CN111362942B - 具有多靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

具有多靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一类具有多靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其制备方法和应用。本发明提供了一类双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐以及制药用途。同时也提供了槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗基因表达异常而引起疾病的药物中的应用。所述疾病包括肿瘤、内分泌紊乱、免疫系统疾病、遗传病或神经系统疾病等。所述的肿瘤，为肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病等。

Description

具有多靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类具有多靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症严重威胁人类生命健康，随着世界范围内逐年升高的发病率和死亡率，癌症不仅是人类致死的主要因素，更成为全球性的公共健康问题。联合用药是目前临床上癌症治疗的主要给药形式，然而，这种多组分给药形式往往存在剂量设置复杂、药物-药物相互作用、药代动力学差异和患者用药依从性低等缺陷。多靶点药物即能同时作用于疾病网络中多个靶点的单一化学分子，既可以对各靶点产生协同效应，使总效应大于单效应之和，达到最佳的治疗效果，又能简化给药方案，提高病人依从性，避免药物-药物相互作用和各组分之间因不同的吸收、分布、代谢和排泄过程所带来的问题。
FDA先后批准了多个多靶点抑制剂上市，包括索拉菲尼（sorafenib）、达沙替尼（dasatinib）、拉帕替尼（lapatinib）和培美曲塞（pemetrexed）等。比如，晚期肝癌一线治疗药物索拉菲尼，不仅能抑制VEGFR、PDGFR、FLT3和KIT受体酪氨酸激酶活性，而且还是Raf激酶的强效抑制剂。多靶点药物已成为药物发现的重要方向，研发多靶点药物将为肿瘤治疗带来新的机遇。
细胞核中染色体的基本结构单元核小体是由DNA缠绕在组蛋白八聚体上构成。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）可以催化水解组蛋白N-端赖氨酸残基上的乙酰基，使组蛋白的正电荷密度增高，增强了其与带负电荷的DNA的相互作用，染色质呈紧密卷曲的阻抑结构，进而阻碍了DNA和转录因子的结合，最终使基因转录收到抑制，其中包括抑癌基因。除了组蛋白之外，HDAC的催化底物还包括转录因子（p53、E2F和pRb）、分子伴侣（HSP90）及微管蛋白等。HDAC底物的多样性决定了其功能的复杂性，因此HDAC功能的失调会引起许多疾病，而癌症就是其中之一。HDAC与癌症的发生发展密切相关，如促进癌细胞增殖和侵袭迁移，增强癌细胞对化疗的耐药性，促进癌组织新生血管生成等。另外，研究表明组蛋白H4的过度去乙酰化是癌症发生早期的一个显著性标志。近年来，HDAC已经成为抗肿瘤研究的一个热点，抑制HDAC的活性已经成为肿瘤治疗的一个重要策略。
目前报道的HDAC抑制剂药效团基本包括如下三个部分：锌离子螯合基团（ZBG），疏水性的连接子（Linker）和蛋白表面识别区（Cap）。锌离子螯合基团可以螯合HDAC活性中心的锌离子，从而抑制酶的活性。目前已知的活性最强，应用最广的锌离子螯合基团是异羟肟酸基团，因此，本发明在优选实施方案中，优选化合物均采用异羟肟酸基团为锌离子螯合基团。
在前期研究中，发明人所在的课题组对拓扑异构酶Ⅰ（Top1）抑制剂槐定碱进行了的结构优化和构效关系研究，使其抗肿瘤活性显著提高，我们设计合成了一批槐定碱类的衍生物，已经申请的专利如下：中国专利CN201610410486.5，发明名称为“喹诺里西啶类生物碱衍生物的制备方法和用途”；中国专利CN201710319723.1，发明名称为“一类含氮芥的槐定碱类衍生物及其制备方法和用途”。研究表明，Top1和HDAC表现出抗肿瘤的协同效应，针对HDAC和协同靶点的多靶点药物研究已经成为克服肿瘤耐药性，增强抗肿瘤疗效的有效手段，目前已有数个HDAC多靶点抑制剂进入临床或临床前研究。然而将槐定碱骨架用于HDAC抑制剂的设计尚未有人报道。因此，进一步的，本发明在前期研究的基础上，根据HDAC抑制剂的药效团模型，发明人继续开展新型Top1/HDAC双靶点抑制剂的研究。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术的不足，提供了一类双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐。
本发明的第二个目的是，提供如上所述槐定碱衍生物的制药用途。
本发明的第三个目的是，提供如上所述槐定碱衍生物的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案是：
