅以常用的农药助剂制成水剂、粉剂、颗粒剂和水乳剂，用于S.rolfsii寄主植物的病害防控。

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