CN111356774A - 用于检测衰老细胞的新型生物标记物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测受试者衰老细胞或诊断受试者细胞衰老的方法，其中对来自所述受试者的样品中一个或多个miRNA的水平进行定量。

Description

用于检测衰老细胞的新型生物标记物

本发明是在美国政府的支持下，受到NIH的资助No.P01-AG017242进行的。美国政府对本发明享有某些权利。

本发明提供了一种在受试者中检测衰老细胞或诊断细胞衰老的方法，具体地是一种体外方法，其中对来自所述受试者的样品中一个或多个所选的miRNA的水平进行量化。

背景技术

细胞衰老是细胞周期停滞的一种稳定形式，是限制细胞增殖潜能的一种机制。衰老反应可在多种细胞类型中触发，以应对不同的细胞应激。它是肿瘤发生的有力屏障，并有助于某些抗癌药物的细胞毒性。尽管衰老以细胞自主的方式限制肿瘤发生和组织损伤，但衰老的细胞可以诱导炎症、组织老化和破坏，并以细胞非自主的方式促进肿瘤的发生和转移。

衰老细胞通过称为衰老相关分泌表型(SASP)的促炎分泌活动，通过丧失复制潜能从而丧失再生能力，以及丧失组织和细胞类型特异性功能(包括去分化或转分化)，导致机体功能的下降，并促进年龄相关疾病的发生。通过p16启动子驱动的自杀基因或特异杀灭衰老细胞的化合物清除衰老细胞，对小鼠模型的健康期具有有益的影响，延缓肾衰竭、骨质疏松和其他年龄相关疾病的发生。

最近的研究已经将细胞衰老从认为是具争议的老化细胞培养模型转变为认为是导致年龄相关疾病的因素和潜在的药物靶点。目前已经了解的是，衰老细胞在体内出现在各种人体组织中，包括皮肤、心血管系统、肾脏、肝脏、免疫系统、骨骼、白脂肪组织和肺，以及与阿尔茨海默病或胶质母细胞瘤相关的脑部，也出现在小鼠体内，特别是在肺、脾、真皮、肝和肠上皮。

在转基因小鼠模型中，通过激活由p16启动子控制的重组自杀基因可以清除衰老细胞，从中观察到衰老细胞和晚发年龄相关疾病的标记(Baker et al.2011,2016)。在该模型系统中专门测试的年龄相关疾病为肾脏疾病(Baker et al.2016)，但衰老细胞也涉及骨质疏松、骨关节炎、动脉粥样硬化和心脏纤维化。

这种组织中积聚的衰老细胞的负面影响认为主要是由衰老相关分泌表型(SASP)引起的。SASP的特点是促炎因子以及细胞外基质重构因子增多，细胞外基质重构因子促进正常细胞和肿瘤细胞的增殖。然而，这些细胞也会有负面影响——衰老细胞自身生理或分化状态的改变可能会导致衰老进程。

尽管如此，衰老细胞的短暂存在发现有助于伤口愈合、限制肝纤维化和微调胚胎发育。

寻找特异性杀灭衰老细胞的化合物的工作已经开始，并且已经鉴定出了数种这样的化合物，包括槲皮素、达沙替尼(dasatinib)(Zhu et al.2015)、navitoclax(Zhu etal.2016)、ABT263(Chang et al.2016)和FOXO4抑制肽(Baar et al.2017)。这些药理学化合物旨在治疗年龄相关疾病，以及减轻会导致应激诱导细胞衰老的疗法(例如化疗)的副作用。

为了研发赛诺力克(senolytic)疗法，需要新型生物标记物。生物标记物的定义为特定生物状态的可测量指标，特别是与疾病存在或阶段的风险相关的指标。在赛诺力克疗法的情况中，生物标记物在治疗前存在，治疗后消失，反映了衰老细胞的存在和消失。一些观点文章声称通过使用数种分泌到循环中的SASP蛋白来达到该目的(Matjusaitis etal.2016)。

生物标记物经常以伴随诊断(CDx)或补充诊断测试的形式作为临床应用。CDx是一种诊断测试，它提供了安全有效地使用相应药物或生物产物所需的信息。在赛诺力克疗法的情况中，这些生物标记物(或CDx测试)必须是灵敏和特异于各种组织中是否存在衰老细胞。

迄今为止，无细胞(循环)miRNAs还没有被讨论作为细胞衰老的潜在生物标记物。在无细胞血液中，miRNAs鉴定为与蛋白质复合物结合或包裹在细胞外囊泡中(Turchinovich et al.2013)。它们也被认为是数种疾病(Schraml and Grillari 2012；Hackl et al.2015)的潜在诊断或预后指标，包括癌症(Mitchell et al.2008a)、骨质疏松、骨关节炎((Beyer et al.2015)和心血管疾病(Zampetaki et al.2010,2012)。然而，目前尚不清楚无细胞循环microRNA是否可用于检测体内衰老细胞的存在或清除。

目前，监测野生型动物和人类衰老的细胞清除仍是一个挑战，因为鉴定衰老细胞需要侵入性技术，如组织切片。这是一个主要缺点，因为分析局限于特定组织，可能会遗漏在其他组织中正在进行的作用。此外，使用生物标记物来特异区分人类组织中衰老细胞和非衰老细胞仍是有争议的问题。因此，对检测衰老细胞的微创新型生物标记物和诊断方法的需求尚未得到满足。

发明内容

本发明的目的是提供赛诺力克(senolytic)生物标记物，用于检测和监测衰老细胞的存在以及积聚，用于诊断受试者的细胞衰老，以及在诊断衰老相关疾病风险和监测赛诺力克药物疗效的情况下确定衰老细胞的存在。

所述目的通过本发明的主题解决。

在本发明的实施方案中，显示了无细胞循环microRNA可用于检测受试者中衰老细胞的存在或清除。

据称，在血清、血浆、尿液和唾液等无细胞生物流体中可检测到的无细胞(循环)miRNA可用于鉴定衰老细胞的存在、积聚和清除，作为赛诺力克疗法的伴随或补充诊断方法，需要鉴定具有高水平的衰老细胞的个体，用于服用赛诺力克药物以及用于监测治疗响应。

本发明提供检测受试者衰老细胞或诊断受试者细胞衰老和/或监测受试者赛诺力克治疗成效的方法，该方法包括以下顺序步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表1所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平之间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

在本发明一实施方案中，测量所述一个或多个miRNA的水平并与参考水平进行比较，其中水平比较的差异幅度指示存在衰老细胞或指示细胞衰老。

本发明还包括检测受试者衰老细胞或诊断受试者细胞衰老和/或监测受试者赛诺力克治疗成效的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)测量选自由表1所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平，和

c)将所述miRNA的水平与参考样品中所述一个或多个miRNA的水平进行比较，

其中，当与各自miRNA水平比较时，差异幅度指示存在衰老细胞或指示细胞衰老。参考样品中miRNA的水平为参考水平。

在另一实施方案中，对(i)miR-34a-5p、(ii)miR-27a-3p和(iii)表1中所列的一个或多个其他miRNA的水平进行定量。根据另一实施方案，进一步对miR-137、miR-766-3p、miR-424-5p或它们的任何组合的水平进行定量。

在本文的另一实施方案中，提供了检测受试者衰老细胞、诊断受试者细胞衰老和/或监测受试者赛诺力克治疗成效的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表19所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

在一具体实施方案中，对选自由let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

在另一实施方案中，对选自由let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

在又一实施方案中，对选自由miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p组成的组的中一个或多个miRNA的水平进行定量。

根据另一实施方案，对选自由表2所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表3所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表4所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表5所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表6所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表7所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表8所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表9所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表10所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表11所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表12所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表13所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表14所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表15所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平定量。

根据另一实施方案，对选自由表2至15中任意组合所列的miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

根据另一实施方案，对从表2至15和表19至22中的任一个表所列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个不同组中的两个或更多个miRNA的水平进行定量。

根据另一实施方案，对至少3个、或至少4个、或至少5个的水平，具体地高达30个或更多个miRNA的水平进行定量。

在一个可选实施方案中，对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或更多个miRNA的水平进行定量。

根据另一实施方案，参考水平为健康受试者样品中相应miRNA的水平或健康受试者样品库中miRNA的水平和/或受试者在药理学(例如赛诺力克)、饮食或生活方式干预之前的各自miRNA的水平或受试者在药理学、饮食或生活方式干预之前的样品库中的水平，或样品库中所述miRNA的平均水平。

根据另一实施方案，水平比较的差异超过一个标准差指示存在衰老细胞或指示细胞衰老。

根据另一实施方案，本发明提供了用于监测受试者对赛诺力克治疗响应的体外方法，包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表1所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)将b)的水平与来自所述受试者的早期样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平之间的差异超过1.5倍指示响应于赛诺力克治疗。

根据另一实施方案，本发明提供了用于监测受试者对赛诺力克治疗响应的体外方法，包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表19、21和22所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)将b)的水平与来自所述受试者的早期样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，具体地所述水平间的差异超过1.5倍指示响应于赛诺力克治疗。

根据另一实施方案，miRNA水平的差异通过定量或数字PCR、测序、微阵列、基于Luminex的核酸分析或其他基于杂交的技术来测定。

根据另一实施方案，进一步测量由衰老细胞分泌的一种或多种蛋白质的水平并与蛋白质参考水平进行比较，其中当与蛋白质参考水平比较时，所述蛋白质水平的差异幅度指示存在衰老细胞或细胞衰老。根据一具体实施方案，结合各自的miRNA生物标记物测量，蛋白质水平比较的差异超过一个标准差指示存在衰老细胞或细胞衰老。

根据另一实施方案，受试者至少为30、40、50、60、70、80、90岁，尤其是存在年龄相关疾病风险和/或SASP风险的受试者。

根据另一实施方案，无细胞样品是无细胞血液样品，具体地为血清或血浆样品。

根据另一实施方案，无细胞样本是尿液或唾液样品。

本发明另一实施方案涉及使用本文所述方法来检测衰老细胞的下降或细胞衰老的减少，其中将所述miRNA水平与在赛诺力克、抗衰老剂或任何抗衰老干预治疗前的相应miRNA水平进行比较。

根据另一实施方案，本文提供了诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括选自由以下miRNA组成的组：miR-34a-5p、miR-7f-5p、miR-7a-5p、miR-143-3p、miR-27a-3p、miR-143-5p、miR-144-5p，miR-3058-3p、miR-30b-5p、miR-339-5p、miR-423-3p、miR-6395、miR-652-3p、miR-18b-5p、miR-92a-3p，并任选地进一步包括表2至15和19至22中所列的一个或多个miRNA。