一类具有双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物，该类槐定碱衍生物具备双靶点抗肿瘤活性，双靶点为Top1和HDAC两个靶点，其特征在于，具有通式Ⅰ或Ⅱ所示的结构，以及其光学异构体，非对映异构体和消旋体混合物，其药学上可接受的盐；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：
5位碳原子立体构型为R-或者S-构型；
A为带有取代基的芳香基、带有取代基的杂芳基或带有取代基的芳酰基；
X为苯基、杂环、1至8个碳原子的烷基或杂烷基、1至8个碳原子的烷基或杂烷基与苯基连接的基团、1至8个碳原子的烷基或杂烷基与杂环连接的基团，1至8个碳原子的饱和或不饱和直链烷基或杂烷基、1至8个碳原子的烷基或杂烷基与酰胺键连接的基团、苯基与含酰胺键烷烃链连接的基团、苯基；
Z为羟基或2-氨基苯基。
本发明所用的术语和定义含义如下：
“取代基”选自以下任意一种或几种：氢原子、卤素原子、1至6个碳原子的直链烷基、3至6个碳原子的支链烷基、羟基、巯基、羧基、烯基、氰基、氰基甲基、氨基、氨基烷基（如氨甲基等）硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、甲氧基、甲硫基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、乙酰基等。
“芳香基”是指芳香族碳环基团。优选的芳环含有5至10个碳原子。
“杂芳基”是指芳族杂环，可以是单环、双环或骈环基团。优选的杂芳基包括噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，噻唑基，嘧啶基，喹啉基，苯并噻唑基，苯并呋喃基或吲哚基等。
“芳酰基”是指芳香族碳环末端连有羰基的基团，优选的芳环含有5至10个碳原子。
“杂烷基”是饱和或不饱和、含碳原子和至少一个杂原子的链，其中任意一个杂原子不相邻。杂烷基可以是直链或支链，取代或未取代的。
“药学上可接受的盐”是指式（Ⅰ）和（Ⅱ）化合物具有疗效且无毒的盐形式。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团（如羧基）上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团（如氨基）上形成的阴离子盐，这些盐有许多是本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属（如钠和钾）和碱土金属（镁和钙）的盐以及有机盐（如铵盐）。还可以通过使用相应的酸处理碱性形式的（Ⅰ）和（Ⅱ）方便的获得阴离子盐，这样酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸、盐酸等；或者有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1,2,3-丙二酸、乙磺酸、苯甲磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等因素取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。
上述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐中，所述的药学上可接受的盐不含结晶水，或含一个或一个以上结晶水。
本发明所用的“光学异构体”、“对映体”、“非对映体”、“消旋体”等定义了本发明化合物或生理上的衍生物所有可能的立体异构体的形式。除非另有说明，本发明化合物的化学命名包括所有可能的立体化学形式的混合物，所属混合物包含基本结构分子的所有非对映体和对映体，以及基本纯净的本发明化合物的单个异构体形式，即其中含有低于10%，优选低于5%，特别是低于2%，最优选低于1%的其它异构体。
式（Ⅰ）和（Ⅱ）化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。
作为本发明的一个优选实施方案，所述的槐定碱衍生物优选为：
化合物5a：N-羟基-4-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)丁酰胺；
化合物5b：N-羟基-5-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)戊酰胺；
化合物5c：N-羟基-6-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)己酰胺；
化合物5d：N-羟基-7-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)庚酰胺；
化合物5e：N-羟基-8-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)辛酰胺；
化合物8a：N-羟基-4-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酰胺；
化合物8b：N-羟基-2-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酰胺；
化合物8c：N-羟基-3-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酰胺；
