CN111352228B - 用于拍摄试样区域的荧光图像的方法和显微镜系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于拍摄具有生物试样的试样区域的显微镜的荧光图像的方法。将激光射线借助物镜向着试样区域指向。沿着物镜的光学轴线改变在物镜与试样区域之间的相对间距以产生相应的、不同的相对间距。针对相应的相对间距，检测相应量的像素强度值，所述相应量的像素强度值通过在界限面上反射的且通过物镜透射返回的激光射线在图像传感器的传感器像素上产生。此外，基于针对相应的相对间距所检测的相应量的像素强度值确定相应的聚焦度规。此外，基于所求取的聚焦度规来求取优选的相对间距。最后，调整到所述优选的相对间距，利用激励辐射照亮试样区域以及借助图像传感器检测显微镜的荧光图像。此外，本发明涉及一种显微镜系统和一种处理器。

Description

用于拍摄试样区域的荧光图像的方法和显微镜系统
技术领域
本发明涉及用于拍摄具有生物试样的试样区域的显微镜的荧光图像的方法和显微镜系统。此外，本发明涉及一种处理器。
背景技术
由现有技术已知如下方法以及装置，在所述方法和装置中借助激光射线对于相机或图像传感器相对于具有生物试样的试样区域进行聚焦，并且然后检测试样区域的荧光图像。
尤其是已知一种方法，在该方法中，在具有带例如635nm波长的激光射线的情况下，利用第一相机或第一图像传感器检测在所谓的红色通道中的反射，以便为了聚焦的目的得到试样区域相对于显微镜的物镜的优化的取向或优化的间距。然后利用另外的相机在绿色通道中检测具有生物试样的试样区域的荧光图像。在此，也可以在绿色通道中检测不具有红色份额的绿色的荧光图像。
DE102008015885A1描述了一种用于光学仪器的自动聚焦的方法，其中，为此利用同心环拍摄图像，所述同心环的直径根据要确定的聚焦位置的间距来改变。
WO2016/133787A1公开了用于显微镜的自动聚焦的方法和系统，其中，将反射的激光射线的峰值用作针对系统的聚焦度的指标。
发明内容
本发明的目的在于提供用于在自动聚焦的情况下拍摄显微镜的荧光图像的特别高效的系统和方法。
按照本发明的目的通过所提出的用于拍摄具有生物试样的试样区域的显微镜的荧光图像的方法来实现。激光射线借助至少一个物镜向着试样区域指向，该试样区域具有至少一个界限面，其中，物镜引起激光射线聚焦在聚焦平面中。沿着物镜的光学轴线改变在物镜与试样区域之间的相对间距，以便产生相应的、不同的相对间距。在此，针对相应的相对间距，检测相应量的像素强度值，所述相应量的像素强度值通过在界限面上反射的且通过物镜透射返回的激光射线在图像传感器的相对应的传感器像素上产生。此外，针对相应的相对间距，基于针对所述相应的相对间距所检测的相应量的像素强度值确定相应的聚焦度规(Fokusmetrik)。此外，基于所求取的聚焦度规来求取优选的相对间距。最后，调整到所述优选的相对间距，利用激励辐射照亮试样区域以及借助图像传感器检测显微镜的荧光图像、尤其是在所述优选的相对间距上或在调整到优选的相对间距时借助图像传感器检测显微镜的荧光图像。
按照本发明的方法的特征在于，所述图像传感器是具有前置的色彩滤镜矩阵的光传感器，此外，所述显微镜的荧光图像是彩色图像、尤其是非单色的彩色图像，并且激光射线具有在近红外范围中的波长。
所提出的、按照本发明的方法允许：检测试样区域的荧光图像作为彩色图像，其中，仅须将唯一一个图像传感器用于检测彩色图像并且用于聚焦过程，因为图像传感器前置有色彩滤镜矩阵。这种具有前置于图像传感器的色彩滤镜矩阵的图像传感器也可以在聚焦期间同时用于检测像素强度值，因为激光具有在近红外范围中的波长。
近红外范围是对于人而言不可见的红外范围，并且是如下波长范围，在该波长范围中色彩滤镜矩阵与激光射线产生特别的共同作用，如下文更详细解释的。
按照现有技术普遍的是，在单独的红色通道中利用单独的图像传感器或相机和单独的光学色彩滤镜检测具有例如635nm波长的激光。如果将具有635nm波长的激光射线与一个图像传感器或光传感器相组合同时与一个色彩滤镜矩阵相组合地用于聚焦过程，那么不一定能保证：激光射线入射到色彩滤镜矩阵的如下区域上，所述区域对于这种635nm波长的红光而言是可充分透射的。色彩滤镜矩阵通常包括针对不同色彩通道的不同滤镜元件型式、尤其是至少包括红色通道和绿色通道的型式、特别优选此外也包括蓝色通道的型式。色彩滤镜矩阵则由多个色彩滤镜元件的二维的布置结构构造，其中，沿一个布置方向相对彼此紧挨着相邻的色彩滤镜元件分别是不同的滤镜元件型式。因此，在色彩滤镜矩阵中不能保证，激光射线入射到色彩滤镜矩阵的合适的色彩通道或红色通道的滤镜元件上并且然后充分透射至图像传感器。因此，将这种630nm的激光与图像传感器和色彩滤镜矩阵相组合地用于聚焦是有问题的，因为可能由于色彩滤镜矩阵的确定的区域或滤镜元件而发生对镭射光的不期望的压制。
通过按照本发明使用在近红外范围中的激光射线并且使图像传感器具有前置的色彩滤镜矩阵，充分利用了如下令人惊讶的效果：市场上常见的色彩滤镜矩阵可以在近红外范围中在其所有通道中或在其不同色彩通道的所有部分区域中对于近红外范围的光而言是可充分透射的、尤其是对于大于780nm、优选大于800nm、特别优选等于或大于850nm的波长的光而言是可充分透射的。
由此，尽管图像传感器前置有色彩滤镜矩阵，相同的图像传感器仍不仅可以用于检测呈彩色图像形式的荧光图像而且可以用于借助激光射线来聚焦。通过检测荧光图像作为彩色图像，也可实现：可以给用户展现如下图像，该图像不仅具有在唯一的绿色通道中的有色部和/或荧光而且具有其他色彩区域或色彩通道、例如红色通道的有色部和/或荧光。生物试样、例如生物组织的荧光图像不仅具有基于结合荧光颜料的单纯的绿色着色部，而且必要时还具有自有着色部，所述自有着色部不仅在绿色区域中可见而且例如在橙色或棕色区域中也可见，从而带有红色份额。此外，组织或器官组织也可以具有所谓的自动荧光，所述自动荧光同样更确切地说在橙色区域或棕色区域中对于用户是可见的。用户、例如医生想要执行检验并且有时习惯于通过显微镜的目镜来查看并且在没有另外的有色部或色彩通道挑选的情况下光学地对荧光图像进行观察，以便然后执行检验。如果如由现有技术已知的那样仅使用绿色通道，那么用户则在这种单纯的绿色通道荧光图像的情况下在后期在再现该荧光图像时不能察觉到其他色彩份额。因此，以有利的方式提供一种方法，在该方法中，可以将具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器用于获取荧光图像作为彩色图像，其中，这种具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器同时也可以用于借助在近红外范围中的激光射线进行聚焦。亦即不需要另外的、附加的或单独的相机或图像传感器用来探测反射的激光射线。
本发明的有利的实施方式在下文的描述中在部分参照附图的情况下详细解释。