根据另一实施方案，本发明提供诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括选自由以下miRNA组成的组：let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p、miR-125a-5p，并任选地进一步包括表19、20和/或21中所列的一个或多个miRNA。

根据另一实施方案，本发明提供了一种诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括表19、20和/或21中所列的一个或多个miRNA。

根据一可选实施方案，本发明提供了一种诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括选自由以下miRNA组成的组：let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p。

根据一可选实施方案，本发明提供了诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括选自由以下miRNA组成的组：miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p。

根据另一实施方案，本发明所述的方法也可用于检测来自细胞培养样品或体外培养的分离细胞样品中的衰老细胞。具体地，本发明提供了检测细胞培养样品中衰老细胞的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述细胞培养样品，

b)对在所述样品中选自由表1或表19所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平之间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

在另一实施方案中，本文还提供了一套试剂盒，包括上述的一组miRNA以及参考样品或参考水平和用于数据自动标准化和解析的软件，尤其是用于计算单索引分数的软件，其使用分类模型定量地反映了所述受试者的衰老程度。

一种仪器，其配置为执行本文所述的本发明方法，可选地使用软件程序。

本发明另一实施方案提供了一种仪器，用于使用本文所述的方法和生物标记物并配置为使用软件程序来检测衰老细胞或诊断细胞衰老。

附图说明

图1：A)实验概述。B)测序结果：总读数(read)和注释。

图2：主成分分析。所有13个样品中变化最大的50个microRNA被用于分析。前两个主成分阐明了66.7％的变化。

图3：诱导衰老(dox vs pbs)和用更昔洛韦(ganciclovir)挽救衰老(dox/gcv vsdox)后不同调节miRNA的韦恩(VENN)重叠。韦恩图中包含的microRNA列表：

dox vs.pbs：mmu-letf-5p、mmu-miR143-3p、mmu-miR-27a-3p、mmu-miR-144-5p、mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-200a-3p、mmu-miR-98-5p、mmu-let-7a-5p、mmu-miR-194-5p、mmu-miR-215-3p

dox/gcv vs dox：mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-206-3p、mmu-miR-345-3p

重叠区：mmu-miR-34a-5p

图4：对照组(pbs)、更昔洛韦(gcv)、阿霉素(dox)和dox+gcv处理动物的p16-3MR小鼠血清中不同调节microRNA的标准化读数计数(TPM)散点图。突出显示了显著差异(*)。*p<0.05，双尾t检验

图5：在一组包括雄性和雌性小鼠的独立的小鼠血清样品(每组n＝8)中，由基于RT-qPCR的NGS验证结果的标准化ΔCq值(dCq)的箱形图。为了清晰起见，将24个microRNA的数据分成两张图，A)和B)。进行单因素方差分析和事后检验以确定各组之间的统计学显著变化(*<0.05)。

图6：包含的microRNA组合(let-7a-5p、miR-125a-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p)与非相关microRNA组合(miR-221-3p、miR-222-3p、miR-22-3p、miR-378a-3p、miR-582-5p)对A)诊断细胞衰老，和B)监测赛诺力克治疗的诊断性能的直接比较。由ROC曲线计算得到的AUC值在曲线图例中给出。

具体实施方式

本说明书中使用的特定术语具有以下含义。

本文中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”可以同义地使用，并且应理解为开放式限定，允许进一步的成员或部分或元素。“由…组成”理解为封闭式限定，没有由限定特征组成的其他元素。因此，“包括”的范围更广，并包含“由…组成”的限定。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个指代，除非文中另有明确规定。

本文中使用的术语“大约”是指相同的值或与给定值相差±10％的值。

细胞衰老发生在培养和体内作为细胞外或细胞内应激的响应。衰老响应将细胞锁定在细胞周期停滞期，阻止受损细胞的增殖，并阻止潜在的恶性转化。

衰老是指随着时间推移而发生的一系列变化。与参考细胞或样本或受试者(例如，已知为非衰老的相同类型的细胞或样品或年龄)相比，衰老细胞、样品或受试者定义为表现出以下特征中任何一、二、三、四、五、六种或更多种或全部的细胞或受试者：细胞增殖能力降低；脂褐素积累(例如脂褐素积累增加)；β-半乳糖苷酶活性增加；线粒体衍生活性氧种类增加；核DNA损伤灶(nuclear DNA damage foci)增加；端粒缩短；p16或p21或其任何组合的表达增加；或者一细胞或受试者表现出导致上述特征的过程。

衰老细胞或受试者可进一步表现出自噬活性降低或线粒体膜电位降低，或表现出导致上述特征的过程。与细胞或受试者(例如已知的衰老细胞或受试者)相比，非衰老细胞或受试者可表现出细胞增殖能力增强、脂褐素积累减少、β-半乳糖苷酶活性降低或其组合。在人的情况下，从大约30岁或以上、大约40岁或以上、大约50岁或以上、大约60岁或以上、大约70岁或以上、大约80岁或以上、大约90岁或以上的人身上提取的细胞或样品可定义为衰老细胞或样品。

因此，术语“细胞衰老”和“衰老细胞”是指当能够分裂的细胞遇到极短的端粒、肿瘤胁迫或DNA损伤或经受强烈的有丝分裂信号时(例如但不限于癌基因或高表达的促增殖基因和衰老细胞(所述衰老细胞是一种潜在永久细胞，具有代谢活性，在蛋白质表达和分泌方面经历了广泛的变化))，发生基本上不可逆的生长停滞，最终发展成SASP。这种表型也被称为衰老信息分泌组(senescence-messaging secretome)，这意味着许多不同的蛋白质鉴定为比休眠细胞更大量分泌。迄今为止，已有>89种蛋白质报告为SASP因子，包括IL6、IL8(CXCL8)、IGFBPs或金属蛋白酶(MMP1、2、3、10、12、13)。

具体地，所述蛋白质可以是但不限于脂联素(ADIPOQ)、血管生成素(ANG)、双调蛋白(AREG)、受体酪氨酸激酶AXL、促β细胞素(Probetacellulin)(BTC)、C-C基序趋化因子1(CCL1)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)(C-C基序趋化因子11，CCL11)、C-C基序趋化因子13(CCL13)、C-C基序趋化因子16(CCL16)、C-C基序趋化因子2(CCL2)、C-C基序趋化因子20(CCL20)、C-C基序趋化因子25(CCL25)、C-C基序趋化因子26(CCL26)、C-C基序趋化因子27(CCL27)、C-C基序趋化因子3(CCL3)、C-C基序趋化因子5(CCL5)、C-C基序趋化因子8(CCL8)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(CSF2)、组织蛋白酶B(CTSB)，生长调节α蛋白(C-X-C基序趋化因子1)(CXCL1)、C-X-C基序趋化因子11(CXCL11)、基质细胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor 1)(C-X-C基序趋化因子12)(CXCL12)、C-X-C基序趋化因子13(CXCL13)、C-X-C基序趋化因子5(CXCL5)、白细胞介素8(C-X-C基序趋化因子8)(CXCL8)、表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮调节素(Epiregulin)(EREG)、肿瘤坏死因子受体超家族成员6(FAS)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、肝细胞生长因子(HGF)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、细胞间黏附分子3(ICAM3)，干扰素γ(IFNG)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)，胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、白细胞介素-11(IL11)、白细胞介素-13(IL13)、白细胞介素-15(IL15)、白细胞介素-1α(IL1A)、白细胞介素-1β(IL1B)、白细胞介素-1受体1型(IL1R1)、白细胞介素2-α受体(IL2RA)、白细胞介素-6(IL6)，白细胞介素6-β受体(IL6ST)、白细胞介素-7(IL7)、抑制素βA链(Inhibin beta A chain)(INHBA)、Kit配体(KITLG)、瘦蛋白(Leptin)(LEP)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞游走抑制因子(MIF)、间质胶原酶(MMP1)、溶基质素-2(MMP10)、巨噬细胞金属弹力酶(MMP12)、胶原酶3(MMP13)，基质金属蛋白酶-14(MMP14)、72kDa IV型胶原酶(MMP2)、溶基质素-1(MMP3)、核小体组装蛋白1-样4(NAP1L4)、β神经生长因子(NGF)、神经调节蛋白-1(NRG1)、制癌蛋白-M(OSM)、血小板源性生长因子-B(PDGFB)、磷脂酰肌醇糖生物合成类F蛋白(PIGF)、组织型纤溶酶原激活剂(PLAT)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(PLAU)、尿激酶型纤溶酶原激活剂表面受体(PLAUR)、纤溶酶原激活剂抑制剂2(SERPINB2)、纤溶酶原激活剂抑制剂1(SERPINE1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(STK4)、血小板生成素(THPO)、金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)，金属蛋白酶抑制剂2(TIMP2)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10C(TNFRSF10C)、肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)、肿瘤坏死因子受体超家族成员1A(TNFRSF1A)、γ-微管蛋白复合物2(TUBGCP2)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。

测量上述一种或多种蛋白质的表达率或分泌量将会是本文所述方法的另一个要素，因此蛋白质表达和分泌的增加或减少可以指示存在衰老细胞、细胞衰老或对赛诺力克治疗的响应。

术语“衰老细胞”具体是指表达衰老特征的标记物或标记物组合的细胞。这些标记物包括但不限于p16^INK4a肿瘤抑制蛋白，和相对于参照物(例如非衰老细胞)在DNA损伤反应(DDR)标记物水平中的表达增加，DNA损伤蛋白如53BP1或γH2AX与端粒的共定位，以及细胞周期抑制剂p16^INK4A、p15^INK4B、p21^CIP1和p53。DEC1、DCR2和PAI1也可以作为衰老的生物标记物。在一个实施方案中，衰老细胞表达SA-β-Gal(衰老相关β半乳糖苷酶)至使用X-Gal染色可产生蓝色，也称为“阳性染色”。

“培养应激”(其本质和体内当量尚不清楚)会导致在端粒没有明显侵蚀下的衰老停滞。这些应激可能包括不适当的基质，例如，组织培养的塑料，血清(大多数细胞在体内经历血浆，而非血清)，和氧化应激，例如在大气O₂中的培养，这样是超生理的。当PTEN抑癌因子(一种抵消促增殖/促生存激酶的磷酸酶)丢失时，细胞也会衰老。此外，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKis)的异位表达通常会导致衰老生长停滞，尤其是p21WAF1和/或p16^INK4a，可能会导致衰老。