化合物8d：(E)-N-羟基-3-(4-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
化合物13a：N-羟基-7-((4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基)庚酰胺；
化合物13b：N-羟基-4-(((4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基)甲基)苯甲酰胺；
化合物13c：(E)-N-羟基-3-(4-(((4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基)甲基)苯基)丙烯酰胺。
它们的结构式和核磁质谱数据如下表1所示：
表1. 本发明优选化合物的结构式和核磁质谱数据
Figure DEST_PATH_IMAGE004
本发明的第二个目的，是提供上述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐的医药用途。
本发明提供了上所述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗基因表达异常而引起疾病的药物中的应用。
上述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗基因表达异常而引起疾病的药物中的应用，所述疾病包括肿瘤、内分泌紊乱、免疫系统疾病、遗传病或神经系统疾病等。作为本发明的一个优选实施方案，所述的肿瘤，为肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病等。
本发明提供了上述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物应用中，所述的抗肿瘤药物是双靶点抗肿瘤药物，所述靶点是Top1和HDAC两靶点。
本发明提供上述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备抑制剂中的应用，所述抑制剂为：
a）Top1抑制剂、或
b）HDAC抑制剂、或
c）Top1和HDAC双靶点抑制剂。
本发明的另一方面，提供如上所述槐定碱衍生物及其药学上可接受的盐在制备药物中的应用，所述药物作为Top1和HDAC双靶点抑制剂用于治疗恶性肿瘤或与分化增殖相关疾病。体内的实验结果显示。化合物5d和5e在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型中，均表现出优秀的体内抑制活性，其中化合物5d的体内抑瘤率为77.66%，显著优于相同剂量下的阳性药SAHA对照组（40.42%），有进一步研究的价值。
本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效剂量的一种或多种如上所述的槐定碱衍生物或其药学上可接受的盐、赋形剂、载体或稀释剂。该药物组合物可以有效预防或治疗肿瘤疾病（包括肝癌、肺癌、乳腺癌等）
为实现本发明的第三个目的，本发明所采取的技术方案是：
如上所述槐定碱衍生物5a-e、8a-d和13a-c制备方法：
反应流程通法一：化合物5a-e的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE006
试剂和条件：
（a）氢化钠，N, N-二甲基甲酰胺，0°C，2小时，收率68-75%；（b）氢化钠，四氢呋喃，0°C，4小时，收率71-77%；（c）盐酸羟胺，氢氧化钾，甲醇，45°C，1小时，收率55-60%.
以吡咯-2-甲醛（1）为起始原料，先后加入氢化钠和各种碳链长度的溴代甲酯，0°C条件下反应，得到化合物2a-e；在过量氢化钠作用下，化合物2a-e与槐定碱（3）反应，得到关键中间体4a-e；最后，中间体4a-e与新鲜制备的羟胺甲醇溶液反应，减压蒸馏，残留物加水溶解后调节pH至弱酸性（5-6），得到目标产物5a-e。
反应流程通法二：化合物8a-d的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE008
试剂和条件：
（a）氢化钠，N, N-二甲基甲酰胺，0°C，2小时，收率70-75%；（b）氢化钠，四氢呋喃，0°C，5小时，收率69-78%；（c）盐酸羟胺，氢氧化钾，甲醇，45°C，1小时，收率50-70%.
以吡咯-2-甲醛（1）为起始原料，DMF为溶剂，先后加入氢化钠和各种芳香溴代甲酯，0°C条件下反应，得到化合物6a-c；在过量氢化钠作用下，化合物6a-c与槐定碱（3）反应，得到关键中间体7a-c；最后，中间体7a-c与新鲜制备的羟胺甲醇溶液充分反应，减压蒸干溶剂，残留物加水溶解后调节pH至弱酸性（5-6），得到目标产物8a-c。
反应流程通法三：化合物13a-c的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE010
试剂和条件：
（a）氢化钠，N, N-二甲基甲酰胺，0°C，2小时，收率73%；（b）三氟乙酸，二氯甲烷，室温，3小时，收率65%；（c）碳酸钾，N, N-二甲基甲酰胺，50°C，3小时，收率60-70%；（d）盐酸羟胺，氢氧化钾，甲醇，45°C，1小时，收率53-59%.