优选地，所述显微镜的荧光图像是数字的彩色图像，该数字的彩色图像尤其是具有至少一个绿色份额和红色份额。特别优选地，所述数字的彩色图像还具有蓝色份额。这种色彩份额可以通过对应于RGB色彩编码的数字的彩色图像来展现。但替代地，也可设想，所述数字的彩色图像在另外的色彩编码、例如CMYK色彩编码中展现这种色彩份额。
优选地，所述色彩滤镜矩阵是具有多个色彩通道的矩阵，所述矩阵具有至少一个绿色通道和红色通道、特别优选此外也具有蓝色通道。特别优选地，所述色彩滤镜矩阵是RGB矩阵。
所述波长优选大于780nm、优选大于800nm。所述波长优选处于780nm至1000nm的范围中、优选处于800nm至1000nm的范围中。在一种特别的实施方式中，所述波长为850nm。
所述色彩滤镜矩阵优选是拜耳矩阵。
所述光传感器优选是CMOS传感器或CCD传感器。
优选通过检测相应的色彩通道的相应的部分量的像素强度值来针对相应的相对间距检测相应量的像素强度值，其中，基于所述相应的部分量的像素强度值求取所述相应量的像素强度值。优选地，在此利用预定的缩放因数给相应的部分量的像素强度值加权，该缩放因数取决于，所述相应的部分量的像素强度值属于哪一类型的色彩通道。由此，能够平衡色彩滤镜矩阵的各个色彩通道的透射率差。
优选地，色彩滤镜矩阵的相应的色彩通道在激光射线的波长上具有相应的彼此最大相差为5的因数的透射率。由此，可实现，由相应的色彩通道的像素强度借助对像素强度值的与色彩通道有关的缩放来确定相应量的像素强度值，其中，所述相应的色彩通道的强度值彼此相差得不远，因为否则与色彩通道型式有关地缩放相应的值会引起在信噪比方面过强的劣化。
所述激光射线优选是基本上准直的、平行的射线束。
优选地，在物镜与图像传感器之间的探测光路中设置有透镜或透镜系统，所述透镜或所述透镜系统将物镜的焦平面映射在图像传感器上。
优选地，基于相应量的像素强度值将相应最高的或最大的像素强度值确定作为针对相应的相对间距的相应的聚焦度规。此外，优选通过将相应最高的像素强度值配设给相应的相对间距来确定各最高的像素强度值的曲线。优选地，借助各最高的像素强度值的曲线的至少一个极大值来确定所述优选的相对间距。
优选地，在使用第一间距分辨率的情况下通过从最大间距出发朝着最小间距减小相对间距来改变所述相对间距，从而所述曲线具有多个极大值。优选地，基于所述多个极大值确定暂时优选的相对间距。优选地，然后在使用高于第一间距分辨率的第二间距分辨率的情况下朝着所述暂时优选的相对间距增大所述相对间距，同时检测相应的另外的最高的像素强度值作为在相应的、另外的相对间距上的相应的聚焦度规。优选地，基于所述另外的最高的像素强度值探测局部的极大值的存在并且确定优选的、最终的相对间距作为存在所述局部的极大值的相对间距。
此外，提出一种用于拍摄具有生物试样的试样区域的显微镜的荧光图像的显微镜系统。该显微镜系统具有：用于保持试样区域的试样支架，该试样区域具有至少一个界限面；还有用于产生激光射线的激光源；用于发出激励光到试样区域上的激励光源；至少一个物镜，该物镜构成用于使激光射线向着试样区域指向并且此外引起激光射线聚焦在聚焦平面中；以及用于检测一定量的像素强度值的图像传感器，所述像素强度值通过在界限面上反射的且通过物镜透射返回的激光射线在图像传感器的相对应的传感器像素上产生。
物镜和试样支架能沿着物镜的光学轴线相对于彼此移动，以便改变在物镜与试样区域之间的相对间距。
此外，所述显微镜系统具有处理器。所述处理器构成用于操控物镜和/或试样支架，使得物镜与试样区域相对彼此具有相应的、不同的相对间距。此外，所述处理器构成用于针对相应的相对间距借助图像传感器检测相应量的像素强度值并且此外基于相应量的像素强度值求取相应的聚焦度规。此外，所述处理器构成用于基于所求取的聚焦度规确定优选的相对间距。此外，所述处理器构成用于操控物镜和/或试样支架，使得调整到所述优选的相对间距，此外激活激励光源以及借助图像传感器检测显微镜的荧光图像。
所述显微镜系统的特征在于，所述图像传感器是具有前置的色彩滤镜矩阵的光传感器，所述显微镜的荧光图像是彩色图像、尤其是非单色的彩色图像，并且所述激光射线具有在近红外范围中的波长。
此外，提出一种处理器，其具有一个或多个接口。所述处理器构成用于经由所述一个或多个接口，提供第一控制信号以用于激活镭射光源，提供第二控制信号以用于操控物镜和/或试样支架，从而物镜与试样支架相对彼此具有相应的、不同的相对间距，以及从具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器针对相应的相对间距接受相应量的像素强度值。此外，所述处理器构成用于基于所述相应量的像素强度值求取相应的聚焦度规以及基于所求取的聚焦度规确定优选的相对间距。此外，所述处理器构成用于经由所述一个或多个接口，提供第二控制信号或另外的控制信号以用于操控物镜和/或试样支架，使得调整到所述优选的相对间距，此外提供第三控制信号以用于激活激励光源，以及从图像传感器接受像素强度值。此外，所述处理器构成用于基于所接受的像素强度值来确定显微镜的荧光图像，其中，所述显微镜的荧光图像是彩色图像，并且镭射光源具有在近红外范围中的波长。
附图说明
下面借助专门的实施方式在不限制一般的发明构思的情况下借助附图详细解释本发明。附图中：
图1示出所提出的显微镜系统的优选的实施方式，
图2示出具有生物试样的示例性的试样区域，
图3a示出图像传感器，
图3b示出色彩滤镜矩阵，
图4a、4b和4c示出带有在不同相对间距下拍摄的部分图像的、图像传感器的探测面的部分区域的像素强度的示例，
图4d示出预确定的在部分区域之内的面的示例，
图4e示出图像传感器在聚焦期间的像素强度的示例，
图5示出最高的强度值有关于相对间距的曲线，
图6示出在极大值有关于相对间距的曲线中的局部的极大值的另一种示例，如按照所述方法的一种实施方式所确定的，
图7a和7b示出在使用在近红外范围中的波长的情况下借助图像传感器检测的反射的激光射线的像素图像，
图7c和7d示出在使用具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器时在检测具有650nm波长的反射的激光射线时所得到的像素图像，
图8示出示例性的色彩滤镜矩阵的不同的色彩通道的透射率，
图9示出组织的示例性的荧光图像作为灰度值图像，其中，灰度值图像的强度基于来自多个色彩通道的强度，
图10示出标明两个组织结构的示例性的荧光图像，
图11示出标明两个组织结构的荧光图像的单纯的绿色份额，
图12示出标明两个组织结构的荧光图像的单纯的红色份额，
图13示出用于执行按照一种优选的实施方式的方法步骤的流程图。
具体实施方式
图1示出显微镜系统或装置V，其中，在载片OT上提供试样区域P。试样区域P具有生物试样。试样区域P被保持在试样支架PH上，该试样支架优选安装在沿Z方向或在其高度方面可移动的桌台TI中。桌台TI和试样支架PH可以被视为组合式单元或组合式试样支架PH、TI。
试样支架PH能沿朝着物镜OB的Z方向沿着物镜的光学轴线OA移动。物镜OB也可以被称为光学单元OE。
