CN111363838A - 一种血孢子虫定量检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测血孢子虫感染强度的引物、包含该引物的产品，及其在制备检测血孢子虫是否存在及含量的产品或制备诊断血孢子虫感染导致的疾病的产品中的应用。本发明还公开了血孢子虫定量检测的方法，采用该方法检测血孢子虫感染强度，无需标准品做对照，步骤简单，且其结果灵敏度高、稳定性强。

Description

一种血孢子虫定量检测的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测血孢子虫感染强度的引物以及包含该引物的产品，还涉及一种血孢子虫定量检测的方法，包括微滴化处理，然后采用特异性引物PCR扩增所述的微滴。

背景技术

血孢子虫是原生生物孢子纲的一个重要类群，寄生生存，虫体呈圆形、环形、梨形等。鸟类易感染血孢子虫，主要通过蚊蚋等昆虫传播，危害极大，死亡率很高。因此及时有效的检测出其感染的强度，至关重要。

目前对鸟类血孢子虫的定量研究技术主要有镜检法和实时荧光定量PCR方法。镜检法即在显微镜下目视检测血涂片，并对被感染的红细胞计数。血涂片的制作方法简单且花费少，可根据不同时期的形态学特征识别虫体。但存在耗时多、对血涂片质量和检测人员技术水平要求高和无法精确鉴别近缘种等缺点(参见参考文献：Valkiūnas,G.,et al.,Acomparative analysis of microscopy and PCR-based detection methods for bloodparasites,J.Parasitol,94,1395-1401,2008)。此外，镜检法灵敏度较低，往往检测不到处于慢性感染期的血孢子虫(参见参考文献：Ishtiaq,F.,et al.,Estimating prevalenceof avian haemosporidians in natural populations:a comparative study onscreening protocols.Parasites Vectors 10,127,2017)。实时荧光定量PCR(qPCR)方法与镜检法相比，具有特异性强、用时更短、效率更高等特点，目前已得到广泛的应用(参见参考文献：Asghar,M.,et al.,Are chronic avian haemosporidian infections costly inwild birds,J.Avian Biol.42,530-537,2011)。但需依赖标准品才能对样品进行定量，同时受扩增效率的影响较大，不同反应间的检测结果一致性不足，影响了感染强度检测的准确性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种通用性的绝对定量检测血孢子虫感染强度的方法，其包括微滴化处理，利用油包水技术将其“分割”为数万个纳米级的微滴，各为一个独立的反应体系，然后采用特异性引物进行PCR扩增，摆脱了标准品的依赖，同时灵敏度高、稳定性强，尤其对于慢性感染期的血孢子虫也可以明确的检测出来。具体的：

本发明提供了一种检测血孢子虫感染强度的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种检测血孢子虫感染强度的产品，所述的产品中包含如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。

优选的，所述的产品中还包含微滴生成油。

进一步优选的，所述的产品还包含探针。

进一步优选的，所述的产品还包括96孔板、微滴生成卡或铝箔热封膜等等。

进一步优选的，所述的产品中还包括DNA提取所用试剂、测定DNA浓度的试剂、PCR扩增所需试剂等。

本发明进一步提供了一种如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物或包含所述的引物的产品在制备检测血孢子虫是否存在及含量的产品中的应用。

本发明进一步提供了一种如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物或包含所述的引物的产品在制备诊断血孢子虫感染导致的疾病的产品中的应用。

优选的，所述的血孢子虫包括疟原虫属、血液变形虫属或住白细胞原虫属，血孢子虫感染导致的疾病包括但不限于包括疟疾、血液变形虫病或住白细胞原虫病(优选为沙氏住白细胞原虫病或卡氏住白细胞原虫病)等等。

本发明还提供了一种血孢子虫定量检测的方法，包括配制包含SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的引物的PCR反应体系，生成微滴，PCR扩增生成的微滴。

优选的，所述的生成微滴包括将配制的PCR反应体系与微滴生成油混合的步骤。利用油包水技术将其“分割”为数万个纳米级的微滴，各为一个独立的PCR反应体系。扩增完成后，逐个对每个微滴进行荧光信号读取检测。

进一步优选的，所述的方法还包括通过荧光信号强度的差异，设定阈值线的步骤。其中，所述的阈值线为根据含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴呈现出的荧光信号差异设定。在本发明的一个具体实施方式中，以阴性微滴荧光幅度的最高点为界设定阈值线。

进一步优选的，利用泊松分布原理及阳性微滴的比例推算模板中的目标基因的拷贝数。

本发明所述的血孢子虫定量检测的方法，并非疾病的诊断方法。理由在于，并非只要血孢子虫感染个体，就会患病，患病只是一种可能性，该方法更多的是提供了一种血孢子虫感染强度的绝对定量，且灵敏度高、特异性强的方法，因此该方法不是疾病的诊断方法。

本发明也提供了一种血孢子虫感染导致的疾病的诊断方法，包括配制包含SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物的PCR反应体系，生成微滴，PCR扩增生成的微滴。