根据本发明，“老化”是生物体发育时期之后退化过程的组合。老化的一般特征是对应激的适应能力下降，体内平衡失调加剧，衰老细胞增多，患病风险增加。因此，死亡是老化的最终结果。

老化率的加速可以是由应激条件引起的，包括但不限于化学、物理和生物应激。例如，加速老化可以由UV和IR射线、药物和其他化学品、化疗、毒物等引起的应激所引起，例如但不限于DNA插入和/或损伤药剂、氧化应激剂等；有丝分裂刺激、致癌刺激、有毒化合物、低氧、氧化剂、热量限制、暴露于环境污染物(例如二氧化硅)、暴露于职业污染物(例如灰尘、烟雾、石棉或烟雾)。在一些实施例中，受试者吸烟。所有这些应激源单独或组合都可以导致细胞衰老。

细胞衰老也可能是由端粒功能障碍(端粒未封)引起的，这是由重复的细胞分裂(称为复制衰老)、线粒体退化、氧化应激、严重或不可修复的DNA损伤和染色质损坏(遗传毒性应激)以及某些癌基因的表达(癌基因诱导衰老)所引起的。引起细胞衰老的应激可以由在生命过程中、在治疗干预期间(例如，X射线或化疗)遇到的外部或内部化学和物理损害来引起，或作为内源性过程(例如有氧呼吸和有丝分裂信号)的结果。外部有丝分裂信号，例如肿瘤细胞分泌的生长相关的癌基因α(GROα)极接近于正常细胞或循环血管紧张素II，也已被证明会诱导细胞衰老。所有具有分裂能力的体细胞都会经历衰老。不管衰老诱导应激的不同机制，一旦细胞感觉到严重的损伤或功能障碍，衰老程序就会激活。到目前为止，衰老生长停滞依赖于由p16^INK4a和pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)以及p53控制的主要肿瘤抑制通路的活性。一些参与衰老相关表型上下游通路的分子已被用作检测培养和体内衰老细胞的标记物。

化疗药物的非限制性示例包括蒽环类药物(anthracycline)、阿霉素、红比霉素、紫杉醇、紫杉酚、吉西他滨、泊马度胺和来那度胺。

在本发明一些方面中，衰老是由应激的组合引起的，例如，两个或更多个化学和物理应激；两个或更多个化学和生物应激；两个或更多个物理和生物应激；化学、物理和生物应激的组合等。

在无细胞血液(如血清或血浆)中的循环microRNA是一种最小或非侵入性的生物标记物来源，允许进行最小的侵入性检测，因此在临床和研究知识库中具有广泛的适用性。

“赛诺力克治疗”一词是指细胞或受试者暴露于赛诺力克药物或药剂中，诱导衰老细胞裂解，从而可以延缓、预防、缓解或逆转年龄相关或应激诱导的疾病。

赛诺力克药剂或药物是通过杀灭衰老细胞来选择性诱导衰老细胞凋亡的药剂。换句话说，与其破坏或杀灭非衰老细胞的能力相比，赛诺力克药剂以生物学、临床和/或统计学上显著的方式破坏或杀灭衰老细胞。在某些实施例中，赛诺力克药剂以诱导(启动、刺激、触发、激活、促进)并导致(即造成、致使)衰老细胞死亡的方式改变至少一个信号通路。例如，通过中和衰老细胞中细胞存活和/或炎症通路中的蛋白质，赛诺力克药剂可以改变细胞存活信号通路(例如，Akt通路)或炎症通路中的一个或两个。赛诺力克药剂改变(即干扰、影响)一个或多个在细胞衰老过程中激活的细胞通路。赛诺力克药剂可以改变衰老细胞中的细胞存活信号通路(例如Akt通路)或炎症通路，或同时改变细胞存活信号通路和炎症通路。衰老过程中某些细胞通路的激活会降低或抑制细胞诱导的能力并最终发生凋亡。

这种药剂可以是但不限于小分子、HSP90抑制剂、靶向Bcl-2家族的抗凋亡因子的药剂(例如navitoclax和TW-37)、鼠双微粒体2(murine double minute 2)(MDM2)抑制剂(例如顺式咪唑啉化合物、螺环氧吲哚化合物、苯二氮类化合物、哌啶酮化合物、色胺化合物)和CGM097以及相关的类似物。在某些实施方案中，MDM2抑制剂还能够结合并抑制MDMX(鼠双微粒体X，在人类中称为HDMX)的活性。在本领域中，MDM2的人类同系物称为HDM2(人双微粒体2)。Akt(蛋白激酶B，PkB)激酶抑制剂，例如相对于其他蛋白激酶选择性抑制其三种亚型Akt1、Akt2和Akt3的化合物。Akt抑制剂已经从三磷酸腺苷(ATP)竞争药剂发展到利用变构位点的替代方法，以克服催化域中Akt亚型之间高度的结构相似性，以及与AGC激酶家族相当的结构相似性，使得抑制剂具有更大的特异性，减少副作用和较低的毒性，例如Uprosertib、Afuresertib、MK-2206和Ipatasertib。其他药剂例如更昔洛韦(GCV)或AP20187也可作为赛诺力克并包含在本文中。在其它实施方案中，赛诺力克药剂可以是多肽、肽、抗体、抗原结合片段(即，包含至少一个互补决定区(CDR)的肽和多肽)、蛋白体、重组病毒载体或核酸。在某些实施方案中，赛诺力克药剂是反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或肽。例如，诸如多肽、抗体、核酸等赛诺力克药剂包括例如MDM2抑制剂、BCL-2家族抑制剂或Akt激酶抑制剂。在其它实施方案中，与本文所述小分子赛诺力克药剂的配体或靶蛋白特异结合的多肽、肽、抗体(包括其抗原结合片段)可用于表征或监测小分子赛诺力克药剂应用的试验和方法。

术语“样品”一般指组织或器官样品、血液、无细胞血液(例如血清和血浆)、尿液、唾液和脑脊液样品。

本文中使用的术语“无细胞”是指缺乏90％或以上细胞的样品。

在原始样品为含细胞样品的情况下，所述样品可采用本领域已知的细胞耗竭方法，从而可以是但不限于提取、离心、沉淀、过滤、通过FACS或磁性激活细胞分选(MACS)去除细胞法、色谱等。

如本文所用，术语“血液样品”是指血清、血浆、无细胞血、全血及其成分、血液制品或制剂。如实施例中所示，血浆和血清非常有用。具体地，血液样品是无细胞血液样品。

如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“患者”应指恒温哺乳动物，尤其是人类。或者，也可以是动物，例如小鼠、大鼠、狗、猫、猪、牛或非人类灵长类动物。

术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗，或诊断为细胞衰老或衰老相关疾病的人类和其他哺乳动物受试者。

如本文所用，术语“受试者组”是指一组健康的个体，并可特指从所述个体收到的样品。个体组的数量可以不同，即可以包括2、3、4、5、6、7个或更多个体，然而也可以是一个更大的受试者组，例如但不限于10、50、100个或更多个体。根据本发明的实施方案，该组还可以包括500个或更多个体的大群体。

如本文所用，术语“伴随诊断”应指一种诊断方法，其产生的结果来自于对本文所述的一个或多个生物标记物的分析，这是安全有效使用相应药物或医疗产品所需的。

如本文所用，术语“补充诊断”应指一种诊断方法，其产生的结果来自于本文所述的一个或多个生物标记物的分析，提供了关于安全有效使用药物或医疗产品的重要信息。

因此，本文描述的方法可用作伴随诊断和补充诊断工具。

如本文所述，本发明具体提供了检测受试者中衰老细胞或诊断细胞衰老的体外方法，该方法包括对所述受试者样品中选自由表1和/或表19所列miRNA及其亚型(可选地，结合表2至15中所列的任何miRNA)组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

如本文所用，术语“microRNA”或“miRNA”或“miR”指长度约为17至25个核苷酸的非编码RNA分子，特别是长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的非编码RNA分子，其杂交于并调节编码信使RNA的表达。

术语“miRNA分子”是指任何代表miRNA的核酸分子，包括天然miRNA分子，即成熟miRNA、前体miRNA(pre-miRNA)、原miRNA(pri-miRNA)。

“miR前体”、“前体miRNA”或“前体miR”指具有发夹结构的非编码RNA，其中包含miRNA。前体miRNA是由称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶(RNAse III)剪切原代mi-RNA转录物或“原-miR”的产物。前体可以是相应聚核苷酸的形式，因为它们发生在相应聚核苷酸的成熟过程中。

成熟miRNA及其相应前体的核苷酸序列为本领域已知，并可从miRBase数据库http://www.mirbase.org/index.shtml或从Sanger数据库http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/ftp.shtml获得。

在通过本文所述方法检测聚核苷酸的情况下，相比于包括或包含SEQ ID NO.1-92中任一核苷酸序列的聚核苷酸，本文所用的相同聚核苷酸可以具有至少90％、95％、97％、98％或99％的一致性或修饰小于3或2个单核苷酸。在一替代实施方案中，

此外，在通过本文所述方法检测聚核苷酸的情况下，相对于包括或包含SEQ IDNO.1-92中任一核苷酸序列的聚核苷酸，本文所用的相同聚核苷酸可以具有至少90％、95％、97％、98％或99％的一致性，并在相应原序列的5’端和/或3’端，对应前miRNA序列含有一、二、三个或更多个核苷酸。

根据本发明所用的所有特定miRNA还包括其亚型和变体。

尽管表1至15和19至22中所列的特定miRNA源于人类，但本发明应包括将任何其它来源的相应miRNA用于所述发明方法。因此，举例来说，包括来自任何来源的miRNA miR-34a-5p，其中在表1中明确提及hsa-miR-34a-5p。对于let-7f-5p、let-7a-5p、miR-143-3p、miR-27a-3p、miR-143-5p、miR-144-5p、miR-3058-3p、miR-30b-5p、miR-339-5p、miR-423-3p、miR-6395、miR-652-3p、miR-18b-5p、miR-92a-3p、miR-10a-3p、miR-151a-5p、miR-191-5p、miR-223-3p、miR-23a-3p、miR-24-3p、miR-29a-3p、miR-20b-5p、miR-93-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-18a-5p、miR-19a、miR-19b、miR-17-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-15a-5p、miR-15b-3p、miR-16-5p、miR-16-1-3p、let-7b-5p、let-7c-5p、let-7c-5p、let-7d-5p、let-7d-3p、let-7f、let-7g-3p、let-7i-3p、miR-23a-5p、miR-23b-3p、miR-24-1-5p、miR-27b-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-34b-5p、miR-34c、miR-34a-3p、miR-34a-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-376a-3p、miR-376b-3p、miR-376c-3p、miR-663a、miR-663b、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-181c-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-137、miR-766-3p、miR-424-5p、miR-193a-3p、miR-193b-3p、miR-214-3p、miR-155-5p、miR-199b-5p、miR-345-5p、MIR181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-3p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p、miR-150-5p也是同样地理解，它们可以来自任何来源。

