CN111363778A - 一种测定细胞增殖速率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定细胞增殖速率的方法，包括以下步骤：步骤1)、获取细胞并将获得的细胞置于培养皿中培养；步骤2)、在培养皿中依次加入消化液、DMEM低糖培养液，消化收获细胞；步骤3)、调整细胞浓度后接种到96孔板上，然后在一段时间内按照时间先后顺序多次采用MTT法检测细胞数量；步骤4)、在酶标仪上测量各个时间点96孔板上每孔的OD570nm光密度值；步骤5)、以培养时间作为横坐标，以OD570nm光密度值作为纵坐标，用Excel软件做图，再对图“添加趋势线”和“添加公式和拟合度R2”，得到的公式的斜率作为细胞增殖速率的估测值。本发明结合MTT法、Excel软件和SPSS软件，不经能够精准测量细胞增殖速率，且能够比较多种细胞样本增殖速率是否存在显著性差异。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种测定细胞增殖速率的方法。
背景技术
细胞增长速率是细胞培养过程中的一种重要指标。如何准确测量细胞的增长速率和关键，如果测量误差较大会影响对整个细胞培养的判断。
传统测量细胞增长速率的方法为：在某一时间点上测量一组数据，再进行平行比较。传统方法虽然简单直接，但是误差很大，因为细胞增殖是一个动态过程，在增殖过程中可能有些波动，只在一个时间点上测定不能有效地反映细胞的增殖状态，更精确的测量应该在一个时间段动态考察细胞的增殖状态。
基于行业对细胞增长速率更精确的测量应该在一个时间段动态考察细胞的增殖状态的认可，相关公司也推出了诸如“细胞动态分析仪”这样的产品，但是“细胞动态分析仪”价格昂贵，所以还不普及。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定细胞增殖速率的方法，通过本发明所述方法不仅能够获得比较精确的细胞增殖速率，同时不会额外增加成本。
本发明通过下述技术方案实现：
一种测定细胞增殖速率的方法，包括以下步骤：
步骤1)、获取细胞并将获得的细胞置于培养皿中培养；
步骤2)、在培养皿中依次加入消化液、DMEM低糖培养液，消化收获细胞，并对对细胞数量计数；
步骤3)、调整细胞浓度后接种到96孔板上，然后在一段时间内按照时间先后顺序多次采用MTT法检测细胞数量；
步骤4)、在酶标仪上测量各个时间点96孔板上每孔的OD570nm光密度值；
步骤5)、以培养时间作为横坐标，以OD570nm光密度值作为纵坐标，用Excel软件做散点图，再对散点图“添加趋势线”和“添加公式和拟合度R2”，使得到的公式的斜率作为细胞增殖速率的估测值。
本发明通过在细胞依次进行培养、消化收获细胞并计数后，将细胞调整浓度后后接种到96孔板上，然后在一段时间内按照时间先后顺序多次采用MTT法检测细胞数量，即实现在一个时间段动态考察细胞在不同时间点的增殖状态的，再采用Excel软件进行拟合，避免了传统方法在一个时间点上进行平行比较导致的细胞增殖速率测量误差大的问题，通过本发明所述方法不仅能够获得比较精确的细胞增殖速率，同时不会额外增加成本。
进一步地，还包括：
步骤6)、在SPSS软件中，比较通过步骤1)-步骤5)获得的不同细胞培养的斜率是否有显著差异。
本发明结合MTT法、Excel软件和SPSS软件，不仅能够精准测量细胞增殖速率，且能够比较多种细胞样本增殖速率是否存在显著性差异。
进一步地，步骤1)中培养皿培养的条件为：
采用60mm培养皿，培养条件为37℃、5％CO2，培养基为DMEM低糖培养液。
进一步地，DMEM低糖培养基包括以下组分：
10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
进一步地，消化液包括以下组分：
0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA。
进一步地，步骤2)所述消化收获细胞的具体过程为：
吸弃培养皿中的培养液，用无菌PBS洗两次，然后加入消化液，孵育5分钟后，加入完全的DMEM低糖培养液。
进一步地，步骤3)中调整细胞浓度为10000/ml，96孔板上，接种量为每孔2000个细胞，接种体积为每孔200μl，每个实验条件做3个重复孔。
进一步地，步骤3)中所述MTT法的具体过程为：
在96孔板的每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT试剂母液，然后把96孔板置回培养箱中培养4小时，再吸弃培养孔中的液体部分，加入150μl二甲基亚砜，反复吹打以使培养孔底部沉淀的蓝色颗粒溶解。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1)、本发明在一段时间内按照时间先后顺序多次采用MTT法检测细胞数量，即实现在一个时间段动态考察细胞在不同时间点的增殖状态的，再采用Excel软件进行拟合，提高了细胞增殖速率测量的精准度。
2)、本发明结合MTT法、Excel软件和SPSS软件，不经能够精准测量细胞增殖速率，且能够比较多种细胞样本增殖速率是否存在显著性差异。
3)、本发明不增加额外的设备、试剂和耗材，方法的“性价比高”。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为男性脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)细胞增殖速率的通过Excel软件处理结果图；
图2为女性脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)细胞增殖速率的通过Excel软件处理结果图；
图3为SPSS软件的数据录入格式图；
图4为SPSS软件的数据导入操作图；
图5为SPSS软件的功能界面图；
图6为SPSS软件完成导入数据图；
图7为SPSS软件的Model界面；
图8为SPSS软件的设置Model界面操作图；
图9为SPSS软件的返回原始界面图；
图10为SPSS软件的得到最终分析结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种测定细胞增殖速率的方法，包括以下步骤：
步骤1)、获取细胞并将获得的细胞置于培养皿中培养：本实施例中细胞为男性和女性的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，都为贴壁细胞，在60mm培养皿中大量培养上述男性和女性的脐带间充质干细胞，培养条件为37℃，5％CO2，培养基为DMEM低糖培养液(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)；