优选的，所述的生成微滴包括将配制的PCR反应体系与微滴生成油混合的步骤。

进一步优选的，所述的方法还包括通过荧光信号强度的差异，设定阈值线的步骤。

采用本发明所述的血孢子虫定量检测的方法，可以对血孢子虫不同类群(包括疟原虫属、血液变形虫属和住白细胞原虫属)感染强度进行通用性绝对定量，摆脱对标准品的依赖。同时检测的灵敏度高，最低可至0.0007％(镜检法：0.01％，巢式PCR：0.05％)，即一百万个红细胞中仅7个被感染时仍能有效检测出，显著降低假阴性样品的检出比例。而且，稳定性强，对相同样品的检测重复性高达95.5±0.08(％)。

本发明所述的“血孢子虫”包括但不限于疟原虫属(Plasmodium)、血液变形虫属(Parahaemoproteus)和住白细胞原虫属(Leucocytozoon)等中的一种、两种或三种以上的组合。

本发明所述的“产品”可以为试剂盒、芯片、引物或探针等。

本发明所述的“微滴生成油”可以为将PCR反应体系分别生成若干微滴的任何油，且不影响PCR的正常进行。优选的，所述的微滴生成油包括但不限于氟化油、矿物油、烷烃和/或表面活性剂等等。其中，所述的烷烃包括但不限于12-16烷中的一种或两种以上的混合，优选为5号白油(饱和的环烷烃与链烷烃混合物)。所述的表面活性剂包括但不限于例如Tween80、L548、NP-10、EM90或TritonX-100。在本发明的一个具体实施方式中，所述的微滴生成油可以直接从厂家购买。

本发明所述的“检测”包括确定样品中是否存在某物质或者样品中某物质的含量，相对含量。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“检测”代表确定样品中是否包含血孢子虫，或血孢子虫感染细胞的个数或比例。

本发明所述的“样品”包括但不限于血液或血细胞。

本发明所述的“感染强度”表示血液或血细胞样品中，被血孢子虫感染的细胞个数除以总细胞个数的值，或者表示单个细胞中血孢子虫的个数或浓度。

本发明所述的“诊断”表示以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。

本发明检测的血孢子虫或待检测的样品来自鸟类，包括但不限于游禽、涉禽、攀禽、陆禽、猛禽或鸣禽。优选的，所述的鸟类包括今鸟亚纲。进一步优选的，所述的鸟类包括但不限于潜鸟目、

目、鹱形目、鹈形目、鹳形目、红鹳目、雁形目、隼形目、鸡形目、麝雉目、鹤形目、鸻形目、沙鸡目、鸽形目、鹦形目、鹃形目、鸮形目、夜鹰目、雨燕目、蜂鸟目、鼠鸟目、咬鹃目、佛法僧目、戴胜目、犀鸟目、啄木鸟目、雀形目、鸵鸟目、美洲鸵鸟目、鹤鸵目、无翼目(几维目)、

形目或企鹅目等等。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：应用qPCR和实施例1所述方法对鸟类血液样品中血孢子虫定量检测的结果对比图，其中x轴和y轴坐标均已转换为对数值。

图2：应用实施例1所述的方法对梯度稀释的样品进行定量检测结果，其中，x轴为初始样品的稀释倍数，y轴为检测到的血孢子虫感染强度(Qp/Qh)，均已转换为对数值，左图为高感染强度的检测结果，右图为中等感染强度的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中采用的仪器及试剂的来源：

EvaGreen Super-mix、微滴生成油、八联管、QX200TM微滴生成仪、QX200TM微滴读取仪、C1000 Touch TM：Bio-Rad，US。

DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司，北京。

Qubit 3.0荧光光度计：Invitrogen，US。

Qubit dsDNA BR Assay Kit试剂盒：Invitrogen，US。

实施例1

对100个鸟类血液样品(其中11个感染疟原虫，38个感染血液变形虫，13个感染住白细胞原虫，其余为未感染血孢子虫鸟类血液样品)进行了血孢子虫感染强度的定量检测，具体步骤如下：

1、选择位于鸟类血孢子虫线粒体基因组较为保守的核糖体RNA(rRNA)基因片段设计引物，扩增的目的片段长度为131bp。正向引物的名称为：3524F，序列为：5’-AGGCAAAGAAAATGACCGG–3’(SEQ ID NO：1)；反向引物的名称为3655R，序列为：5’-ATGGCGAGAAGGGAAGTGTG-3’(SEQ ID NO：2)。制备并验证正确的引物，储存备用。

2、利用DNA提取试剂盒的厂家说明书提取血液样品中的DNA，并用Qubit 3.0荧光光度计，采用Qubit dsDNA BR Assay Kit试剂盒法测量DNA浓度。根据鸟类基因组大小，换算出待检测样品中鸟类红细胞的数量(Qh)。

3、取2μL DNA作为反应模板，加入正反向引物各0.5μL，EvaGreen Super-mix 10μL，再加入足量双蒸水补齐至总体积为20μL。将配置好的体系转移至盛有70μL微滴生成油的八联管中，再QX200TM微滴生成仪中充分混合后，将整个反应体系转移至96孔板，在C1000Touch TM仪器中进行扩增反应。