为了本发明目的，参考miRNA的术语“异构体和变体”(也称为“异构mir(isomir)”)包括剪切变体(其中5’剪切位点位于参考miRNA序列上游或下游的5’剪切变体；3’剪切变体：3’剪切位点位于参考miRNA序列上游或下游)，或具有一个或多个核苷酸修饰的变体(参考miRNA的3’端添加3’核苷酸；通过改变miRNA前体核苷酸的核苷酸替换)，或互补成熟microRNA链，包括其亚型和变体(例如，对于给定5’成熟microRNA，互补3’成熟microRNA，反之亦然)。对于核苷酸修饰，不包括与RNA/RNA结合有关的核苷酸，即5’-种区域和剪切/锚定侧的核苷酸。

在下文中，如果没有另外说明，术语“miRNA”包括3p和5p链及其亚型和变体。

具体地，本说明书中所用的术语“miR-相应的_数字-3p”还包括其互补的5pmiRNA，反之亦然。

在具体实施方案中，使用核酸序列检测目的miRNA，该核酸序列优选地在严格条件与所述目的miRNA杂交并测量杂交信号。

在无细胞血液(例如血清或血浆)中的循环microRNA是一种最小或非侵入性的生物标记物来源，允许进行最小的侵入性检测，因此在临床和研究知识库中具有广泛的适用性。这对于影响组织的疾病尤其有利，因为这些组织不容易进行活检。Mitchell等人证明，从同一个健康个人的同一份血液中采集的血清和血浆中的miRNA测量值高度相关(Chen etal.2008；Mitchell et al.2008b)。但是，血浆样本采集的抗凝剂(肝素、EDTA、柠檬酸钠或草酸钠/草酸钾(NaF/KOx))的选择很重要，因为肝素干扰了基于PCR分析中的酶活性(García et al.2002；Boeckel et al.2013)。与肝素类似，柠檬酸盐对qPCR也有抑制作用，因此不推荐两者用于qPCR定量miRNA。与肝素不同，EDTA可从PCR主混合物中去除，因此可考虑选择为基于PCR的miRNA分析的抗凝剂(Zampetaki&Mayr,2012)。使用NaF/KOx作为抗凝剂会导致miRNA的检测率提高，如果血清或EDTA血液不易处理时，则可能是一个合适的选择(Kim etal.2012)。离心时间和离心速度已证明会严重影响EDTA血浆样品中miRNA的检测，因为它会影响血小板源性miRNA的污染(Cheng et al.,2013)。相反，血清中miRNA的检测对预处理变化的敏感性较低。鉴于现有技术水平，选择合适的条件进行mi-RNA诊断可以由技术人员来完成而不会造成过度负担。

本文使用的术语“定量”或“量化”是指绝对定量，即测定相应miRNA的量，但也包括测量相应miRNA的水平并将所述水平与参考或对照miRNA进行比较。对本文表格所列相应miRNA进行定量能够对衰老细胞的表达进行分析，从而能够识别衰老相关的特征，以及识别与预后和治疗响应相关的特征。miRNA的量或miRNA的水平差异可以通过本文所述的任何方法来确定。

在具体实施方案中，目的miRNA的水平由下一代测序(Next GenerationSequencing)确定。术语“下一代测序(NGS)”是指目前由依诺米那公司(Illumina)、生命技术公司(Life Technologies)、太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)、牛津纳米孔公司(Oxford Nanopores)和罗氏公司(Roche)等采用的通过合成所谓的平行测序或通过连接平台测序。下一代测序方法还可能包括纳米孔测序方法或基于电子检测的方法，例如生命技术公司商业化的离子激流技术(Ion Torrent technology)。

具体地，NGS指的是一种高通量的测序技术，它可以平行执行数千或数百万个测序反应。尽管不同的NGS平台使用不同的分析化学反应，但它们都从同时在大量模板上运行的大量测序反应中生成序列数据。通常，使用扫描仪收集序列数据，然后进行组装和生物信息分析。因此，测序反应是平行运行、读数、组装和分析的；参见，例如Behjati S和Tarpey，P.，2013(Arch.Di.Child Educ Pract Ed 2013,98,236-238)；Head S.et al.,2015(Biotechniques,56(2),61-passim)。

有些NGS方法需要扩增模板，有些则不需要。需要扩增的方法包括焦磷酸测序(例如，美国专利No.6,258,568；由Roche公司商业化)；Solexa/Illumina平台(例如美国专利No.6,833,246、7,115,400和6,969,488)；以及支持寡核苷酸连接和检测(SupportedOligonucleotide Ligation and Detection)(SOLiD)平台(应用生物系统；例如美国专利No.5,912,148和6,130,073)。不需要扩增的方法，例如单分子测序方法，包括纳米孔测序、HeliScope(美国专利No.7,169,560；7,282,337；7,482,120；7,501,245；6,818,395；6,911,345；和7,501,245)；通过合成进行实时测序(参见，例如美国专利No.7,329,492)；使用零模波导(zero-mode waveguides)(ZMW)的单分子实时(SMRT)DNA测序方法；以及包括在美国专利No.7,170,050；7,302,146；7,313,308；和7,476,503、US 20130274147；US 20140038831；和Metzker,Nat Rev Genet 11(1):31-46(2010)中描述的其他方法。可选地，也可以使用基于杂交的测序方法或其他高通量方法，例如微阵列分析、NANOSTRING、ILLUMINA或其他测序平台。

在另一具体实施方案中，目的miRNA的水平由聚合酶链式反应(PCR)测定。在各种实施方案中，核酸被扩增。可以使用本领域已知的任何扩增方法。可使用的扩增技术包括但不限于PCR、定量PCR、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、实时PCR(RT-PCR)、单细胞PCR、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、热启动PCR、套式PCR、原位polony PCR(insitu polony PCR)、原位滚环扩增(in situ rolling circle amplification，RCA)、桥式PCR、皮升PCR(picotiter PCR)和乳化PCR(emulsion PCR)。其他合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录扩增、自主序列复制(self-sustained sequence replication)、靶聚核苷酸序列的选择性扩增(selective amplification of target polynucleotidesequences)、一致性序列启动的聚合酶链式反应(CP-PCR)、随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)，简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和核酸基础序列扩增法(NABSA)。

在本发明有用的PCR方法中，引物通常基于成熟的miRNA分子，但可以包括优化杂交反应的化学修饰。

qRT-PCR方法可测定miRNA的绝对表达水平。或者，qRT-PCR方法可测定miRNA的相对数量。miRNA的相对量可以通过将miRNA的水平标准化为一个或多个内参核酸序列的水平(参考miRNA值)来确定。一般地，这些内参核酸序列在化验的血液或血清样品中应具有固定的水平。例如，内参核酸序列可以是组成型转录RNA的核酸序列，例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)等mRNA或非编码RNA，例如5S和18S核糖体RNA、RNU48、RNU44和RNU6。此外，在RNA分离或cDNA合成期间以等摩尔量加入的合成RNA序列可作为特定miRNA相对定量的参照物。

本发明中有用的实时PCR定量方法概述在Schmittgen et al.,2008,Methods.January；44(1):31–38中。

用于检测miRNA的引物是商用的，例如购于Exiqon的microRNA LNA^TM PCR引物组。

由于miRNA是相对较短的分子，如WO201114476A所建议的，在逆转录和扩增之前通过在链中增加腺苷酸单体(一种称为聚腺苷酸化的技术)来增长它们会是有用的。简言之，RNA可利用合适的试剂(例如Trizol试剂)从样品中提取，在ATP和poly(A)聚合酶存在下进行聚腺苷酸化，使用poly(T)接头和5’RACE序列反向转录成cDNA，并使用miRNA 3’端的正向引物和反向RACE引物进行扩增。这项技术的改进包括在3’端用核苷酸设计RACE引物(构成为A、C或G，但不是T，因此排除在polyA序列任何位置上启动，并增强在miRNA序列上启动)或使用有或没有化学修饰的2、3、4个或更多的核苷酸设计锚定在特定microRNA的3’cDNA末端的RACE引物。

miRNA的检测也可以通过本领域已知的其他方法来实现，例如WO201114476A中描述的方法，例如深度测序方法，基于微珠的定量(例如Illumina微珠阵列)，基于水凝胶颗粒的定量(例如Firefly^TM)，微阵列技术(例如，英杰(Invitrogen)公司的Ncode^TM人类miRNA阵列)，昂飞(Affymetrix)、安捷伦(Agilent)的阵列芯片，或采用LNA骨架捕获探针的微阵列(miRCURY LNA^TM阵列)(例如购于Exiqon)。

miRNA水平的差异也可以使用基于多重化学发光的核酸试验(例如Panomics)或包含具有microRNA互补调节位点的报告蛋白的报告质粒试验(“生物传感器”)或本领域已知的其他基于杂交的技术来测定。

生物标记物通常定义为在体液(例如血液或组织)中发现的生物分子，它们是正常或异常过程的标志，或是某种状况或疾病的标志。生物标记物的临床应用具体取决于其区分两个或多个组的能力，这些组通常包括健康、患病和接受治疗的受试者。生物标记物区分两个或更多组的能力可以用几种方法来评估，最常用的是方差分析(ANOVA)或受试者工作特征分析(ROC)。ANOVA评估三个或更多组之间生物标记物水平差异的统计意义，其中每个组包含至少三个独立的重复。p值<0.20可视为一种表明各组间生物标记物水平可能存在差异的趋势。p值<0.05通常认为表示各组间生物标记物水平的显著变化。ROC分析用于研究生物标记物水平区分两个特定组(例如健康组和患病组，或患病组和治疗组)的敏感性和特异性，其中敏感性是指在患病的受试者中得到阳性检测结果的概率，而特异性是指在没有疾病的受试者中得到阴性测试结果的概率。ROC曲线描述了生物标记物测试的敏感性和特异性与不断增加的阳性检测结果阈值的相关性。生物标记物的鉴别能力由该ROC曲线下的面积(AUC)来定义，其中AUC<0.6表示低，在0.6到0.7范围内表示中等，在0.7到0.8范围内表示良好，和>0.8表示非常好的鉴别能力。此外，AUC值为0.5表示随机分类能力，而面积为1.0表示无任何错误的完美分类。