4-苯甲酰基苯基氨基甲酸叔丁酯和槐定碱，在氢化钠的作用下，反应生成化合物10；再以三氟乙酸为有机酸，化合物10于二氯甲烷中反应3小时脱去叔丁氧羰基保护基得到中间体11；以过量的碳酸钾为碱，中间体11和不同的溴代甲酯类化合物反应，得到化合物12a-c；最后，将化合物12a-c加入新鲜制备且充分干燥的羟胺甲醇溶液中，经充分反应，减压蒸干后加水溶解，调节pH至弱酸性（5-6），过滤后得到目标产物13a-c。
本发明公开的一类具有双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物的优点在于：
1. 化合物经酶抑制活性和体外抗肿瘤细胞增殖活性实验，发明本发明的优选化合物不仅对拓扑异构酶Ⅰ和组蛋白去乙酰化酶均具有很强的抑制活性，而且具有较强的体外抗肿瘤细胞增殖活性，部分化合对肿瘤细胞表现出与阳性药SAHA相当的抑制活性。
2. 本发明为深入研究和开发新结构类型的抗肿瘤药物开辟了新的途径，提供了新的策略。
附图说明
图1是目标化合物在100μM时对Top1的抑制实验；其中条带1，超螺旋质粒DNApBR322；条带2，DNA+Top1；条带3，DNA+Top1+阳性药CPT；条带4-10，DNA+Top1+目标化合物（5a-e，8a，13a）；
图2是人乳腺癌细胞株MDA-MB-231裸鼠移植瘤肿瘤变化：（1）给药过程中小鼠体重变化图；（2）肿瘤体积折线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
制备N-羟基-4-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)丁酰胺（5a）
（一）制备中间体2a：甲基-4-(2-甲酰基-1H-吡咯-1-基)丁酸酯
将化合物1约95.10mg（1.00mmol）置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL干燥的DMF作为溶剂充分溶解，在冰浴下缓慢加入氢化钠28.8mg（1.20mmol），0°C下搅拌反应1小时后，加入4-溴丁酸甲酯217.24mg（1.20mmol），室温下搅拌反应1小时。反应结束后，加入40mL水，并用50mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤后加入适量无水硫酸钠进行充分干燥，减压蒸干后得到粗产物，利用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚（15:1），得到黄色油状物136.65mg，产率为70%。1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 9.83 (s, 1H),7.59 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.39 (s, 1H), 4.15 (d, J = 16.8 Hz, 2H), 3.79 (s,3H), 2.45 (s, 2H), 1.97 (s, 2H).
（二）制备中间体4a：甲基 4-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)丁酸酯
于25mL圆底烧瓶中分别加入5mL干燥的四氢呋喃和氢化钠28.8mg（1.20mmol），搅拌均匀，加入槐定碱248.36mg（1.00mmol），保持0°C下再加入2a 234.26mg（1.20mmol），搅拌反应4小时。反应毕，加入40mL水，并用50mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤后加入适量无水硫酸钠进行充分干燥，减压蒸干后得到粗产物，利用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇（30:1），得到黄色油状物310.66mg，产率为73%。1H NMR (400MHz, d 6-DMSO) δ 7.44 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 4.25(s, 1H), 4.10 (s, 1H), 3.72 (s, 4H), 3.18 (d, J = 12.3 Hz, 3H), 2.84 (d, J =13.6 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 8.7 Hz, 4H), 2.47 – 2.38 (m, 5H), 2.09 (s, 1H),1.93 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 1.79 (s, 1H), 1.72 – 1.55 (m, 11H), 1.48 (s, 1H).
（三）制备目标产物5a
取盐酸羟胺4.67g（67mmol）溶于35mL甲醇中，冰水浴下缓慢加入氢氧化钾5.61g（100mmol），待完全溶解后于室温条件下反应1小时，反应结束过滤，所得滤液为新鲜制备的羟胺甲醇溶液。称取化合物4a 425.57（1.00mmol）置于25mL圆底烧瓶中，加入新鲜制备的羟胺甲醇溶液10mL，室温搅拌反应1小时，反应结束后，减压蒸干溶剂，加入20mL水溶解，缓慢滴加乙酸溶液调节体系pH至中性，静置后白色固体析出，减压过滤，将滤饼烘干后得固体234.61mg，产率为55%。1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 7.22 (s, 1H), 7.10 (s, 1H),6.51 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 4.23 (s, 1H), 4.09 (s, 1H), 3.19 (d, J = 4.8 Hz,2H), 2.84 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 10.5 Hz, 4H), 2.59 (s, 1H), 2.41(d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.32 (d, J = 0.6 Hz, 4H), 2.09 (s, 1H), 1.97 (s, 1H),1.85 (d, J = 10.8 Hz, 3H), 1.72 – 1.56 (m, 11H), 1.49 (s, 1H). 13C NMR (400MHz, d 6-DMSO) δ 171.32, 169.76, 129.57, 128.11, 123.31, 118.04, 111.47,109.56, 66.82, 56.98, 53.08, 48.45, 47.30, 41.39, 36.71, 32.22, 28.30, 26.84,26.29, 23.33, 23.22, 23.13, 21.69. ESI-MS: m/z [M+H]+: 427.56.
实施例2
制备N-羟基-4-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酰胺（8a）
（一）制备中间体6a：甲基-4-((2-甲酰基-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酸酯
将化合物1约95.10mg（1.00mmol）置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL干燥的DMF作为溶剂充分溶解，在冰浴下缓慢加入氢化钠28.8mg（1.20mmol），0°C下搅拌反应1小时后，加入4-溴甲基苯甲酸甲酯274.88mg（1.20mmol），室温下搅拌反应1小时。反应结束后，加入40mL水，并用50mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤后加入适量无水硫酸钠进行充分干燥，减压蒸干后得到粗产物，利用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚（20:1），得到黄色油状物172.71mg，产率为71%。1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 9.66 (s,1H), 7.95 – 7.81 (m, 2H), 7.62 (s, 1H), 7.39 – 7.31 (m, 2H), 7.23 (s, 1H),6.42 (s, 1H), 5.44 (s, 1H), 5.18 (s, 1H), 3.96 (s, 3H).