在这种在这里示出的示例中，试样支架PH、TI是相对于物镜OB可移动的。替代地，物镜OB也可以是相对于试样支架PH、TI可移动的。可移动性涉及在试样区域P与物镜OB之间的相对间距的调整。换言之：物镜OB和试样区域P或试样支架PH、TI能沿着物镜OB的光学轴线OA相对于彼此移动，以便改变在物镜OB与试样区域P之间的相对间距。
试样区域P具有至少一个界限面。
图2详细示出试样区域2、P。试样区域2包括具有埋入的生物芯片的载片，如更详细地在图2中的示意性侧剖视图中示出的。试样区域2包括载片41，该载片具有带有空隙43的板形结构。在载片41的空隙43中设置有生物芯片45，并且该生物芯片借助粘接剂47安装在载片41上。围绕生物芯片45在空隙43之内填入甘油49。在生物芯片45上施覆(生物)试样51。因此，试样51被埋入甘油49中。覆盖玻璃53覆盖空隙43连同处于该空隙中的用甘油49包围的试样51。覆盖玻璃53具有上面的表面55和下面的表面57，该上面的表面形成第一界限面，该下面的表面形成第二界限面。生物芯片45的表面59形成第三界限面。尤其是，该第三界限面59在按照本发明的一种实施方式的用于聚焦的方法中确定。
当激光射线由物镜聚焦到生物芯片45的表面59(也就是说第三界限面)上时，则占据优选的相对间距(在物镜与试样区域之间的相对的竖直间距)。一旦找到该优选的相对间距，则可以通过读取图像传感器的优选整个探测面来拍摄一个或多个图像，尤其是当试样51例如利用荧光激励的光来照亮时。
所述试样区域可以是在三个维度上伸展的试样区域，该试样区域因此沿两个横向方向伸展以及沿一个垂直于所述两个横向方向的深度方向伸展。(生物)试样尤其是可以在确定的深度下处于试样区域之内，从该试样拍摄经聚焦的图像、尤其是荧光图像。因此，所述方法(和所述显微镜系统)尤其是可以被用于自身免疫病诊断中，其用于评估免疫荧光切片。所述方法和所述显微镜系统尤其是可以支持间接免疫荧光试验(IIFT)。所述方法可以保证对要检验的试样迅速进行处理，这需要对试样的快速聚焦。
所述至少一个界限面可以例如是平面的界限面、例如在固体材料与空气之间的界限面、在固体材料与液体之间的界限面或在固体材料与(有机)试样之间的界限面。所述至少一个界限面的存在可以使聚焦变得容易或提高聚焦的可靠性。
按照本发明的一种实施方式，所述方法构成为，使得至少一个界限面、尤其是两个界限面不与空气邻接，其中，试样区域尤其是包括有机试样，该有机试样靠置在生物芯片上、被埋入液态物质中并且由覆盖玻璃覆盖，其中，此外尤其是覆盖玻璃的上侧形成第一界限面，覆盖玻璃的下侧形成第二界限面，并且生物芯片的表面形成第三界限面。有机试样可以例如包括组织试样，该组织试样例如是被着色部的和/或混有一个或多个荧光标记或荧光分子。荧光标记或荧光分子可以借助预确定的部位或受体或抗原结合在有机试样上。液态物质可以例如包括甘油。有机试样可以例如是湿式有机试样，其中，可以防止试样变干。本发明的实施方式能实现，构成(三维地、也就是说基本上从所有侧)埋入液体中的有机试样。界限面可以通过改变在界限面上方和下方的折射系数来表征。与在从空气过渡至固态介质、例如玻璃的界限面上过渡时相比，在液态介质与固态介质之间的界限面上过渡时，折射系数例如可以更不强烈地改变。折射系数在界限面上改变得越少，在界限面上的反射度就可以越小。尽管在第三界限面上存在相对小的反射，该反射仍可以通过按照本发明的方法来探测到。
按照图1，装置V具有镭射光源或激光源LL，所述镭射光源或激光源产生镭射光或激光射线LS。激光射线LS经由射线分配器SP2朝向物镜OB转向，并且进入物镜OB的光学开口OF中。激光射线尤其是基本上准直的、平行的射线束。射线分配器SP2尤其是如下射线分配器，该射线分配器将入射的光的第一功率份额反射并且使入射的光的第二功率份额透射。
在试样区域P的界限面上被反射返回的镭射光则通过物镜OB通过二向色性的射线分配器SP1和光学滤镜FI2和射线分配器SP2朝着透镜或镜筒透镜TL反射。镜筒透镜TL与物镜一起引起激光射线映射到图像传感器BS上，该图像传感器尤其是光传感器PS。图像传感器BS前置有色彩滤镜矩阵FFM。图像传感器BS和色彩滤镜矩阵FFM优选是相机K的组成部分，该相机优选具有相机光学装置KO。
物镜OB构成为，使得该物镜将平行于彼此地作为平行的光路或准直的、平行的射线束进入该物镜的面向镭射光源LL的光学开口OF中的激光射线投影到在物镜另一侧上的物镜的焦平面的一个点上，其中，该点可以是焦点，或者如果射线束不正好平行于物镜的光学轴线延伸，该点可以是与焦平面中的焦点错开的点。从焦平面中的正好该点、尤其是焦点反射且从那返回进入物镜中的激光射线又在开口侧或光学侧OF上朝着图像传感器BS成形为平行的光路。
如果例如激光射线LS是准直的、平行的射线束，那么物镜OB产生：激光射线以其整个强度投影到物镜的焦平面中的一个点、尤其是焦点上。通过物镜从该点、尤其是该焦点接收的光路(该光路在物镜的另一侧上成束为平行的、准直的光路)则可以借助后置于物镜OB的透镜TL、优选镜筒透镜投影到映射点上，在该映射点上设置图像传感器BS。换言之：物镜OB和镜筒透镜TL引起反射的激光射线映射在图像传感器BS上。
在本申请的意义下，术语焦平面也可以被称为术语焦距平面。尤其是，激光射线LS的横截面直径基本上等于物镜OB的进入开口。该进入开口也可以被称为孔径。
物镜OB可以包括一个或多个透镜，所述透镜可以依次沿着物镜的光学轴线设置。该物镜可以例如提供10倍、20倍或例如40倍放大并且示例性地具有在0.3与0.8之间的数值孔径。平行的、准直的激光射线的直径优选这样确定尺寸，使得显微镜物镜的全孔径被照明。
在激光射线LS是平行的、准直的光路的情况下，激光射线则通过物镜OB投影到焦平面的一个点上，其中，这一个点可以是焦点或者是与焦平面中的焦点错开的点。由此，激光射线的最大光学强度在焦平面中的该点上存在。则在这种情况下或在该示例中，聚焦平面和焦平面叠合。如果通过改变相对间距，试样区域的界限面正好处于该焦平面上，那么被投影到焦平面的该点上的激光射线反射返回至物镜OB，其中，物镜OB和镜筒透镜TL则引起将该反射映射到图像传感器BS的一个点上。则亦即具有特别高的强度的至少一个像素或少量像素处于图像传感器的区域中。
再一次在图3a中示出图像传感器BS。图像传感器BS具有不同的单个像素P11，…，P14。
图像传感器前置有来自图3b的色彩滤镜矩阵FFM。同样示出个别色彩滤镜元件或色彩通道元件P1至P9。相应的色彩通道通过相应的确定的色彩选择来确定，其中，在这里在该实施例中涉及RGB色彩滤镜矩阵。替代地，可设想CMYK色彩滤镜矩阵。例如矩阵元件P1前置于来自图3的图像传感器BS的像素P11。例如色彩滤镜元件P5前置于图3a的像素元件P14。图像传感器BS的一个相应的像素元件优选前置或配设有色彩滤镜矩阵FFM的相应的色彩滤镜元件、尤其是正好一个相应的滤镜元件。
通过所谓的去马赛克法(De-Bayering-Verfahren)可以借助具有来自图3b的前置的色彩滤镜矩阵FFM的来自图3a的图像传感器BS获取彩色图像。
按照图1，装置V还具有用于发出激励光AS的激励光源AL。该激励光AS在其借助二向色性的射线分配器SP1朝着物镜OB并且因此朝着试样区域或者向着试样区域指向之前再一次优选通过光学滤镜FI1过滤。该激励光用于将荧光激励到试样区域P中。激励光源优选是LED、优选是蓝光LED。