步骤2)、消化收获细胞：吸弃培养皿中的培养液，用无菌PBS洗两次，而后加入1ml消化液(0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA)，孵育5分钟后，加入4ml完全的DMEM低糖培养液(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，对细胞数量计数；
步骤3)、调整细胞浓度为10000/ml，再接种到96孔板上，接种量为每孔2000个细胞，接种体积为每孔200μl，每个实验条件做3个重复孔，而后在接种后1、2、3、4、5天分别使用MTT法检测细胞数量，即是获得每个检测孔的OD570nm光密度值；
MTT法检测的具体方法如下：在96孔板的每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT试剂母液，而后把96孔板置回培养箱中培养4小时，而后吸弃培养孔中的液体部分，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，反复吹打以使培养孔底部沉淀的蓝色颗粒溶解；
步骤4)、在酶标仪上测量各个时间点96孔板上每孔的OD570nm光密度值；
步骤5)、以培养时间作为横坐标，以OD570nm光密度值作为纵坐标，用Excel软件做散点图，再对散点图“添加趋势线”和“添加公式和拟合度R2”，使得到的公式的斜率作为细胞增殖速率的估测值；
步骤6)、在SPSS软件中，比较通过步骤1)-步骤5)获得的不同细胞培养的斜率是否有显著差异：使用SPSS软件的“Analyze>General Linear Model>Univariate”功能比较上述两个斜率是否具有显著性差异(P<0.05)。
本实施例所使用的设备：Thermo Fisher公司的3111细胞培养箱，ESCO公司的A2型生物安全柜，Thermo Fisher公司的Multiskan型酶标仪。
软件：Microsoft公司的Excel软件，IBM公司的SPSS 13.0统计分析软件。
本实施例中通过细胞培养、接种和MTT测量后，获得如表1的数据：
表1细胞的MTT检测值
通过Excel软件处理的结果如图1、图2所示，图1为男性脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)细胞增殖速率的通过Excel软件处理结果图；图2为女性脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)细胞增殖速率的通过Excel软件处理结果图。
准备录入SPSS软件的数据如表2所示：
表2
表2中，其中组别中1代表男性hUC-MSCs，组别2代表女性hUC-MSCs
图3-图10为SPSS软件的数据分析过程，可见最终结果是：男性hUC-MSCs增殖速率显著大于女性hUC-MSCs。
数据分析过程如下：
1)、在SPSS中录入表2所示数据，录入格式如图3所示；
2)、进入“Analyze>General Linear Model>Univariate”功能界面，并如如4-图6导入数据；
3)、点Model按钮，进入进行设置，依次导入天数，组别和天数*组别，其中天数*组别的导入方法如下：先点选组别，再按下电脑键盘的Ctrl键，再点选天数，在导入，最后点“Continue”继续返回，具体设置如图7、图8所示；
4)、在返回的界面中，点“OK”，得到结果界面，可见：P值为9.84×10-8，说明斜率有显著差异，具体如图9-图10所示。
本发明结合MTT法、Excel软件和SPSS软件，不经能够精准测量细胞增殖速率，且能够比较多种细胞样本增殖速率是否存在显著性差异；本发明不增加额外的设备、试剂和耗材，方法的“性价比高”。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)、获取细胞并将获得的细胞置于培养皿中培养；
步骤2)、在培养皿中依次加入消化液、DMEM低糖培养液，消化收获细胞，并对对细胞数量计数；
步骤3)、调整细胞浓度后接种到96孔板上，然后在一段时间内按照时间先后顺序多次采用MTT法检测细胞数量；
步骤4)、在酶标仪上测量各个时间点96孔板上每孔的OD570nm光密度值；
步骤5)、以培养时间作为横坐标，以OD570nm光密度值作为纵坐标，用Excel软件做散点图，再对散点图“添加趋势线”和“添加公式和拟合度R2”，使得到的公式的斜率作为细胞增殖速率的估测值。
2.根据权利要求1所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，还包括：
步骤6)、在SPSS软件中，比较通过步骤1)-步骤5)获得的不同细胞培养的斜率是否有显著差异。
3.根据权利要求1所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，步骤1)中培养皿培养的条件为：
采用60mm培养皿，培养条件为37℃、5％CO2，培养基为DMEM低糖培养液。
4.根据权利要求1或3所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，所述DMEM低糖培养基包括以下组分：
10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
5.根据权利要求1所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，所述消化液包括以下组分：
0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA。
6.根据权利要求1所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，步骤2)所述消化收获细胞的具体过程为：
吸弃培养皿中的培养液，用无菌PBS洗两次，然后加入消化液，孵育5分钟后，加入完全的DMEM低糖培养液。
7.根据权利要求1所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，步骤3)中调整细胞浓度为10000/ml，96孔板上，接种量为每孔2000个细胞，接种体积为每孔200μl，每个实验条件做3个重复孔。
8.根据权利要求1所述的一种测定细胞增殖速率的方法，其特征在于，步骤3)中所述MTT法的具体过程为：
在96孔板的每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT试剂母液，然后把96孔板置回培养箱中培养4小时，再吸弃培养孔中的液体部分，加入150μl二甲基亚砜，反复吹打以使培养孔底部沉淀的蓝色颗粒溶解。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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