（二）制备中间体7a：甲基 4-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酸酯
于25mL圆底烧瓶中分别加入5mL干燥的四氢呋喃和氢化钠28.8mg（1.20mmol），搅拌均匀，加入槐定碱248.36mg（1.00mmol），保持0°C下再加入6a 291.91mg（1.20mmol），搅拌反应4小时。反应毕，加入40mL水，并用50mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤后加入适量无水硫酸钠进行充分干燥，减压蒸干后得到粗产物，利用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇（20:1），得到黄色油状物326.79mg，产率为69%。1H NMR (400MHz, d 6-DMSO) δ 7.96 – 7.82 (m, 3H), 7.45 – 7.31 (m, 3H), 7.21 (d, J = 9.0Hz, 3H), 6.55 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.23 (s, 3H), 3.96 (s, 4H), 3.20 (d, J =11.7 Hz, 3H), 2.88 – 2.65 (m, 7H), 2.41 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.09 (s, 1H),1.98 (s, 1H), 1.85 (s, 1H), 1.73 – 1.56 (m, 12H), 1.50 (s, 1H).
（三）制备目标产物8a
取盐酸羟胺4.67g（67mmol）溶于35mL甲醇中，冰水浴下缓慢加入氢氧化钾5.61g（100mmol），待完全溶解后于室温条件下反应1小时，反应结束过滤，所得滤液为新鲜制备的羟胺甲醇溶液。称取化合物7a 473.62（1.00mmol）置于25mL圆底烧瓶中，加入新鲜制备的羟胺甲醇溶液10mL，室温搅拌反应1小时，反应结束后，减压蒸干溶剂，加入20mL水溶解，缓慢滴加乙酸溶液调节体系pH至中性，静置后白色固体析出，减压过滤，将滤饼烘干后得固体275.27mg，产率为58%。1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 7.85 – 7.71 (m, 3H), 7.49 –7.34 (m, 3H), 7.23 (d, J = 9.4 Hz, 3H), 6.54 (s, 1H), 6.17 (s, 1H), 5.21 (d,J = 12.8 Hz, 3H), 3.20 (d, J = 11.7 Hz, 3H), 2.84 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 2.78(d, J = 2.0 Hz, 3H), 2.74 (s, 1H), 2.59 (s, 1H), 2.41 (d, J = 7.0 Hz, 2H),2.33 (s, 1H), 2.09 (s, 1H), 1.98 (s, 1H), 1.85 (s, 1H), 1.72 – 1.43 (m, 13H). 13C NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 169.76, 169.40, 143.45, 132.52, 129.57, 128.11,127.81, 127.58, 124.58, 124.00, 110.06, 109.66, 66.82, 56.98, 53.08, 49.58,48.45, 41.39, 36.71, 28.30, 26.84, 26.29, 23.33, 23.22, 23.13. ESI-MS: m/z [M+H]+: 475.61.
实施例3
制备N-羟基-7-((4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基)庚酰胺（13a）
（一）制备中间体10：叔丁基 (4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基甲酸酯
于25mL圆底烧瓶中分别加入5mL干燥的DMF和氢化钠28.8mg（1.20mmol），搅拌均匀，加入槐定碱248.36mg（1.00mmol），保持0°C下再加入4-（Boc-氨基）苯甲醛 265.50mg（1.20mmol），搅拌反应2小时。反应毕，加入40mL水，并用50mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤后加入适量无水硫酸钠进行充分干燥，减压蒸干后得到粗产物，利用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇（20:1），得到黄色油状物329.67mg，产率为73%。13C NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 170.85, 154.93, 141.13, 137.40, 132.18,128.48, 127.63, 121.42, 80.65, 66.82, 56.98, 53.08, 48.45, 41.39, 36.71,28.41, 28.30, 26.84, 26.29, 23.33, 23.13, 22.74.