生物试样的荧光辐射FS则可以从试样区域P通过物镜OB通过射线分配器SP1返回到达至光学滤镜FI2。光学滤镜FI2优选将激励辐射AS的光滤出。荧光辐射FS然后穿过射线分配器SP2并且从那到达至镜筒透镜TL，该镜筒透镜与物镜OB一起引起映射在图像传感器BS和前置于该传感器的色彩滤镜矩阵FFM上。光学滤镜FI1、光学滤镜FI2以及二向色性的射线分配器SP1的组合也可以被称为光学单元OE2。
换言之：物镜OB构成用于将激光射线向着试样区域指向，并且引起激光射线聚焦在聚焦平面中。图像传感器BS构成用于检测一定量的像素强度值，所述像素强度值通过在试样区域P的界限面上反射的且通过物镜透射返回的激光射线在图像传感器的相对应的传感器像素上产生，其中，激光射线不仅通过物镜OB而且优选还通过透镜或镜筒透镜TL映射在图像传感器BS上。
按照一种实施方式，在物镜OB与探测面之间的探测光路中设置有透镜TL、尤其是镜筒透镜，该透镜将物镜的焦平面映射到图像传感器上。在物镜后面(或在物镜的光流下游)，可以存在平行的光路，并且平行的射线可以由镜筒透镜映射到图像侧的焦平面上。因此，物镜相对于镜筒透镜的移动对平行的射线映射到镜筒透镜的图像侧的焦平面中不产生影响或不产生显著影响。因此，仅从物镜的焦平面中的一个确定的、共同的点、尤其是焦点沿不同方向出发的射线到达探测面的部分区域之内的确定的点上。因此，通过适当地选择预确定的面的大小，可以排除散射光(该散射光不从在物镜的对象侧的焦平面中的一个点沿不同方向出发)被探测到用于聚焦的可能性。
图像传感器BS是光传感器、尤其是CMOS传感器或CCD传感器。色彩滤镜矩阵FFM优选是拜耳矩阵。
色彩滤镜矩阵FFM优选具有多个色彩通道、尤其是具有至少一个绿色通道和红色通道、特别优选还具有蓝色通道。
来自图1的装置V具有处理器P，该处理器可以经由接口SC4借助控制信号ST4操控试样支架PH、TI，从而物镜OB与试样区域P相对彼此具有相应的、不同的相对间距。
借助接口SC2，处理器P构成用于将一个控制信号或多个控制信号SC2发送到相机K或图像传感器BS上，从而通过图像传感器检测像素强度值PW或传感器值SW。图像传感器BS然后将这些像素强度值PW或传感器值SW经由接口SC2提供给处理器P。由此，亦即处理器P借助图像传感器BS针对相应的相对间距检测相应量的像素强度值。处理器P亦即可以使试样支架PH、TI连续地或逐步地移动并且然后可以针对在物镜OB与试样区域P之间的相应的相对间距检测相应的图像或相应量的像素强度值。亦即针对相应的相对间距检测自有的、相应量的像素强度值作为图像传感器的图像或优选作为图像传感器的部分图像。针对相应的相对间距，处理器P基于相应量的像素强度值或基于针对相应的相对间距的相应的图像求取相应的聚焦度规。
替代地，优选可以通过处理器P通过如下方式来调整在试样区域P与物镜B之间的相对间距，即，处理器P经由接口SC6借助控制信号ST6操控物镜OB，使得物镜OB改变其沿着物镜OB的光学轴线OA相对于试样区域P的相对间距。
借助接口SC7，处理器P可以经由控制信号ST7激活或停用该镭射光源LL。
借助接口SC3，处理器P可以经由控制信号ST3激活或停用激励光源AL。
处理器P基于所求取的聚焦度规来确定在物镜OB与试样区域P之间的优选的相对间距。
处理器P然后操控物镜OB和/或试样支架PH，使得调整到所述优选的相对间距，此外激活激励光源AL以及此外借助图像传感器BS检测显微镜的荧光图像作为彩色图像。
通过如下方式在处理器这侧引起检测显微镜的荧光图像作为彩色图像：处理器P经由接口SC2接收图像传感器BS的像素值PW或传感器值SW并且基于这些像素值生成对应的彩色图像。
处理器P不必是装置V的一体式组成部分，该处理器可以与装置在逻辑上脱离，如在图1中通过逻辑分割TR所绘入的。在这种情况下，接口SC2、SC7、SC3、SC6、SC4可以完全地或部分地联合为一个或多个数据接口、尤其是以有线的或非有线的、即无线的方式联合、尤其是以局域网(LAN)接口为形式联合。
优选地，处理器P具有通向网络N的接口SC1。网络N优选是数据网络、例如互联网。
经由接口SC1，处理器P优选可以从网络N接收输入信号ES，该输入信号将执行所提出的方法的请求指示给处理器P，以便引起聚焦并且检测荧光图像作为彩色图像。
优选地，处理器P具有通向输出单元的接口SC5，处理器可以经由该输出单元提供图像数据BD。输出单元AE则可以例如是监视器或显示器，从而图像数据BD可以例如是根据HTMI标准的数字的图像数据。其他图像数据标准是可行的。在一种实施方式中，输出单元AE又可以是网络接口，处理器经由该网络接口借助接口SC5将图像数据BD以数字的形式传输到网络中。接口SC5和接口SC1在输出单元AE是网络接口的情况下也能以一体式的或相同接口的形式来得到。
图4e示出点状的激光反射的总图，如由没有前置的色彩滤镜矩阵的灰度值-图像传感器的整个面针对650nm的波长所拍摄的。整个图像63例如包括1024x1024个像素。
优选地，在物镜OB与试样区域P之间的相对间距改变期间仅读取图像传感器或像素的部分区域。
图4a、4b和4c对此针对不同相对间距示例性地示出部分区域65a、65b、65c和由包含在所述部分区域中的像素所探测到的像素强度值或强度作为反射的激光射线的图像的灰度值。各部分区域65a、65b、65c可以例如由16x16个像素形成。部分区域65a的像素的像素强度值则与针对一个相对间距的一定量的像素强度值相对应。类似内容适用于针对其他相对间距的区域65b或65c。图4a、4b和4c亦即示出如下像素强度或图像，所述像素强度或图像在z＝-0.5μm、z＝0μm和z＝+0.5μm时相对于在物镜与试样区域之间的相对间距而产生，其中，生物芯片45的表面59设置在物镜的焦平面中，从而要确定的相对间距针对z＝0μm来假定。同样示出相应的最高强度值Gmax。如果物镜的焦点平面运动离开载片中的对应的界限面(见图4a、4c)，那么激光信号减弱地或扩宽地映射。由图4a、4b和4c变得清楚的是，在移动约+/-500nm时，各个像素的调节(Aussteuerung)就已经明显减少，也就是说，在正好占据所述优选的相对间距时在部分区域上的最高的像素强度最大、也就是说在图4b的情况下最大。通过使用在这里描述的系统(其中，激光射线聚焦到物镜的焦平面中的焦点上)可以实现z位置的特别精确的方位分辨率。如果面状伸展的且整个的图案被投影到部分区域的多个像素上，那么该图案在理想的聚焦位置中也具有比在这里所使用的激光射线大的空间上的伸展，从而沿z方向的方位分辨率也更粗略或更不精确。如果例如将相应最高的像素强度值考虑作为聚焦度规，那么得到另外的优点：在投影图案时不够的是，仅将部分区域的一个单个的最高的像素强度考虑作为针对聚焦的量度，而是必须将多个像素联合并且必须通过共同地分析多个像素将相对于所述面状图案的聚焦确定作为针对聚焦的量度，这比考虑图像传感器的或其部分区域的最高的或最大的像素强度明显耗费更多时间。