“对照”、“对照样品”、“参考值”或“参考水平”是在本文中可互换使用的术语，应理解为用于与实验样品进行比较的样品或标准品。对照可以包括从健康受试者或以下情况受试者处得到的样品：该受试者不存在衰老风险或患有衰老，或未暴露于导致衰老的应激条件下，或暴露于用赛诺力克药剂的治疗。参考水平特指健康受试者样品中定量的miRNA或miRNA表达水平，该受试者不存在衰老风险或患有衰老，或未暴露于导致衰老的应激条件下，或在赛诺力克治疗监测的情况下，所述水平也可源于赛诺力克治疗开始前或赛诺力克治疗过程中的受试者。

具体地，在赛诺力克治疗期间或之后受试者的样品中得到的本文定义的一个或多个miRNA的参考水平与在更早时间点同一受试者的样品之间(个体内比较或个体内差异)相比超过1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍差异指示响应于赛诺力克治疗。

此外，对照也可以是标准参考值或范围值，例如样品中稳定表达的miRNA，例如内参U6 snRNA。

参考水平也可以确定为健康受试者和/或受试者在药理学、饮食或生活方式干预之前的样品中相应miRNA的平均水平。作为替代，也可以使用一个或多个受试者的样本库或文献中公开的参考值。

根据实施方案，水平比较的差异超过一个标准差指示存在衰老细胞或指示细胞衰老。

在一具体实施方案中，除了本文描述的miRNA水平测量外，还测量衰老细胞分泌的一种或多种蛋白质的水平，并与蛋白质参考水平进行比较，其中当与蛋白质参考水平和RNA参考水平比较时，所述蛋白质和miRNA水平的差异幅度指示存在衰老细胞或细胞衰老。

利用本发明所述方法定量的miRNA如下表1所示：

表1：

miRNA种类	序列	SEQ ID
			hsa-miR-34a-5p	UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU	SEQ ID No.1
hsa-let-7f-5p	UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU	SEQ ID No.2
			hsa-let-7a-5p	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU	SEQ ID No.3
hsa-miR-143-3p	UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC	SEQ ID No.4
			hsa-miR-27a-3p	UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC	SEQ ID No.5
hsa-miR-143-5p	GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU	SEQ ID No.6
			hsa-miR-144-5p	GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAG	SEQ ID No.7
mmu-miR-3058-3p	UUCCUGUCAGCCGUGGGUGCC	SEQ ID No.8
			hsa-miR-30b-5p	UGUAAACAUCCUACACUGAGCU	SEQ ID No.9
hsa-miR-339-5p	UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG	SEQ ID No.10
			hsa-miR-423-3p	AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU	SEQ ID No.11
mmu-miR-6395	CUGGCCCUCUCUGCCCUGUUUA	SEQ ID No.12
			hsa-miR-652-3p	AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG	SEQ ID No.13
hsa-miR-18b-5p	UAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAG	SEQ ID No.14
			hsa-miR-92a-3p	UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU	SEQ ID No.15

利用本发明所述方法定量的miRNA如下表19所示。具体地，表19中miRNA的表达水平与衰老相关，并且对于检测样品中的衰老细胞或测定样品的衰老或应激诱导衰老具有重要意义，和/或与赛诺力克治疗相关，并且对于在样品中监测赛诺力克治疗的成效具有重要意义。

表19

利用本发明所述方法定量的miRNA如下表20所示。具体地，表20中miRNA的表达水平与衰老显著相关，并且有利于检测样品中的衰老细胞或测定样品的衰老或应激诱导衰老。

表20

利用本发明所述方法定量的miRNA如下表21所示。具体地，表21中miRNA的表达水平与赛诺力克治疗显著相关，并且对于在样品中监测赛诺力克治疗的成效具有重要意义。

表21

利用本发明所述方法定量的一组筛选的衰老miRNA鉴别物如下表22所示。鉴别物包括与衰老和赛诺力克治疗成效相关的miRNA。

表22

根据一具体实施方案，定量以下miRNA的水平(i)miR-34a-5p(ii)miR-27a-3p和(iii)表1中所列的一个或多个miRNA。

根据另一实施方案，对选自由下表2所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表2

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-10a-3p	CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA	SEQ ID No.16
hsa-miR-151a-5p	UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU	SEQ ID No.17
			hsa-miR-191-5p	CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG	SEQ ID No.18
hsa-miR-223-3p	UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA	SEQ ID No.19
			hsa-miR-23a-3p	AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC	SEQ ID No.20
hsa-miR-24-3p	UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG	SEQ ID No.21
			hsa-miR-29a-3p	UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA	SEQ ID No.22
hsa-miR-20b-5p	CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG	SEQ ID No.23
			hsa-miR-93-5p	CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG	SEQ ID No.24
hsa-miR-106a-5p	AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	SEQ ID No.25
			hsa-miR-106b-5p	UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU	SEQ ID No.26
hsa-miR-18a-5p	UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG	SEQ ID No.27

根据另一实施方案，对选自由下表3所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表3

根据另一实施方案，对选自由下表4所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表4

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-15a-5p	UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG	SEQ ID No.34
hsa-miR-15b-3p	CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA	SEQ ID No.35
			hsa-miR-16-5p	UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG	SEQ ID No.36
hsa-miR-16-1-3p	CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA	SEQ ID No.37

根据另一实施方案，对选自由下表5所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表5

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-let-7b-5p	UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU	SEQ ID No.38
hsa-let-7c-5p	UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU	SEQ ID No.39
			hsa-let-7c-5p	UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU	SEQ ID No.40
hsa-let-7d-5p	AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU	SEQ ID No.41
			hsa-let-7d-3p	CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU	SEQ ID No.42
hsa-let-7f	UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU	SEQ ID No.43
			hsa-let-7g-3p	CUGUACAGGCCACUGCCUUGC	SEQ ID No.44
hsa-let-7i-3p	CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU	SEQ ID No.45

根据另一实施方案，对选自由下表6所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表6

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-23a-5p	GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU	SEQ ID No.46
hsa-miR-23b-3p	AUCACAUUGCCAGGGAUUACC	SEQ ID No.47
			hsa-miR-24-1-5p	UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU	SEQ ID No.48
hsa-miR-27b-3p	UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC	SEQ ID No.49

根据另一实施方案，对选自由下表7所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表7

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-29b-3p	UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU	SEQ ID No.50
hsa-miR-29c-3p	UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA	SEQ ID No.51

根据另一实施方案，对选自由下表8所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表8

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-30a-3p	CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC	SEQ ID No.52
hsa-miR-30a-5p	UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG	SEQ ID No.53
			hsa-miR-30c	UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC	SEQ ID No.54
hsa-miR-30d	UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG	SEQ ID No.55
			hsa-miR-30e-3p	CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC	SEQ ID No.56

根据另一实施方案，对选自由下表9所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表9

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-34b-5p	UAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUG	SEQ ID No.57
hsa-miR-34c	AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC	SEQ ID No.58
			hsa-miR-34a-3p	CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU	SEQ ID No.59
hsa-miR-34a-5p	UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU	SEQ ID No.60

根据另一实施方案，对选自由下表10所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表10

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-146a-5p	UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU	SEQ ID No.61
hsa-miR-146b-5p	UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU	SEQ ID No.62

根据另一实施方案，对选自由下表11所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表11

miRNA种类	序列	SEQ ID No.
			hsa-miR-376a-3p	AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU	SEQ ID No.63
hsa-miR-376b-3p	AUCAUAGAGGAAAAUCCAUGUU	SEQ ID No.64
			hsa-miR-376c-3p	AACAUAGAGGAAAUUCCACGU	SEQ ID No.65

根据另一实施方案，对选自由下表12所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表12

miRNA种类	序列	SEQ ID No.
			hsa-miR-663a	AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC	SEQ ID No.66
hsa-miR-663b	GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG	SEQ ID No.67

根据另一实施方案，对选自由下表13所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表13

miRNA种类	序列	SEQ ID No.
			hsa-miR-181a-3p	ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC	SEQ ID No.68
hsa-miR-181a-5p	AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU	SEQ ID No.69
			hsa-miR-181b-5p	AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU	SEQ ID No.70
hsa-miR-181c-5p	AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU	SEQ ID No.71

根据另一实施方案，对选自由下表14所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表14

miRNA种类	序列	SEQ ID No.
			hsa-miR-21-5p	UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA	SEQ ID No.72
hsa-miR-21-3p	CAACACCAGUCGAUGGGCUGU	SEQ ID No.73

根据另一实施方案，对选自由下表15所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

表15

miRNA种类	序列	SEQ ID No
			hsa-miR-137	UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG	SEQ ID No.74
hsa-miR-766-3p	ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC	SEQ ID No.75
			hsa-miR-424-5p	CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA	SEQ ID No.76
hsa-miR-193a-3p	AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU	SEQ ID No.77
			hsa-miR-193b-3p	AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU	SEQ ID No.78
hsa-miR-214-3p	ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU	SEQ ID No.79
			hsa-miR-155-5p	UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU	SEQ ID No.80

根据一具体实施方案，对表1中的一个或多个miRNA结合表2到15任一个中一个或多个不同miRNA的水平进行定量。

具体地，对miR-34a-5p和/或miR-27a-3p结合表2至15中一个或多个不同miRNA(例如miR-93-5p、miR-19a、miR-17、miR-23a-5p、miR-30a-3p或miR-376a)的水平进行定量。

具体地，对miR-137、miR-766-3p和/或miR-424-5p结合表2到15任一个中一个或多个不同miRNA的水平进行定量。

根据另一具体实施方案，对表1或表19中一个或多个miRNA结合表2至15和表19至22任一个中所列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个不同组中的两个或多个miRNA的水平进行定量。

具体地，对miR-34a-5p和/或miR-27a-3p结合表2至15中任一个所列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个不同miRNA中两个或多个miRNA的水平进行定量。

具体地，根据本文所述方法对miRNA let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p进行定量。具体地，对let-7a-5p结合let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p中的1、2、3、4、5个或全部进行定量。具体地，对let-7b-5p结合let-7a-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p中的1、2、3、4、5个或全部进行定量。具体地，对miR-199a-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p中的1、2、3、4、5个或全部进行定量。具体地，对miR-345-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p中的1、2、3、4、5个或全部进行定量。具体地，对miR-423-3p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p和miR-125a-5p中的1、2、3、4、5个或全部进行定量。具体地，对miR-125a-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p和miR-423-3p中的1、2、3、4、5个或全部进行定量。所述miRNA也可以结合表20或21中的一个或多个miRNA进行定量。