（二）制备中间体11：(41S,7aR,13aR,13bR)-11-((E)-4-氨基苄烯)十二氢-1H,5H,10H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-10-酮
称取451.61.mg（1.00mmol）的化合物10置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷溶解，搅拌下缓慢滴加2mL三氟乙酸，室温下反应3小时，反应完毕后，滴加饱和碳酸氢钠溶液，调节溶液pH至7-8（弱碱性），加入乙酸乙酯30mL，萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤两次后加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂后得到粗产物，用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂体系为二氯甲烷：甲醇（50:1），得黄色油状物228.47，产率65%。1H NMR (400MHz, d 6-DMSO) δ 7.78 – 7.64 (m, 3H), 7.21 (s, 1H), 6.54 – 6.40 (m, 3H), 4.24(s, 3H), 3.26 (s, 1H), 3.19 (s, 1H), 2.84 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 2.70 (s, 1H),2.57 (d, J = 2.0 Hz, 3H), 2.41 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 2.09 (s, 1H), 1.84 (s,1H), 1.74 – 1.53 (m, 13H), 1.50 (s, 1H).
（三）制备中间体12a：甲基-7-((4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基)庚酸酯
将化合物11约351.49mg（1.00mmol）置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL干燥的DMF作为溶剂充分溶解，在冰浴下缓慢加入氢化钠28.8mg（1.20mmol），0°C下搅拌反应1小时后，加入7-溴庚酸甲酯267.73mg（1.20mmol），室温下搅拌反应1小时。反应结束后，加入40mL水，并用50mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤后加入适量无水硫酸钠进行充分干燥，减压蒸干后得到粗产物，利用硅胶柱层析进行纯化，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚（20:1），得到黄色油状物345.58mg，产率为70%。1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 7.85 – 7.71 (m,3H), 7.21 (s, 1H), 6.87 – 6.73 (m, 3H), 4.18 (s, 1H), 3.78 (s, 4H), 3.26 (s,1H), 3.18 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 2.84 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 2.70 (s, 1H), 2.57(d, J = 2.0 Hz, 3H), 2.44 – 2.34 (m, 5H), 2.09 (s, 1H), 1.84 (s, 1H), 1.75 –1.53 (m, 19H), 1.50 (s, 1H), 1.38 (d, J = 14.0 Hz, 5H).
（四）制备目标产物13a
取盐酸羟胺4.67g（67mmol）溶于35mL甲醇中，冰水浴下缓慢加入氢氧化钾5.61g（100mmol），待完全溶解后于室温条件下反应1小时，反应结束过滤，所得滤液为新鲜制备的羟胺甲醇溶液。称取化合物12a 493.69（1.00mmol）置于25mL圆底烧瓶中，加入新鲜制备的羟胺甲醇溶液10mL，室温搅拌反应1小时，反应结束后，减压蒸干溶剂，加入20mL水溶解，缓慢滴加乙酸溶液调节体系pH至中性，静置后白色固体析出，减压过滤，将滤饼烘干后得固体271.53mg，产率为55%。1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 7.86 – 7.71 (m, 3H), 7.21 (s,1H), 6.87 – 6.73 (m, 3H), 4.18 (s, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.18 (d, J = 5.3 Hz,3H), 2.88 – 2.81 (m, 4H), 2.65 (d, J = 54.7 Hz, 3H), 2.57 (d, J = 2.0 Hz,3H), 2.41 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.23 (s, 1H), 2.09 (s, 1H), 1.84(s, 1H), 1.74 – 1.53 (m, 18H), 1.50 (s, 1H), 1.38 (d, J = 11.1 Hz, 5H). 13CNMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ 171.32, 170.85, 148.64, 137.40, 131.37, 128.48,125.36, 112.58, 66.82, 56.98, 53.08, 48.45, 44.52, 41.39, 36.71, 34.51,29.42, 28.93, 28.30, 27.41, 26.84, 26.29, 25.13, 23.33, 23.13, 22.74. ESI-MS:m/z [M+H]+: 495.65.