图4d示例性地示出一种优选使用的预确定的面或部分区域66，在该部分区域中，检测并且分析评价强度值，以便优选求取针对该区域65a、65b、65c的最高的或最大的像素强度值。
对于每个针对确定的相对间距画上的部分图像可以优选求取最高的像素灰度值或最高的强度值。通过了解发送至桌台装置TI37的请求信号ST4，处理器P可以将相机数据或强度值与有关的相对间距相关联以及此外可以确定优选的相对间距。
激光射线的在图4a、4b、4c以及4e中所示出的反射作为图像传感器的像素值针对如下情况构成：没有色彩滤镜矩阵前置于图像传感器并且由此通过色彩滤镜矩阵的不同的部分区域不改变650nm波长的反射的激光射线的像素强度。
图7c和7d示出在使用具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器时使用635nm的激光波长的情况下所得到的示例性的像素强度值。在图7c中，对于容易散焦的情况，示出所得到的分布到像素区域上的强度分布。可清楚看到，不是对于所有像素得到要期待的强度，而是确定的像素在一定程度上是隐没的，因为这些像素处于如下色彩滤镜元件后面，所述色彩滤镜元件不配设给红色通道并且因此不可充分地透射635nm波长的光。
图7d示出在使用具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器时针对聚焦的情况所得到的像素强度值。与图4b相反，在这里不能看到具有反射的激光射线的高的强度的清晰点，而是在这里在图7d中个别像素在一定程度上也是隐没的。确定的像素在检测所产生的像素强度值作为对反射的激光射线的代表的过程中的这种隐没可消极地作用于要确定的聚焦度规。换言之：图7c和7d的所得到的像素强度值经受人为干扰，所述人为干扰由于色彩滤镜矩阵的不同色彩通道的不同透射率来引起。这些人为干扰对于要确定的聚焦度规产生影响，从而所述优选的相对间距的确定结果可能变差或出错。最终结果则可能是，对于荧光图像的检测不存在足够的聚焦。
一种示例性的聚焦度规可以是在部分区域之内的最高的或最大的像素强度值，如该像素强度值在图7c或7d中所示出的。替代地，在这里所提及的聚焦度规可以例如基于一个或多个如下算子：在所选出的图像区域中的像素强度的加权平均值、对像素强度的半值宽度的分析评价、对像素强度的边缘图像的极大值或平均值的分析评价。边缘图像尤其是可以借助如下算子：Prewitt算子、Sobel算子、高斯拉普拉斯/Marr-Hildreth算子或高斯差分之中的一个算子来获取。这种算子相对人为干扰尤其是易受影响或敏感的，如其在图7c和7d中可见的。
图7a和图7b示出在使用来自图1的图像传感器和色彩滤镜矩阵时附加地使用在近红外范围中的激光、尤其是在850nm时的激光的情况下所得到的像素强度值。对于图7a的容易散焦的情况，可清楚看到的像素强度的要期待的分布，如之前在图4a中也示出的。在这里现在能够稳固且可靠地求取聚焦度规。
图7b对于几乎精确的聚焦的情况示出清晰地反射的激光射线，其在中间区域中具有强烈的强度，如以类似的设计之前也在图4b中所示出的。
按照本发明的解决方案在使用图像传感器和前置的色彩滤镜矩阵的情况下允许基于激光射线的波长在近红外范围中的选择在相应的相对间距上获取相应的图像或相应量的像素强度值，如所述图像或像素强度值在图7a和7b中所示出的，并且然后可靠且稳固地为了确定针对相应的相对间距的相应的聚焦度规而基于相应的图像或相应量的像素强度值来确定。
当试样区域P相对于来自图1的物镜OB的光学轴线OA不完全垂直地取向时，则尤其是可产生缺少反射的激光射线相对于色彩滤镜矩阵的部分区域的取向的问题。在试样区域P相对于物镜OB的光学轴线OA稍微倾翻的这种情况中可能发生的是，反射返回的激光射线LS(该激光射线朝着图像传感器BS导引)稍微相对于色彩滤镜矩阵FFM的平面倾斜。
如果在试样区域P与物镜OB之间的相对间距逐段地或逐步地亦或连续地改变，那么可能发生的是，激光射线LS入射到色彩滤镜矩阵FFM上，使得对于不同的相对间距，激光射线分别打到不同的部分区域P1，…，P9，然后根据在物镜OB与试样区域P之间所调整到的相应的相对间距，强度不同地透射通过色彩滤镜矩阵FFM的不同的部分区域P1，…，P9。
这通过本发明通过如下方式来补偿：总是还能使用一个具有前置的色彩滤镜矩阵FFM的图像传感器BS，因为选择了具有在近红外范围中的波长的激光。
图8示出对于示例性的色彩滤镜矩阵针对相应的色彩通道的透射率T1、T2、T3。透射率T1表明蓝色通道，透射率T2表明绿色通道，透射率T3表明红色通道。在这里所使用的具有色彩滤镜矩阵的图像传感器优选是型号为SONY IMX250的传感器。
所绘入的是650nm的波长WA。在该波长WA上，色彩滤镜元件如来自图3b的元件P8不被充分地透射，从而在使用具有前置的色彩滤镜矩阵FFM的图像传感器BS时在激光的这种波长WA下必须在单独的红色通道中使用单独的图像传感器。
本发明避免这个，因为使用处于从780nm的波长W1起的、优选从800nm的波长W2起直至1000nm的波长W3的范围中的激光的波长。如由图8可见的，尤其是从波长W2起，在相应的色彩通道中的色彩滤镜元件的透射率足够高，从而借助此外更加详细地解释的像素强度值的缩放或各个色彩通道信息的缩放能够确定反射的激光射线的图像，如在图7a和7b中所示出的。特别有利的是使用在来自图8的波长W3中850nm的波长，因为在这里可能可以取消对各个色彩通道信息的缩放，因为各个色彩通道的透射率差足够小。
优选借助针对相应的色彩通道检测相应的部分量的像素强度值来针对相应的相对间距检测相应量的像素强度值，其中，相应量的像素强度值基于所述部分量来求取。图像传感器优选为每个色彩通道提供相应的部分量的像素或相应的部分量的像素强度值，其中，对于每个像素或每个像素强度值一同给出所述像素或像素强度值的二维的空间位置。因此，来自图1的处理器则可以由所述部分量求取或构成所述量的像素强度值。在此，处理器可以为相应的色彩通道提供对应的缩放因数、尤其是借助存储单元为相应的色彩通道提供对应的缩放因数，从而在处理器由所述部分量求取或构成所述量的像素强度值之前，首先将确定的色彩通道的部分量的像素强度值乘以确定的、配设给该色彩通道的缩放因数。亦即，利用预定的缩放因数给相应的部分量的像素强度值加权，该缩放因数取决于，所述相应的部分量的像素强度值属于哪一类型的色彩通道。由此，能够平衡在激光的波长上色彩滤镜矩阵的各个色彩通道的透射率差。