具体地，根据本文所述方法对miRNA let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p进行定量。具体地，对let-7a-5p结合let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对let-7b-5p结合let-7a-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-34a-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-34a-3p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-151-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-155-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-199a-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-199b-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p和miR-345-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。具体地，对miR-345-5p结合let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p和miR-199b-5p中的1、2、3、4、5、6、7个或全部进行定量。所述miRNA也可以结合表21或22中的一个或多个miRNA进行定量。

具体地，根据本文所述方法对miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p进行定量。具体地，对miR-23a-3p结合miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-23b-3p结合miR-23a-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-24-3p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-27a-3p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-146a-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-423-3p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-181b-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-183-3p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-215-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-31-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-375-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-409-3p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-125a-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-483-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-483-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p和miR-150-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。具体地，对miR-150-5p结合miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p和miR-483-5p中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或全部进行定量。所述miRNA也可以结合表20或22中的一个或多个miRNA进行定量。

具体地，对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30个或更多miRNA进行定量。

本发明具体提供了一组代表诊断信号或表达模式的miRNA，适用于各种细胞类型广泛的衰老情况，包括但不限于成纤维细胞、内皮细胞、肾上皮细胞、肝细胞、神经细胞、皮肤细胞、肺上皮细胞或结肠上皮细胞。特别是，在年轻受试者或未暴露于衰老诱导应激条件的受试者和老年受试者或暴露于衰老诱导应激条件的受试者的血液或血清中miRNA有差异性调节，检测miRNA为早期诊断、长期预后和筛查细胞衰老患者提供了一个具有更高的意义的诊断和预测工具。本文所述的方法还提供了用于监测赛诺力克药剂的诊断工具。

检测衰老细胞或诊断受试者细胞衰老的方法可专门用于在诊断衰老相关疾病或诊断受试者衰老相关疾病风险的情况下测定衰老细胞的存在。

衰老细胞相关疾病可以是心血管疾病，包括但不限于心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病(CAD)、颈动脉疾病、心内膜炎、冠状动脉血栓形成、颈动脉血栓形成、心肌梗死(MI)，高血压/高血压病、主动脉瘤、脑动脉瘤、心肌纤维化、心脏舒张功能障碍、高胆固醇血症/高脂血症、二尖瓣脱垂、外周血管疾病、外周动脉疾病(PAD)、心脏应激抵抗(cardiac stress resistance)和中风。

衰老细胞相关疾病可以是神经系统疾病。神经系统疾病包括但不限于帕金森病、阿尔茨海默病、痴呆、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、延髓性麻痹、假性延髓麻痹、原发性侧索硬化症、运动神经元功能障碍(MND)、轻度认知功能障碍(MCI)、亨廷顿病、眼部疾病、黄斑变性(湿性和干性)，青光眼、视力丧失、老花眼、白内障、进行性肌萎缩、下运动神经元疾病、脊髓性肌萎缩症(SMA)、韦德尼格-霍夫曼病(SMA1)、SMA2、库格尔伯格-韦兰德病(SM3)、肯尼迪病(Kennedy disease)、脊髓灰质炎后综合征、遗传性痉挛性截瘫、年龄相关性记忆衰退、抑郁和情绪障碍。

衰老细胞相关疾病可以是炎症疾病。炎性疾病包括但不限于肌肉骨骼疾病、骨关节炎、骨质疏松症、肌肉衰减症、狼疮、间质性膀胱炎、硬皮病、脱发、口腔粘膜炎、类风湿关节炎、炎性肠病、脊柱后凸、椎间盘突出症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、溃疡性哮喘、肾纤维化(包括移植后肾纤维化)、肝纤维化、胰腺纤维化、心脏纤维化、皮肤创伤愈合(包括糖尿病相关创伤愈合)和口腔黏膜下纤维化。

衰老细胞相关疾病可以是黄斑变性，干(非新生血管)或湿(新生血管)黄斑变性。

衰老细胞相关疾病可以是肺部疾病。肺部疾病包括但不限于特发性肺纤维化(TPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊胞性纤维化、支气管扩张、肺气肿、年龄相关肺功能丧失和年龄相关睡眠呼吸暂停。

衰老细胞相关疾病可以是皮肤疾病。皮肤疾病包括但不限于牛皮癣、湿疹、皱纹、瘙痒、感觉障碍、丘疹鳞屑性疾病、红皮病、扁平苔藓、苔藓样皮肤病、过敏性皮肤炎、湿疹爆发、嗜酸性皮肤病、皮疹、光敏性和光老化相关疾病和失调，反应性嗜中性皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫性水泡疾病、皮肤纤维组织细胞增生、皮肤痣、荨麻疹、色素沉着、皮肤淋巴瘤、银屑病和皮肤狼疮。

本发明的实施方案还包括使用本文所述方法用于预测移植器官功能或预测器官移植失败的应用。

本发明所述方法可以单个测量来进行，但也可以通过重复测定来进行。

本文所述方法还可用于检测衰老细胞的减少或细胞衰老的减少，其中所述miRNA的水平与用赛诺力克、抗衰老剂或任何抗衰老干预治疗前相应miRNA的水平进行比较。具体地，该信号可以指示衰老细胞的清除，例如在使用赛诺力克、抗衰老剂(例如雷帕霉素、亚精胺、二甲双胍)或任何其他抗衰老干预，如饮食、运动等。该信号还可用于鉴别从任何赛诺力克干预中受益的受试者。

具体地，该方法有利于监测受试者，特别是测量受试者对赛诺力克治疗的响应。因此，表达信号也可用于指示有效药物剂量(剂量探索，例如，在任何类型干预的研发过程中，或用于鉴别个性化治疗方案或剂量)。

本文所述方法可用于监测疗法和治疗成效，或监测暴露于衰老诱导剂(毒物，包括氧化应激剂、DNA损伤剂等)。

根据本文中表格的miRNA信号可以指示衰老细胞在任何哺乳动物物种中的存在，例如老化、年龄相关疾病、早衰综合征、化疗期间、中毒或任何其他增加衰老细胞数量的治疗/事故。

本文还包括以下项目：

1.一种检测受试者衰老细胞、诊断受试者细胞衰老和/或监测受试者赛诺力克治疗成效的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表1所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

2.根据项目1的方法，其中对(i)miR-34a-5p、(ii)miR-27a-3p和(iii)表1中所列的一个或多个其他miRNA的水平进行定量。

3.一种检测受试者衰老细胞、诊断受试者细胞衰老和/或监测受试者赛诺力克治疗成效的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表19所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

4.根据项目3的方法，其中对选自由let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

5.根据项目3或4检测衰老细胞或诊断细胞衰老的方法，其中对选自由let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

6.根据项目3或4监测赛诺力克治疗的方法，其中对选自由miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

7.根据项目1至6中任一项的方法，其中对选自由表2所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

8.根据项目1至7中任一项的方法，其中对选自由表3至15中任一组合所列miRNA组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

9.根据项目1至8中任一项的方法，其中对表2至15和表19至22中任一表所列的选自至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或高达15个不同组中两个或多个miRNA的水平进行定量。

10.根据项目1至9中任一项的方法，其中对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或更多个miRNA的水平进行定量。

11.根据项目1至10中任一项的方法，其中参考水平为健康受试者或受试者在药理学、饮食或生活方式干预前或其组合的样品中相应一个或多个miRNA的水平。

12.根据项目1至11中任一项的方法，其中水平比较的差异超过一个标准差指示存在衰老细胞或指示细胞衰老。

13.根据项目1至11中任一项监测受试者对赛诺力克治疗响应的方法，包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表1、19或21所列miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)将b)的水平与来自所述受试者的早期样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平间的差异超过1.5倍指示响应于赛诺力克治疗。

14.根据项目1至13中任一项的方法，其中miRNA水平通过定量或数字PCR、测序、微阵列、Luminex核酸分析或其他基于杂交的技术进行测定。

15.根据项目1至14中任一项的方法，其中受试者至少为30、40、50、60、70、80或90岁，尤其是存在年龄相关疾病风险和/或SASP风险的受试者。

16.根据项目1至15中任一项的方法，其中样品是血液样品，特别是无细胞血液样品。

17.根据项目1至16中任一项检测衰老细胞减少或细胞衰老减少的方法，其中将所述miRNA水平与在赛诺力克、抗衰老剂或任何抗衰老干预前的相应miRNA水平进行比较。

18.根据项目1至17中任一项的方法，其中进一步测量由衰老细胞分泌的一种或多种蛋白质的水平并与蛋白质参考水平进行比较，其中当与蛋白质参考水平比较时，所述蛋白质水平的差异幅度指示存在衰老细胞或细胞衰老。

19.一种诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p、miR-125a-5p，并任选地进一步包括表19、20和/或21中所列的一个或多个miRNA。

20.一种诊断装置，其包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，所述miRNA包括表19、20和/或21中所列的一个或多个miRNA。

以下实施例旨在帮助理解本发明而提出，而并非旨在也不应解释为以任何方式限制本发明的范围。这些实施例不包括对常规方法的详细描述。这些方法为本领域的普通技术人员所熟知。

实施例

发明人将分泌的miRNA鉴定为SASP的一部分，因此将无细胞血液源性的循环miRNA假设为无创性、特异性的衰老细胞清除生物标记物基础。为了鉴别这些生物标记物，他们使用p16-3MR小鼠(Demaria et al,2014,Developmental Cell 31:722-733)，进行诱导衰老以及衰老细胞清除，并从血清中分离出小RNA用于下一代测序(参见实施例1)以及逆转录定量PCR(RT-qPCR，参见实施例2)分析。

事实上，他们发现了数种miRNA，包括miR-34a-5p，众所周知其会在小鼠和人类细胞衰老过程中上调，在诱导和随后清除衰老细胞后循环量存在差异。

他们的数据表明，循环miRNA可能是评估衰老细胞存在水平、监测衰老细胞杀灭的宝贵工具，因此是将赛诺力克物质转化为临床不可或缺的工具。此外，当SASP因子需要灭活时，这些miRNA可以用作治疗靶点。