实施例4
目标化合物的酶抑制活性
1. 目标化合物HDAC1酶抑制测试
1.1 实验材料：
HDAC1酶，缓冲液（137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，1mM氯化镁，0.1mg/mL BSA，pH=8的Tris-HCl 25mM），HDAC substrate 3，胰蛋白酶，96孔黑色板。
1.2 实验方法：
（1）96孔板平衡至室温；
（2）用含有10%DMSO的缓冲液稀释待测化合物，化合物浓度依次为100μM，30μM，10μM，3μM，1μM，0.3μM，0.1μM，0.03μM，0.01μM，0.003μM；
（3）将11μL的HDAC1加入到400μL的缓冲液中，摇匀；
（4）向96孔板上的第2-11孔加入35μL配好的含有HDAC1酶的缓冲液，并依次加入5μL稀释好的不同浓度的化合物到对应的反应孔中，对于阴性对照（第1个孔）和空白对照孔（第11个孔），分别加入40μL和5μL的assay buffer；
（5）向所有反应孔中加入100μM的HDAC substrate 5μL和0.5mg/mL的胰蛋白酶5μL，37°C孵化30分钟后读数。
（6）依据公式计算抑制率：抑制率=（100%活性孔-样品孔）/100%活性孔*100，在GraphPad软件中将酶活性对化合物浓度的曲线进行拟合，求出化合物的IC50值；
实验结果表明，这些化合物都表现出良好的HDAC1抑制活性，其中化合物5d（IC50=0.022μM）和13a（IC50=0.035μM）表现出优于阳性对照药SAHA（IC50=0.040μM）的HDAC1抑制活性。
表2. 目标化合物对HDAC1的抑制活性
化合物 IC<sub>50</sub>（μM） 化合物 IC<sub>50</sub>（μM）
5a >20 5e 0.052
5b 0.680 8a 0.089
5c 0.050 13a 0.035
5d 0.022 SAHA 0.040
2. Top1介导的DNA解螺旋实验
2.1 实验材料：
小牛胸腺DNA拓扑异构酶Ⅰ，负超螺旋DNA质粒pBR322，琼脂糖，二甲基亚砜，10×buffer 缓冲液，0.1%BSA和溴乙锭。
2.2 实验仪器
PowerPac电泳仪，Sub-Cell Model 96电泳槽和Gel Doc EZ全自动凝胶成像系统。
2.3 实验方法
a）用1×TAE溶液配制成浓度为0.8%的琼脂糖凝胶。
b）依次向1.5mL样品管中加入10μL水，2μL buffer，0.1%BSA，Top1 0.5U，DNA 0.5μL，DMSO溶解的不同浓度待测化合物溶液0.2μL，定容到20μL。
c）将样品管放入37°C水浴中，孵化15分钟。
d）加入3.5μL 6×loading buffer至样品管中。
e）110V电泳40-50分钟，用0.5μg/mL的EtBr染色15分钟，凝胶成像系统观察电泳结果。
实验结果表明（如图1），化合物5b、5c、5d、5e和8a在100μM的浓度下均表现出很强的Top1抑制活性。
实施例5
目标化合物的体外抗肿瘤活性测试（MTT法）
1. 实验材料
MTT，PRMI1640培养基，胎牛血清，96孔板，CO2恒温培养箱，BIO-TEK Uquant多功能酶标仪，人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、人肺癌细胞（A549）和人肝癌细胞（SMMC-7721），阳性对照药SAHA。
2. 实验方法
A）接种细胞，用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，培养过夜。
B）待测化合物溶液的配制，在无菌台中，将化合物的DMSO储备液以培养液稀释成待测5个浓度，相邻浓度之间为两倍稀释。
C）将不同浓度的化合物溶液加入已经培养过夜的96孔板中，每孔加入100μL，每个浓度加3个复孔。周围由于具有边缘效应，易染菌，因此不加细胞，不加化合物，而加100μL的培养液用作空白。另设置100%孔，即加入细胞和不含化合物的培养液100μL，在37°C恒温培养箱中孵育48小时。
D）染色，向96孔板中加入10μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制）染色，孵育4小时后，2500rps离心10分钟，然后用排枪将培养液从孔中吸出，，加入150μLDMSO，在震荡板震荡5-10分钟，使甲瓒充分溶解，用酶标仪测定570nm每孔的OD值。
抑制率（%）=（100%孔平均OD值－化合物孔平均OD值）/（100%孔平均OD值－空白孔平均OD值）×100%。根据各个浓度的抑制率值，进行线性回归，算出抑制细胞生长50%的药物浓度，即IC50。
实验结果（表3）显示，这些多靶点目标化合物具有中等以上的抗肿瘤细胞增殖活性，但是均弱于阳性药SAHA，其IC50值在1.98-18.82μM之间，其中化合物5d和5e是活性最好的潜力化合物。
表3. 目标化合物体外抗肿瘤细胞增殖活性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
实施例6
目标化合物体内抗肿瘤效果
根据以上实验结果，选择人乳腺癌细胞株MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型对化合物5d和5e的体内抗肿瘤活性进行了测试，给药剂量为80mg/kg，腹腔注射每天给药两次，连续给药14天。结果显示（表4），化合物5d和5e均表现出优秀的体内抑制活性，化合物5d的体内抑瘤率为77.66%，显著优于相同剂量下的阳性药SAHA对照组（40.42%）。此外，在给药期间，并未发现小鼠体重明显变化（图2），说明化合物5d的体内毒性较低，有进一步研究的价值。