优选地，来自图像传感器的部分区域的最高的强度值可以被用作聚焦度规。亦即优选可以在图像传感器的部分区域中以优选的方式简单地设置(abstellen)到在所述部分区域之内的最高的强度值，以便获得针对试样区域的聚焦度规或聚焦的量度。则在这种优选的情况中基于在这里所描述的对最高的像素强度值的使用不需要进一步处理或过滤图像传感器的有时许多的像素强度值或图像传感器的部分区域，而是仅须确定，哪个像素强度值是在图像传感器或所观察的部分区域之内在对应的相对间距上对应的最高的强度值。在此，则不重要的是，哪个像素探测到强度值的极大值，从而所述方法是特别快速的。如果试样区域相对于物镜继续移动到另一个相对间距，那么激光射线不是在一个单个的点上反射(该点在上文是在焦平面中的点并且尤其是焦点)，而是在试样区域或界限面的面状区域中进行反射。由此，亦即与当激光射线仅在焦平面的唯一一个点上反射时的情况相比，激光射线的光学强度则分布到部分区域的更大的区域上。因此，则在图像传感器上的部分区域之内也产生如下强度值，所述强度值虽然总共地还代表或还可以代表激光射线的总光学强度，但是现在最高的强度值也小于在激光射线借助界限面正好在焦平面的一个点中被反射的配置方案中的最高的强度值。亦即通过分析评价部分区域或该部分区域的像素不必设置例如借助光圈对反射的图案进行精确滤出，而是针对相应的相对间距对最高的强度值的分析评价允许特别简单且快速地聚焦或确定具有特别高的方位分辨率的参考相对移动位置。在存在多个界限面的情况下，借助最高的强度值的曲线则可以例如探测第三界限面，以便求取优选的相对间距。亦即，因此可以提高所述方法的灵敏度并且所映射的激光射线沿深度方向的伸展可以基本上等于光学装置的焦深。
图5示出的根据相对间距(针对每个相对间距)所确定的最高的像素强度值的曲线67作为坐标系中的曲线67的示例，其中，在横坐标69上绘制相对间距(Z位置)，并且在纵坐标71上绘制在有关的相对间距下在部分区域中的相应最高的像素强度值。最低的Z值在此指示如下位置，在该位置中，试样区域处得离物镜最远，最高的Z值在此指示如下位置，在该位置中，试样区域处得离物镜最近。首先通过在第一间距分辨率的情况下从最大间距出发朝着最小间距减小在物镜与试样区域之间的相对间距使物镜和试样区域彼此相对移动，其中，确定最高的像素强度值的曲线，该曲线具有多个极大值。该曲线尤其是具有该曲线的局部的第一极大值73，然后具有其局部的第二极大值75并且最后具有其局部的第三极大值77。
曲线67示出有代表性的信号图案(“自动聚焦信号”)，该信号图案作为如在图2中所示出的试样区域的几何结构的基础。因为试样区域2的构造已知，因此可以由信号曲线67确定生物芯片45的Z位置、尤其是确定生物芯片45的表面59。
曲线67(自动聚焦信号)具有第一极大值73，该第一极大值由激光射线19在第一界限面55(覆盖玻璃53的上面的表面)上反射而产生。此外，曲线67具有第二极大值75，该第二极大值由激光射线19从覆盖玻璃53的下面的表面57(第二界限面)反射而产生。最后，曲线67具有第三极大值77，该第三极大值由激光射线19从生物芯片45的表面59(第三界限面)反射而产生。在此，生物芯片表面59的聚焦位置或相对间距通过确定第三信号极大值77的Z位置79来得到。
借助控制装置或处理器和用于移动物镜3的驱动器件，物镜3可以接着在物镜与试样区域之间的间距增大的情况下又朝向所求取的聚焦方位或优选的相对间距回移。所述优选的相对间距则尤其是暂时优选的相对间距。这尤其是在使用第二间距分辨率的情况下实现，该第二间距分辨率比第一间距分辨率更高或更细。在此，经由自动聚焦信号来控制移动的长度，使得与沿Z运动同时地进行监测和分析评价。在此，在相应的、另外的相对间距上确定相应另外的最高的像素强度值以及基于所述另外的最高的像素强度值探测来自图6的极大值82的存在。优选地，在激光射线具有朝着物镜的准直的、平行的射线束并且此外激光射线的聚焦平面与物镜的焦平面叠合的情况下，则将最终相对间距调整至如下这种最终位置，在该最终位置上存在有或存在过基于所述另外的最高的像素强度值所探测的局部的极大值。
对此，图6示出自动聚焦信号，该自动聚焦信号由激光射线19从生物芯片45的表面59反射而产生、即在曲线中在位置85上的第三极大值82。在部分区域中的另外的最高的强度值有关于在横坐标83上的Z位置的曲线81在使用具有20倍放大同时具有0.5的数值孔径的物镜的情况下确定，其中，使用具有λ0＝635nm的发射波长的激光。该信号81的轴向分辨率可以例如由半值宽度Δ确定为约2.1μm。最终的优选的相对间距85可以例如被确定为Z位置，在该Z位置中出现极大值82，或者可以被确定作为曲线81的重点或极大值82的重点。物镜然后可以相对于试样区域移动至所述最终的优选的相对间距85，在该最终的优选的相对间距上存在过所述另外的最高的强度值的极大值82。
当如下条件优选被共同满足时，聚焦位置作为最终的优选的相对间距优选被认为已实现，并且优选停止移动运动：
-已高于自动聚焦信号的之前限定的阈值。该阈值由之前求取的自动聚焦信号的信号高度来求取。
-自动聚焦信号达到局部的极大值82。
然而，生物芯片的表面不必代表对于荧光显微镜的优化的成像平面，因为试样51的层厚可部分地大于显微镜系统的焦深。因此，围绕所求取的聚焦位置或所求取的最终的优选的相对间距可以进行多个荧光拍摄。因此，则可以优选从所述最终的优选的相对间距出发借助图像传感器检测试样区域的多个图像。在此，物镜和试样区域相对彼此的相对间距沿着光学轴线在所述最终的优选的相对间距之上和/或之下的相应的相对间距上改变。在此，此外借助图像传感器在相应的相对间距上检测相应的图像。然后，处理器存储相应的图像并且针对相应的图像确定相应的聚焦度规。然后，处理器挑选具有最佳的聚焦度规的图像。优选地，处理器不采纳其他不具有最佳聚焦度规的图像。
如由图5得知的，各极大值具有确定的图案的信号高度。如果局部的极大值77的信号高度大于之前确定的或预定的阈值并且当此外确实存在局部的极大值时、也就是说当在所述优选的相对间距79右边和左边的强度值小于正好在所述优选的相对间距时的强度时，由所述曲线可以优选识别出第三极大值77、例如作为可靠探测的第三极大值。因此，优选能以可靠的方式求取所述优选的相对间距，在所述优选的相对间距上激光射线聚焦到生物芯片的表面上。为了可以将各极大值73、75和77可靠相互分开，按照本发明的一种实施方式，自动聚焦系统的分辨率约等于显微镜系统的焦深。通过分析评价最大像素强度或最高的像素强度可以得到所述聚焦方法沿Z方向的高的方位分辨率。
按照本发明的一种实施方式，所述方法构成为，使得在物镜与试样区域之间的相对间距从最大间距出发首先减小，同时检测部分区域的像素的强度值，从而尤其是首先由激光射线从第一界限面反射来产生地探测出局部的第一极大值，在这之后由激光射线从第二界限面反射来产生地探测出局部的第二极大值并且最后由激光射线从第三界限面反射来产生地探测出局部的第三极大值。局部的第一极大值可以是极大值有关于相对间距的曲线的全局极大值。如果所有三个(局部的)极大值在极大值有关于相对间距的曲线中被探测到，那么可以改进聚焦的可靠性。当高于像素强度的确定阈值时，在极大值有关于相对间距的曲线之内则可以例如确定(局部的)极大值。该阈值可以例如由之前探测出的(局部的)极大值导出。局部的第一极大值可以大于局部的第二极大值，并且局部的第二极大值又可以大于局部的第三极大值或和局部的第三极大值基本上大小相同。如果探测到这一序列极大值，那么可以提高界限面的识别的可靠性，并且因此可以提高聚焦确定的可靠性。亦即，所述优选的相对间距则基于第三极大值来确定。