实施例1

1.材料和方法

1.1.小鼠操作和血清取样

p16-3MR(Demaria et al,2014,Developmental Cell 31:722-733)小鼠在室内饲养，并保存于AALAC认证的Buck老龄化研究所(Buck Institute for Research on Aging)(Novato,CA)的动物设施中。实验选用10至12周龄的p16-3MR雄性小鼠。小鼠分为4组，每组3只。在A组，向对照组小鼠注射PBS。在B组，小鼠用溶于PBS的更昔洛韦(GCV)(Sigma-Aldrich)处理连续5天。在C组，小鼠用溶于PBS的盐酸阿霉素(Sigma-Aldrich)处理。在D组，小鼠先用阿霉素处理，10天后用GCV处理。小鼠腹腔注射10mg/kg盐酸阿霉素，并通过腹腔注射连续5天每天注射溶于PBS浓度为25mg/kg的GCV。最后一次GCV给药4天后，用CO2对动物实施安乐死，并立即取血。然后在室温下将血液孵育30分钟，并在3400×g下离心10分钟。避免干扰细胞颗粒下，将血清仔细收集于无菌试管中，并保存于-80℃以待进一步实验。

1.2.下一代测序

使用Qiagen miRNeasy提取试剂盒(Qiagen,德国)从200μl血清中进行总RNA提取。基于内参RNA以及溶血反应性RNA的qPCR扩增，在均质提取效率和溶血性方面对RNA产量进行质量检查(Blondal et al)。采用CleanTag文库制备规程(Trilink Biotechnologies,USA)利用共2μl的总RNA制备文库，该规程使用化学修饰接头以防止接头自连。使用生物分析仪DNA-1000芯片控制文库质量和产量。由于纯度高，文库未经纯化，在Illumina NextSeq500上用50bp单端测序进行测序。

1.3.生物信息学

在Exiqun(丹麦)进行下一代测序。以Q-分值为30或以上对原始读数进行质量筛选。剪掉接头序列，将剩余读数与小鼠基因组、miRBase、非编码RNA数据库比对，并将其分类为microRNA、小RNA、基因组作图RNA或超出比对的(outmapped)RNA序列。对所有microRNA亚型(isomiR)添加读数计数，并通过microRNA读数计数除以比对的读数的总数并乘以1百万(标签每百万(Tags Per Million))进行标准化。使用网络工具clustvis(Metsalu andVilo 2015)将标签每百万用于数据挖掘(PCA和分层聚类)。

采用EdgeR统计软件包进行差异表达分析。为了标准化，基于对数倍和样品间表达水平的绝对基因变化使用M值修剪平均法(TMM标准化)。这种标准化主要是补偿样品特异效应(通常由样品间测序深度的变化引起)。此外，通过识别使主要microRNA样品间的对数倍变化最小化的标度系数，标准化步骤抵消了欠采样效应(由于高表达microRNA主导读数设置)。p值<0.05的MicroRNA被认为受到显著调控。

2.结果

2.1.表征

为了鉴别诱导或清除衰老细胞后的差异循环RNA，对动物进行处理，并在最后一次处理4天后对血清取样，如实验概述所述(图1A)。

为了分析表达，将全部microRNA读数计数(所有isoMIR的总数)标准化为总的比对的读数每文库(“标签每百万，TPM”)。我们在13个样品的每个中用一个或多个TPM鉴别了179个miRNA，其中94个miRNA在13个样品的每个中至少含有10个TPM。这94个miRNA纳入进一步的分析。

2.2.各组间循环miRNA的差异

在探索性数据分析中，我们根据变化系数将主成分分析(PCA)应用于50个变化最大的microRNA数据集。PCA图清楚地表明了相比于PBS处理的对照动物，强力霉素(dox)处理对p16-3MR小鼠循环microRNA水平的影响(图2)。这表明，用强力霉素处理诱导衰老后，循环miRNA水平发生显著变化。对差异循环miRNA的分析专注于dox处理与对照(PBS)之间的变化，以鉴定那些受衰老以及dox-GCV与dox诱导调节的miRNA，以鉴定清除衰老细胞后发生变化的miRNA。使用p值阈值<0.05，无需对多次测试进行校正。因此，我们鉴定了10个在dox与对照中显著调控的miRNA(表17)和3个在dox-GCV与dox组中显著调控的miRNA(表18)，其中如韦恩图所示一个miRNA，miR-34a-5p为重叠(图3A和B)。每一个差异表达的miRNA的血清水平以标签每百万显示于图4。有趣的是，相比于PBS处理的动物，更昔洛韦处理(GCV)导致血清miRNA持续下降。与PBS相比，GCV处理的动物由于被迫凋亡，其衰老细胞数量减少。在miR-34a-5p、miR-27a-3p和miR-345-3p的情况中，相比于PBS对照组，dox处理动物的水平提高，但在dox+GCV治疗后降低。

结果如图2主成分分析所示。将所有13个样品中变化最大的50个microRNA用于分析。前两个主成分解释了66.7％的变化。

表16：用衰老激活剂(dox vs pbs)处理后差异分泌的microRNA

表17：用衰老激活剂(dox+gcv vs gcv)治疗后差异分泌的microRNA

这些数据表明，这12个miRNA的循环水平可认为是衰老细胞死亡的信号。

为了将这些发现扩展到潜在的额外miRNA，我们对miR-34a-5p和miR-27a-3p进行了皮尔森相关(Pearson correlation)分析，得到了额外潜在的生物标记物(表18)。

表18-与miR-34a-5p和miR-27a具有高度皮尔森相关性(>0.7)的microRNA

讨论

在这里，我们描述了在小鼠模型中对衰老细胞增加和对衰老细胞减少作出反应的循环miRNA(通过NGS鉴定)。最近循环miRNA作为生物标记物受到关注，因为它们通过包裹到EV中或通过蛋白质或脂蛋白颗粒保护免受血清和血浆中存在的RNAse影响，因此即使在血液取样数十年后和保存于-80℃，也能在生物流体中稳定地检测到(Hackl et al.2015)。由于小鼠血清样品较少，我们从无细胞血液中分离出总RNA，因此无法区分囊泡包裹的miRNA和蛋白结合的miRNA。但是，在体内诱导或清除衰老细胞后，数种miRNA明显地显示出水平差异。我们观察到，除了miR-27a-3p和miR-34a-5p发现增加外，大多数microRNA在暴露于衰老诱导剂后降低。因此，清除衰老细胞后，观察到小鼠血清中miR-34a水平明显降低，说明miR-34a-5p的血清水平与系统性细胞衰老之间存在关系。

该miRNA是第一个鉴别为在p53诱导的细胞衰老中上调的miRNA，并且足以诱导人成纤维细胞(Tazawa et al.2007)、(He et al.2007)、((Maes et al.2009)，内皮细胞(Itoet al.2010)和肾近端肾小管上皮细胞(Hackl et al.2010)的衰老样生长停滞。该miRNA在小鼠肾脏老化过程中(Bai et al.2011)以及在骨髓来源的间充质干细胞和源于老年和年轻捐赠者的皮肤中(Hackl et al.2010)也会上调。它调控凋亡行为(Tarasov etal.2007)、((Yamakuchi et al.2008)，而且独立于p53(Christoffersen et al.2009)。根据其在p53调控网络中的功能，它在许多癌细胞类型中有差异表达，并在功能上参与调控癌细胞增殖、耐药性或凋亡。最后，由于数种癌症类型证实为缺乏miR-34，因此将miR-34用于诱导小鼠模型中的肿瘤凋亡(Xue et al.2014)，到目前为止，其甚至已经进入了针对恶性肿瘤的临床I期试验((Adams et al.2016)。

在老化的情况中，miR-34家族成员发现在年龄相关疾病的循环系统中增加，包括2型糖尿病((Kong et al.2011)，听力损失(Pang et al.2016)，非酒精性脂肪肝((Salvozaet al.2016)、(Yamada et al.2013)、(Cermelli et al.2011)，阿尔茨海默病((Bhatnagaret al.2014)，以及冠心病患者(Han et al.2015)，或者在心肌梗塞后左心室重塑期间(Lvet al.2014)。在这种情况下，它似乎在功能上参与促进心肌细胞凋亡(Fan et al.2013)。它在肥胖症中有所升高，其中已经发现其作用于FGF21和klotho轴(Fu and Kemper 2016)，并且也归类为促炎性miR(inflammamiR)((Rippo et al.2014)、(de Gonzalo-Calvo etal.2015)。有趣的是，将葡萄酒提取物和白藜芦醇用于T2D的营养补充可降低血清中的miR-34a水平((Tomé-Carneiro et al.2013)。骨关节炎组织中高水平的miR-34a-5p可能导致软骨细胞的流失，至少在大鼠模型中是这样((Grillari and Grillari-Voglauer 2010)、((Abouheif et al.2010)，而在miR-34过表达转基因小鼠中骨质疏松症得以减轻(Krzeszinski et al.2014)。此外，在肾纤维化模型中，肾成纤维细胞在体外分泌miR-34a-5p(Zhou et al.2014)，我们还发现miR-34家族的成员可由衰老的人类皮肤成纤维细胞分泌(我们的未发表成果)。

最近慢性HIV感染和高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)被认为与早衰有一些相似之处(Gustafson et al.2016)。事实上，观察到miR-34-5p在T细胞数量减少的患者中有所增加(Reynoso et al.2014)。

在所有这些条件下，最近在相应组织中观察到衰老细胞的增加(

andSerrano 2014)。因此，miR-34家族成员的增加，尤其是miR-34a-5p的增加，很可能是由于体内衰老细胞的增加所致，这些细胞因此向组织微环境和循环中分泌miR-34a-5p。因此，miR-34a-5p很可能被包裹进入细胞外囊泡，正如在一些研究中在EV中的发现(Corcoran etal.2014)。

MiR-27a-3p也是循环中的一个重要标记物，因为它在衰老的内皮细胞胞内(Dellago et al.2013)以及复制老化的T细胞胞内(Hackl et al.2010)也得以上调。

这里鉴别的miRNA似乎不是源于按时间顺序排列的T细胞老化，因为我们在健康老年个体和年轻个体的T细胞中没有观察到miR-34-5p或其他检测的miRNA，此外，在血清老化的信号中也没有发现它们(Noren Hooten et al.2013)，在B细胞(Gombar et al.2012)或单核细胞(Serna et al.2012)中也没有发现。

最后，我们小鼠模型的衰老诱导是基于阿霉素，这是在体内和体外都诱导衰老的数种化学疗法之一，尤其是miR-34家族成员可以通过多种化学疗法进行诱导，包括顺铂、培美曲塞(Franchina et al.2014)或体内用新辅助疗法和在体外利用阿霉素。