其中，反应程序设置为94℃热启动5分钟，35轮循环扩增反应(94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸40秒)，最后在72℃保持10分钟。所有样品均重复三次，且每轮反应包含至少3个阳性对照和3个阴性对照。

4、反应完成后将96孔板至于QX200TM微滴读取仪上读取反应结果，根据QuantaSoft TM软件的分析结果得出样品中血孢子虫的数量(Qp)。鸟类血孢子虫的感染强度即为Qp/Qh。

检测结果显示，采用本实施例所述的方法检测血孢子虫感染强度，其阳性检出率达到86％，检测的鸟类血孢子虫感染强度范围为0.0007％-30％，对相同样品检测的可重复性高达95.5±0.08％。即该方法阳性检出率高、灵敏度高、稳定性强。

实施例2

采用镜检法、qPCR及实施例1所述的方法分别对100个鸟类样品(其中11个感染疟原虫，38个感染血液变形虫，13个感染住白细胞原虫，其余为未感染血孢子虫样品)进行了血孢子虫感染强度的定量检测。

1、检测步骤

镜检法：取鸟类血液样品、涂片、对血涂片进行固定、染色后在100倍物镜(油镜)下对感染和未感染的红细胞进行计数，检测血孢子虫的感染强度(感染的红细胞/红细胞总数)。

基因组DNA提取：利用DNA提取试剂盒的厂家说明书提取血液样品中的DNA，并用Qubit 3.0荧光光度计采用Qubit dsDNA BR Assay Kit试剂盒法测量DNA浓度。根据鸟类基因组大小，换算出待检测样品中鸟类红细胞的数量(Qh)。

实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)：提取血液样品DNA，配制反应体系(模板2μLDNA，正反向引物各0.8μL，TB-Green Premix buffer 10μL，Rox染料0.4μL，双蒸水6μL)进行荧光定量PCR扩增。扩增程序为：95℃热启动3分钟，随后进行40轮循环扩增反应(95℃变性5秒，52℃退火34秒，72℃延伸30秒)，随即在60℃-95℃间进行溶解曲线监测。每个样品均制备两个重复，结果取其平均值。每轮反应中包含至少两个标准品(gs，已知血孢子虫数量的样品)和两个空白对照。反应完成后，观察扩增曲线以获取每个样品的Ct值，检查溶解曲线以排除非特异性扩增导致的假阳性结果。待检测样品(x)中血孢子虫数量为Qx＝Qgs*2^(Ctgs-Ctx)。

实施例1所述的方法检测血孢子虫的感染强度步骤同实施例1的描述。

2、检测结果

在待检测样品中，实施例1所述的方法和qPCR方法的阳性检出率分别达到86％和87％，而镜检法检测出血孢子虫的比例不足30％。表明实施例1所述的方法检测血孢子虫感染强度具有更高的灵敏度。且采用实施例1所述的方法定量检测的鸟类血孢子虫感染强度范围为0.0007％-30％，对相同样品检测的可重复性高达95.5±0.08％，显著高于qPCR法的90.2±2％(参见图1)，表明该方法的稳定性最高。尤其，对于血孢子虫感染强度较低的样品，实施例1采用的检测方法，其检出率也高于qPCR，表明具有更高的灵敏度。

实施例3

进一步检测本发明所述血孢子虫定量检测的方法的灵敏度，分别对两个样品(高感染强度和中等感染强度)依次进行了4倍、16倍、64倍、256倍和1024倍的梯度稀释，并对稀释后的样品用实施例1所述的方法进行血孢子虫的绝对定量检测。

检测结果与稀释倍数吻合，且重复样品的误差较小(参见图2)。表明本方法对于不同感染强度样品的灵敏度和稳定性都非常高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

SEQUENCELISTING

<110>北京师范大学

<120>一种血孢子虫定量检测的方法

<130>1

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列(ArtificialSequence)

<400>1

aggcaaagaaaatgaccgg19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(ArtificialSequence)

<400>2

atggcgagaagggaagtgtg20

Claims (10)

1.一种检测血孢子虫感染强度的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的血孢子虫选自疟原虫属、血液变形虫属和住白细胞原虫属中的一种、两种或三种的组合。

3.一种检测血孢子虫感染强度的产品，其特征在于，所述的产品中包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述的产品中还包含微滴生成油。

5.权利要求1所述的引物或权利要求3所述的产品在制备检测血孢子虫是否存在及含量的产品中的应用。

6.权利要求1所述的引物或权利要求3所述的产品在制备诊断血孢子虫感染导致的疾病的产品中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的血孢子虫包括疟原虫属、血液变形虫属或住白细胞原虫属；血孢子虫感染导致的疾病包括疟疾、血液变形虫病或住白细胞原虫病。

8.一种血孢子虫定量检测的方法，其特征在于，包括配制包含SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的引物的PCR反应体系，生成微滴，PCR扩增生成的微滴。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的生成微滴包括将配制的PCR反应体系与微滴生成油混合的步骤。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括通过荧光信号强度的差异，设定阈值线的步骤。

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