图9示出组织的示例性的荧光图像作为灰度值图像，其中，灰度值图像的强度基于来自多个色彩通道的强度、尤其是来自绿色通道、红色通道和蓝色通道的强度。所示出的是在潜伏期之后带有患者血清和次级抗体的鼠肾的荧光图像，该荧光图像用荧光颜料来标记。
对于要进行检验的用户或医生而言，则尤其重要的是知道哪个亮度值或强度值来源于哪个色彩区域或色彩空间。
在图10中示出来自图9的相同的荧光图像，其中，此外以框出的方式绘入两个结构SK1、SK2，这两者在一定程度上具有一定的亮度或以一定亮度发光。
这种发光一方面可以通过激励结合在组织中的荧光颜料来引起。替代地或附加地，也可以存在处于棕色或橙色区域中的、亦即具有红色份额的组织的所谓的自动荧光，所述自动荧光独立于次级抗体的荧光颜料在组织中的结合。此外，组织的一个区域也可以通过如下方式来发光，即，使激励光源的光反射通过该组织。
图11示出来自图9和10的相同图像的单纯的绿色通道信息。清楚可见的是，与对于结构SK2这种情况相比，在绿色通道中的或具有绿色份额的结构SK1更强地发光。
图12示出来自图9和10的相同图像的单纯的红色通道信息。在这里可见的是，在红色通道中的或具有红色份额的结构SK1和结构SK2都在大约相同的程度上发光。
由此，亦即可以明确的是，在图9和10中以类似强度发光的结构SK1和SK2基于不同的色彩份额进行发光。结构SK1确切地说通过其绿色份额主导，而两个结构SK1和SK2以红色份额在大约相同的程度上发光。对于检验者而言有利的是，使组织或荧光图像的全色彩信息作为具有红色份额和绿色份额的彩色图像展现地得到，以便然后可以在彩色图像中基于不同的着色部推断出，所述发光或荧光是
-单独基于自动荧光的荧光，还是
-自动荧光与基于将结合来自患者血清的特定抗体与结合以荧光颜料标记的次级抗体相联合所产生的荧光而共同产生的荧光。
因此，按照本发明的方法以及按照本发明的装置是特别有利的，因为借助一个图像传感器和色彩滤镜矩阵一方面可以检测荧光图像作为具有绿色份额和红色份额的数字的彩色图像，而同时也可以在不使用另一个图像传感器的情况下借助具有前置的色彩滤镜矩阵的相同的图像传感器来检测激光射线的反射，以便引起聚焦，因为所述激光具有在近红外范围中的波长。
图13示出处理器按照一个优选的实施方式执行的步骤的流程图。
在步骤S1中，处理器提供控制信号ST7以用于激活镭射光源。在步骤S2中，处理器提供控制信号ST4和/或ST6以用于操控物镜和/或试样支架，从而物镜与试样支架相对彼此具有相应的、不同的相对间距。在步骤S3中，处理器针对相应的相对间距检测相应量的像素强度值，其方式为，所述处理器从具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器针对相应的相对间距接受相应量的像素强度值。
优选地，在步骤S3中尤其是通过针对对应的相对间距检测相应的色彩通道的相应的部分量的像素强度值来检测相应量的像素强度值。为此，处理器从图像传感器接受相应的色彩通道的相应的部分量的像素强度值。处理器然后通过以与色彩通道有关的方式缩放像素强度值并且通过由经缩放的、相应的部分量的像素强度值组合得到所述量的像素强度值基于相应的色彩通道的相应的部分量的像素强度值来求取相应量的像素强度值。
在步骤S4中，处理器针对相应的相对间距基于针对相应的相对间距所检测的或所确定的相应量的像素强度值确定相应的聚焦度规。
在步骤S5中，处理器经由控制信号ST4和/或控制信号ST6调整到所述优选的相对间距。在步骤S6中，处理器借助控制信号ST3激活激励光源。
在步骤S7中，处理器从图像传感器接受像素强度值并且因此借助图像传感器确定或检测显微镜的荧光图像，
应理解为，按照本发明的实施方式，单独地或任意组合地关联于用于拍摄试样区域的图像的方法所描述、解释或设置的特征可以同样良好地单独地或任意组合地应用于用于拍摄试样区域的图像的显微镜系统。
根据确定的实施要求，本发明的实施例可以将处理器以硬件的方式和/或以软件的方式实现。在这里提及的处理器在这里可以作为至少一个单元来实现或者可以通过多个单元复合在一起来实现。所述实施可以在使用数字的存储介质、例如软盘、DVD、蓝光碟、CD、ROM、PROM、EPROM、EEPROM或快闪存储器、硬盘或其他的磁或光学存储器的情况下执行，在所述数字的存储介质上存储电子可读的控制信号，所述控制信号与可编程的硬件部件共同作用或可以共同作用，使得相应的方法得到执行。可编程的硬件部件可以作为控制单元通过计算机处理器(CPU＝Central Processing Unit，中央处理单元)、计算机、计算机系统、专用集成电路(ASIC＝Application-Specific Integrated Circuit)、集成电路(IC＝Integrated Circuit)、单芯片系统(SOC＝System on Chip，片上系统)、可编程的逻辑元件或具有微处理器的现场可编程门阵列(FPGA＝Field Programmable Gate Array)来形成。数字的存储介质因此可以是机器可读或计算机可读的。一些实施例也包括数据载体，该数据载体具有电子可读的控制信号，所述控制信号能够与可编程的计算机系统或可编程的硬件部件共同作用，使得在此描述的方法之中的一个方法得到执行。一般而言，本发明的实施例或部分实施例可以实施为程序、固件、计算机程序或具有程序代码的计算机程序产品或实施为数据，其中，程序代码或数据如下地起作用，使得当程序在处理器或可编程的硬件部件上运行时，执行所述方法中的一个方法或执行一个方法的一部分。

Claims (21)

1.用于拍摄具有生物试样的试样区域(P)的显微镜的荧光图像的方法，该方法具有：
-将激光射线(LS)借助至少一个物镜(OB)向着所述试样区域(P)指向，该试样区域具有至少一个界限面，其中，所述物镜(OB)引起所述激光射线(LS)聚焦在聚焦平面中，
-沿着所述物镜(OB)的光学轴线(OA)改变在所述物镜(OB)与所述试样区域(P)之间的相对间距以用于产生相应的、不同的相对间距，
-针对相应的相对间距，
检测相应量的像素强度值，所述相应量的像素强度值通过在界限面上反射的且通过所述物镜(OB)透射返回的激光射线(LS)在图像传感器(BS)的相对应的传感器像素上产生，
以及此外基于针对所述相应的相对间距所检测的相应量的像素强度值确定相应的聚焦度规，
-基于所求取的聚焦度规来求取优选的相对间距，
-调整到所述优选的相对间距，利用激励辐射(AS)照亮所述试样区域(P)以及借助所述图像传感器(BS)检测显微镜的荧光图像，
其特征在于，
-所述图像传感器(BS)是具有前置的色彩滤镜矩阵(FFM)的光传感器(PS)，
所述色彩滤镜矩阵是具有多个色彩通道的矩阵，
所述色彩滤镜矩阵还具有针对不同色彩通道的不同滤镜元件型式，
并且所述色彩滤镜矩阵此外在所有其不同的色彩通道中对于波长大于780nm的近红外范围的光而言是透射的，
-所述显微镜的荧光图像是彩色图像，
-并且所述激光射线(LS)具有在从780nm开始的近红外范围中的波长(WB)。
2.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述显微镜的荧光图像是数字的彩色图像。