综上所述，我们提出将本文鉴别的基于血清的miRNA作为衰老细胞存在和清除的生物标记物。其作为伴随诊断将对赛诺力克的发展具有特殊价值。

实施例2：

1.材料和方法

1.1.小鼠操作和血清取样

p16-3MR(Demaria et al,2014,Developmental Cell 31:722-733)小鼠在室内饲养，并保存于AALAC认证的Buck老龄化研究所(Novato,CA)的动物设施中。实验选用10至12周龄的p16-3MR雄性小鼠。小鼠分为4组，每组8只，雌性5只，雄性3只。在A组，向对照组小鼠注射PBS。在B组，小鼠用溶于PBS的更昔洛韦(GCV)(Sigma-Aldrich)连续处理5天。在C组，小鼠用溶于PBS的盐酸阿霉素(Sigma-Aldrich)处理。在D组，小鼠先用阿霉素处理，10天后用GCV处理。小鼠腹腔注射10mg/kg盐酸阿霉素，并通过腹腔注射连续5天每天注射溶于PBS浓度为25mg/kg的GCV。最后一次GCV给药4天后，用CO₂对动物实施安乐死，并立即取血。然后在室温下将血液孵育30分钟，并在3400×g下离心10分钟。避免干扰细胞颗粒下，将血清小心地收集于无菌试管中，并保存于-80℃以待进一步实验。

1.2.RT-qPCR分析

使用Qiagen miRNeasy提取试剂盒(Qiagen,德国)从200μl血清中进行总RNA提取。基于内参RNA以及溶血反应性RNA的qPCR扩增，在均质提取效率和溶血性方面对RNA产量进行质量检查(Blondal et al)。采用Exiqon通用RT试剂盒II(Exiqon,丹麦)利用共2μl的总RNA进行逆转录。将获得的cDNA样品以1:40预稀释，随后与SyBr

Mix(Exiqon,丹麦)混合以达到1:100稀释。将混合物分到涂覆引物的384孔板上，384孔板上含有针对96个选定microRNA或用于质量管理分析的引物对。使用制造商推荐的退火、延伸和变性方法，在Roche LightCycler 480 II上进行QPCR扩增。

1.3.生物信息学

使用二阶导数法计算原始Cq值。对熔融曲线的峰值进行检查以确保扩增反应的特异性。随后，使用内参对照控制作为参考对Cq值进行标准化，以降低数据中的技术噪音。

使用Medcalc(版本18.2.1)进行统计分析。采用D'Agostino-Pearson检验评估正态分布，p>0.05时接受为正态分布。采用单因素方差分析结合两两比较的Student-Newman-Keuls检验(post-hoc检验)对各组间的显著性差异进行分析(p<0.05)。为了评估单个microRNA的鉴别能力，采用了受试者工作特征(ROC)分析。用灵敏度(Y轴)和1-特异性(X轴)绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下的面积(AUC)。AUC值>0.7的MicroRNA认为是良好的鉴别物/生物标记物。AUC值>0.8的MicroRNA认为是很好的鉴别物/生物标记物。

2.结果

2.1.RT-qPCR检测诱导衰老及赛诺力克治疗后血清循环microRNA的变化。

利用上述统计分析，我们证明了，与阴性对照(PBS)相比，暴露于衰老诱导剂(DOX)的动物血清中的以下microRNA确实受到显著调节(与性别无关)：let-7a、let-7b、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p在暴露于DOX后的动物血清中发现显著(上调或下调)(表23)。

反之亦然，通过GCV处理(DOX/GCV)使衰老剂失活后对雌性和雄性小鼠的血清样品进行分析，并与应激对照动物(DOX)进行比较，证实了以下microRNA生物标记物的上调或下调(p<0.05)：miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p在血清中的水平在赛诺力克治疗后发生显著变化(上调或下调)。

图5A显示了所有4组中证实的microRNA(let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p)的血清水平。图5B显示了所有4组中以下microRNA的血清水平：miR-199a-5p、miR-199b-5p、miR-345-5p、miR-181b-5p、miR-183-5p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-3p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p、miR-150-5p。

2.2.ROC分析以评估循环microRNA在诊断衰老和赛诺力克治疗中的鉴别能力。

为了评估循环microRNA对衰老诱导物质(DOX)暴露和赛诺力克治疗效果的诊断能力，进行ROC分析并计算曲线下的面积(AUC)。通常地，认为AUC值>0.8的生物标记物展示了很好的诊断性能，而AUC值>0.7的生物标记物具有良好的诊断性能。下表23总结了24个选定的循环microRNA的AUC值和95％置信区间。

表23

＊显著p＜0.05

+存在趋势p＜0.2

o无趋势

2.3.与单个microRNA或非相关microRNA相比，特定microRNA的组合显示出增加的诊断性能

我们进行了多重逻辑回归分析和ROC分析，以比较包含的microRNA组合与单个包含的microRNA的性能(表23)以及比较包含的microRNA组合与非衰老相关microRNA(“非相关microRNA”)的性能。

图6A清楚地显示了表23中包含的microRNA(let-7a-5p、miR-125a-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p)与非相关microRNA(miR-221-3p、miR-222-3p、miR-22-3p、miR-378a-3p、miR-582-5p)在诊断衰老上的诊断性能差异：AUC为0.953相比于AUC为0.719(p＝0.1)。

图6B清楚地显示了相同包含的microRNA(let-7a-5p、miR-125a-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p)与非相关microRNA(miR-221-3p、miR-222-3p、miR-22-3p、miR-378a-3p、miR-582-5p)在赛诺力克治疗效果上的诊断性能差异：AUC为0.938相比于AUC为0.578(p＝0.015)。

特定microRNA组合在诊断细胞衰老和监测赛诺力克治疗上的AUC值(AUC均>0.9)明显优于单个microRNA的性能，因为没有单个microRNA在诊断细胞衰老和监测赛诺力克治疗上均达到AUC>0.9(表23)。

3.讨论

用于检测和定量循环microRNA的分析技术具有固有误差，其最终可能导致筛选到假阳性或假阴性的候选生物标记物。为了避免该缺陷，我们将RT-qPCR分析应用于雄性和雌性动物的扩展组，这些动物与原先基于NGS的探索研究中的四组动物相同，以评估结果的可比性，从而增加对我们研究结果的信心。

我们的分析表明24个microRNA在衰老细胞和赛诺力克治疗后的细胞中被显著调控。尤其是let-7a、let-7b、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p，发现在暴露于衰老诱导化合物后的动物血清中显著上调或下调。

反之亦然，使衰老剂失活，例如经赛诺力克治疗导致了miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p的显著上调或下调。

我们还发现，有数个microRNA在衰老和赛诺力克治疗两种状态下，都表现出显著调控(p<0.05)，或者至少有调控趋势(p<0.20)。因此，认为这些microRNA是很好的衰老鉴别物(AUC>0.8)：let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p、miR-125a-5p。

最后，我们证明以多重回归模型的形式组合这些microRNA可以得到一个分值，这个分值对于衰老细胞的存在(图6A)以及赛诺力克治疗效果(图6B)都是高度敏感和特异的，并且优于单个包含的microRNA和非相关microRNA的组合。

引用的参考文献

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Claims (20)

1.一种在受试者中检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表19所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中的所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平之间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

2.根据权利要求1所述的方法，其中对选自由let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p和miR-125a-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

3.根据权利要求1或2检测衰老细胞或诊断细胞衰老的方法，其中对选自由let-7a-5p、let-7b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-151-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p和miR-345-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

4.根据权利要求1或2监测赛诺力克治疗的方法，其中对选自由miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-146a-5p、miR-423-3p、miR-181b-5p、miR-183-3p、miR-215-5p、miR-31-5p、miR-375-5p、miR-409-3p、miR-125a-5p、miR-483-5p和miR-150-5p组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量。

5.一种在受试者中检测受试者衰老细胞、诊断受试者细胞衰老和/或监测受试者赛诺力克治疗成效的体外方法，该方法包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表1所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)任选地，将b)的水平与参考样品中的所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平间的差异指示存在衰老细胞或细胞衰老。

6.根据权利要求5所述的方法，其中对(i)miR-34a-5p、(ii)miR-27a-3p和(iii)表1中所列的一个或多个其他miRNA的水平进行定量。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中对选自由表2所列的miRNA组成的组中的一个或多个其他miRNA的水平进行定量。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中对选自由表3至15中任一所列的miRNA组成的组中的一个或多个其他miRNA的水平进行定量。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中对从表2至15和表19至22中任一所列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或高达15个不同组中两个或更多个miRNA的水平进行定量。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或更多个miRNA的水平进行定量。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中参考水平为健康受试者或受试者在药理学、饮食或生活方式干预前或其组合的样品中相应的一个或多个miRNA的水平。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中水平比较的差异超过一个标准差指示存在衰老细胞或细胞衰老。

13.根据权利要求1至11中任一项监测受试者对赛诺力克治疗响应的方法，包括以下步骤：

a)提供所述受试者的无细胞样品，

b)对在所述样品中选自由表1、19或21所列的miRNA或其亚型组成的组中的一个或多个miRNA的水平进行定量，和

c)将b)的水平与来自所述受试者的早期样品中所述一个或多个miRNA的参考水平进行比较，其中所述水平之间的差异超过1.5倍指示响应于赛诺力克治疗。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中miRNA水平通过定量或数字PCR、测序、微阵列、Luminex核酸分析或其他基于杂交的技术进行测定。

15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中受试者至少为30、40、50、60、70、80或90岁，尤其是存在年龄相关的疾病风险和/或SASP风险的受试者。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中样品是血液样品，特别是无细胞血液样品。

17.根据权利要求1至16中任一项检测衰老细胞下降或细胞衰老减少的方法，其中将所述miRNA的水平与在用赛诺力克、抗衰老剂或任何抗衰老干预治疗之前的相应miRNA水平进行比较。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中进一步测量由衰老细胞分泌的一种或多种蛋白质的水平并与蛋白质参考水平进行比较，其中当与蛋白质参考水平比较时，所述蛋白质水平的差异幅度指示存在衰老细胞或细胞衰老。

19.一种诊断装置，该装置包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，该miRNA包括let-7a-5p、let-7b-5p、miR-199a-5p、miR-345-5p、miR-423-3p、miR-125a-5p和任选地进一步包括表19、20和/或21中所列的一个或多个miRNA。

20.一种诊断装置，该装置包括一组miRNA，用于检测衰老细胞、诊断细胞衰老和/或监测赛诺力克治疗成效，该miRNA包括表19、20和/或21中所列的一个或多个miRNA。

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