表4. 化合物5d、5e和SAHA对MDA-MB-231裸鼠移植瘤的疗效（
Figure DEST_PATH_IMAGE014
）
Figure DEST_PATH_IMAGE016
实施例7
以5d或5e作为活性成分，加入药学可接收的辅料按常规方法可制成各种规格的液体注射剂。
5d或5e的给药途径包括多种，如注射给药，腔内给药等。
（1）注射剂的制备：
5d或5e 200 mg，甘露醇700 mg，PEG3000 10mg，蒸馏水100 ml，使pH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3mg/ml，按每安瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射剂。
（2）片剂的制备：
5d或5e 10 mg ，微晶纤维素 35 mg，淀粉 45 mg，聚乙烯吡咯烷酮 4 mg，羧甲基淀粉钠盐4.5 mg，硬脂酸镁 0.5 mg，滑石粉1 mg；将5d或5e活性成分，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于50℃干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。
（3）胶囊的制备
5d或5e 10 mg，活性成分辅料分别过100目筛，称取处方量的主药和辅料充分混合，加入羟丙甲纤维素溶液适量制软材，过24目筛，制得湿颗粒于50-60℃烘箱中干燥约2-3小时，将硬脂酸镁和滑石粉与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用2号胶囊灌装。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于熟悉本领域的技术人员，在不违背本发明创造精神的前提下，还可以做出若干等同的变型或替换，这些等同的变型或替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一类具有双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物，其特征在于，其选自如下化合物：
化合物5a：N-羟基-4-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)丁酰胺；
化合物5b：N-羟基-5-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)戊酰胺；
化合物5c：N-羟基-6-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)己酰胺；
化合物5d：N-羟基-7-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)庚酰胺；
化合物5e：N-羟基-8-(2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)辛酰胺；
化合物8a：N-羟基-4-((2-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)-1H-吡咯-1-基)甲基)苯甲酰胺；
化合物13a：N-羟基-7-((4-((E)-((41S,7aR,13aR,13bR)-10-氧脱氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11(10H)-亚基)甲基)苯基)氨基)庚酰胺。
2.权利要求1所述具有双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物在制备抑制剂中的应用，所述抑制剂为：
a）Top1抑制剂或
b）HDAC抑制剂或
c）Top1和HDAC双靶点抑制剂。
3.权利要求1所述具有双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效剂量的一种或多种如权利要求1所述的槐定碱衍生物或其药学上可接受的盐。
5.权利要求1所述具有双靶点抗肿瘤活性的槐定碱衍生物的制备方法，其特征在于，反应流程如下：
一、化合物5a-e的合成
Figure 746609DEST_PATH_IMAGE001
以化合物1吡咯-2-甲醛为起始原料，先后加入氢化钠和各种碳链长度的溴代甲酯，0℃条件下反应，得到化合物2a-e；在过量氢化钠作用下，化合物2a-e与化合物3槐定碱反应，得到关键中间体4a-e；最后，中间体4a-e与新鲜制备的羟胺甲醇溶液反应，减压蒸馏，残留物加水溶解后调节pH5-6至弱酸性，得到目标产物5a-e；
二、化合物8a的合成
Figure 888877DEST_PATH_IMAGE002
以化合物1吡咯-2-甲醛为起始原料，DMF为溶剂，先后加入氢化钠和对溴甲基苯甲酸甲酯，0℃条件下反应，得到化合物6a；在过量氢化钠作用下，化合物6a与化合物3槐定碱反应，得到关键中间体7a；最后，中间体7a与新鲜制备的羟胺甲醇溶液充分反应，减压蒸干溶剂，残留物加水溶解后调节pH5-6至弱酸性，得到目标产物8a；
三、化合物13a的合成
Figure 976919DEST_PATH_IMAGE003
4-苯甲酰基苯基氨基甲酸叔丁酯和槐定碱，在氢化钠的作用下，反应生成化合物10；再以三氟乙酸为有机酸，化合物10于二氯甲烷中反应3小时脱去叔丁氧羰基保护基得到中间体11；以过量的碳酸钾为碱，中间体11和7-溴庚酸甲酯反应，得到化合物12a；最后，将化合物12a加入新鲜制备且充分干燥的羟胺甲醇溶液中，经充分反应，减压蒸干后加水溶解，调节pH5-6至弱酸性，过滤后得到目标产物13a。
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