3.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述波长大于800nm。
4.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述波长处于780nm至1000nm的范围中。
5.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述矩阵具有至少一个绿色通道和红色通道。
6.根据权利要求5所述的方法，
其特征在于，所述色彩滤镜矩阵(FFM)是拜耳矩阵。
7.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述光传感器(PS)是CMOS传感器或CCD传感器。
8.根据权利要求1所述的方法，
其中，通过检测相应的色彩通道的相应的部分量的像素强度值来针对相应的相对间距检测相应量的像素强度值，并且基于所述部分量的像素强度值求取所述相应量的像素强度值。
9.根据权利要求8所述的方法，
其特征在于，相应的色彩通道在所述激光射线(LS)的波长上具有相应的彼此最大相差为5的因数的透射率。
10.根据权利要求1所述的方法，
其中，所述激光射线(LS)基本上具有准直的、平行的射线束。
11.根据权利要求1所述的方法，
其中，在所述物镜(OB)与所述图像传感器(BS)之间的探测光路中设置有透镜或透镜系统(TS)，所述透镜或所述透镜系统将所述物镜(OB)的焦平面映射到所述图像传感器(BS)上。
12.根据权利要求1所述的方法，
该方法还具有
-基于相应量的像素强度值将相应最高的像素强度值确定作为针对相应的相对间距的相应的聚焦度规，
-通过将所述相应最高的像素强度值配设给相应的相对间距来确定各最高的像素强度值的曲线(73)，
-借助各最高的像素强度值的曲线(73)的至少一个极大值来确定所述优选的相对间距。
13.根据权利要求12所述的方法，
该方法还具有
-在使用第一间距分辨率的情况下通过从最大间距出发朝着最小间距减小相对间距来改变所述相对间距，从而所述曲线具有多个极大值，
-基于所述多个极大值确定暂时优选的相对间距(79)，
-在使用高于所述第一间距分辨率的第二间距分辨率的情况下朝着所述暂时优选的相对间距增大所述相对间距，同时检测相应的另外的最高的像素强度值(81)作为在相应的、另外的相对间距上的相应的聚焦度规，
-基于所述另外的最高的像素强度值(81)探测局部的极大值的存在并且确定最终的优选的相对间距作为存在所述局部的极大值的相对间距。
14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述显微镜的荧光图像是非单色的、数字的彩色图像。
15.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述数字的彩色图像具有至少一个绿色份额和红色份额。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述数字的彩色图像还具有蓝色份额。
17.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述波长等于或大于850nm。
18.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述波长处于800nm至1000nm的范围中。
19.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述矩阵此外也具有蓝色通道。
20.显微镜系统(V)，其用于拍摄具有生物试样的试样区域(P)的显微镜的荧光图像，所述显微镜系统具有：
试样支架(PH)，以用于保持所述试样区域(P)，所述试样区域具有至少一个界限面；
激光源(LL)，以用产生激光射线(LS)；
激励光源(AL)，以用于发出激励光到所述试样区域(P)上；
至少一个物镜(OB)，该物镜构成用于使所述激光射线(LS)向着所述试样区域(P)指向并且此外引起所述激光射线(LS)聚焦在聚焦平面中；以及
图像传感器(BS)，以用于检测一定量的像素强度值，所述像素强度值通过在界限面上反射的且通过所述物镜(OB)透射返回的激光射线(LS)在所述图像传感器(BS)的相对应的传感器像素上产生，
其中，所述物镜(OB)和所述试样支架(PH)能沿着所述物镜(OB)的光学轴线(OA)相对于彼此移动，从而能够改变在物镜(OB)与试样区域(P)之间的相对间距，
此外，所述显微镜系统具有至少一个处理器，该处理器构成用于，
-操控所述物镜(OB)和/或所述试样支架(PH)，使得所述物镜(OB)与所述试样支架或所述试样区域(P)相对彼此具有相应的、不同的相对间距，
-针对相应的相对间距借助所述图像传感器(BS)检测相应量的像素强度值，并且此外基于所述相应量的像素强度值求取相应的聚焦度规，
-基于所求取的聚焦度规确定优选的相对间距，
-操控所述物镜(OB)和/或所述试样支架(PH)，使得调整到所述优选的相对间距，此外激活所述激励光源(AL)以及借助所述图像传感器(BS)检测显微镜的荧光图像，
其特征在于，
-所述图像传感器(BS)是具有前置的色彩滤镜矩阵(FFM)的光传感器，
所述色彩滤镜矩阵是具有多个色彩通道的矩阵，
所述色彩滤镜矩阵还具有针对不同色彩通道的不同滤镜元件型式，
并且所述色彩滤镜矩阵此外在所有其不同的色彩通道中对于波长大于780nm的近红外范围的光而言是透射的，
-所述显微镜的荧光图像是彩色图像，
-并且所述激光射线(LS)具有在从780nm开始的近红外范围中的波长(WB)。
21.处理器，
其具有一个或多个接口，
其中，所述处理器构成用于经由所述一个或多个接口
-提供第一控制信号以用于激活镭射光源，
-提供第二控制信号以用于操控物镜(OB)和/或试样支架(PH)，从而所述物镜与所述试样支架相对彼此具有相应的、不同的相对间距，
-从具有前置的色彩滤镜矩阵的图像传感器针对相应的相对间距接受相应量的像素强度值，
-所述色彩滤镜矩阵是具有多个色彩通道的矩阵，所述色彩滤镜矩阵还具有针对不同色彩通道的不同滤镜元件型式，并且所述色彩滤镜矩阵此外在所有其不同的色彩通道中对于波长大于780nm的近红外范围的光而言是透射的，
所述处理器还构成用于此外基于所述相应量的像素强度值求取相应的聚焦度规以及基于所求取的聚焦度规确定优选的相对间距，
所述处理器构成用于经由所述一个或多个接口
-提供第二控制信号或另外的控制信号以用于操控所述物镜(OB)和/或所述试样支架(PH)，使得调整到所述优选的相对间距，
-此外提供第三控制信号以用于激活激励光源(AL)，
-以及从所述图像传感器接受像素强度值，
所述处理器还构成用于基于所接受的像素强度值来确定显微镜的荧光图像，
其特征在于，所述显微镜的荧光图像是彩色图像，并且所述镭射光源具有在从780nm开始的近红外范围中的波长。
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