BR102019026948A2

BR102019026948A2 - processo e sistema de microscopia para tomada de uma imagem fluorescente microscópica de uma região de amostra com uma amostra biológica

Info

Publication number: BR102019026948A2
Application number: BR102019026948-0A
Authority: BR
Inventors: Martin Hagen-Eggert; Tilman Johannes Sumpf
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2021-02-23
Also published as: US11199500B2; CN111352228B; CN111352228A; US20200200682A1; ES2912473T3; PL3671309T3; BR102019026948B1; EP3671309B1; EP3671309A1

Abstract

É proposto um processo para tomada de uma imagem fluorescente microscópica de uma região de amostra. Um raio laser é dirigido por meio de ao menos uma objetiva para a região de amostra, que apresenta ao menos uma área limítrofe. Uma distância relativa entre a objetiva e a região de amostra é alterada ao longo de um eixo óptico da objetiva, para produzir respectivas distâncias relativas distintas. Para uma respectiva distância relativa ocorre então uma detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel, que são produzidos pelo raio laser refletido na área limítrofe e retransmitido pela objetiva em correspondentes pixels sensores de um sensor de imagem. Além disso, para uma respectiva distância relativa ocorre uma determinação de uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel detectada para a respectiva distância relativa. Ocorre além disso uma determinação de uma distância relativa preferida com base nas métricas de foco determinadas. Finalmente, ocorre um ajuste da distância relativa preferida, uma iluminação da região de amostra com uma radiação de excitação bem como uma detecção da imagem fluorescente microscópica por meio do sensor de imagem, especialmente na distância relativa preferida ou quando do ajuste de uma distância relativa preferida.

Description

PROCESSO E SISTEMA DE MICROSCOPIA PARA TOMADA DE UMA IMAGEM FLUORESCENTE MICROSCÓPICA DE UMA REGIÃO DE AMOSTRA COM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA

[0001] Do estado atual da técnica são conhecidos processos bem como dispositivos, em que por meio de um raio laser é realizada uma focalização para uma câmera ou um sensor de imagem com relação a uma região de amostra com uma amostra biológica e sendo que então é detectada uma imagem fluorescente da região de amostra.

[0002] Especialmente é conhecido um processo, em que com um raio laser com um comprimento de onda de por exemplo 635 mm é detectada uma reflexão em um assim chamado canal vermelho com uma primeira câmera ou um primeiro sensor de imagem, para se realizar um ótimo alinhamento ou um ótimo distanciamento da região de amostra de uma objetiva do microscópio para efeito de uma focalização. Com uma outra câmera em um canal verde é detectada uma imagem fluorescente da região de amostra com a amostra biológica. Podem, então, portanto ser detectadas imagens fluorescentes verdes em um canal verde, que não apesenta frações vermelhas.

[0003] A DE102008015885A1 descreve um processo para autofocalização de aparelhos ópticos, em que para tanto são tomadas imagens com anéis concêntricos, cujo diâmetro se altera em função de uma distância da posição de foco a ser determinada.

[0004] A WO2016/133787A1 descreve um processo e um sistema para automática focalização de um microscópio, sendo que um valor de pico de um raio laser refletido é empregado como indício para um grau de uma focalização do sistema.

[0005] Constitui objetivo da presente invenção disponibilizar um sistema e um processo para tomada de uma imagem fluorescente microscópica com focalização automática, que seja particularmente poderosa.

[0006] O objetivo de acordo com a invenção é alcançado pelo processo proposto para tomada de uma imagem fluorescente microscópica de uma região de amostra com uma amostra biológica. Um raio laser é dirigido por meio de ao menos uma objetiva para a região de amostra, que apresenta ao menos uma área limítrofe, sendo que a objetiva produz uma focalização do raio laser em um plano de focalização. Uma distância relativa entre a objetiva e a região de amostra é alterada ao longo de um eixo óptico da objetiva, para produzir respectivas distâncias relativas distintas. Para uma respectiva distância relativa ocorre então uma detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel, que são produzidos pelo raio laser refletido na área limítrofe e retransmitida pela objetiva em correspondentes pixels sensores de um sensor de imagem. Além disso, para uma respectiva distância relativa ocorre uma determinação de uma respectiva métrica de foco com base na respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel detectada para a respectiva distância relativa. Ocorre, além disso, uma determinação de uma distância relativa preferida com base nas métricas de foco determinadas. Finalmente, ocorre um ajuste da distância relativa preferida, uma iluminação da região de amostra com uma radiação de excitação bem como uma detecção da imagem fluorescente microscópica por meio do sensor de imagem, especialmente na distância relativa preferida ou quando do ajuste de uma distância relativa preferida.

[0007] O processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o sensor de imagem é um fotosensor com uma matriz de filtro de cor anteposta, sendo que ainda a imagem fluorescente microscópica é uma imagem em cores, especialmente uma imagem em cores não-monocromática, e sendo que o raio laser apresenta um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo.

[0008] O processo proposto de acordo com a invenção permite detectar uma imagem fluorescente da região de amostra como uma imagem a cores, sendo que apenas um único sensor de imagem precisa ser empregado para a detecção da imagem e para a operação da focalização, pois ao sensor de imagem está anteposta uma matriz de filtro de cor. Esse sensor de imagem com a matriz de filtro de cor anteposta ao sensor de imagem pode precisamente também ser empregada simultaneamente para a detecção de valores de intensidade de pixel durante a focalização, pois o laser apresenta um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo.

[0009] A faixa de infravermelho próximo é uma faixa de infravermelho não visível para o ser humano e é uma faixa de comprimento de onda, em que resulta uma especial cooperação da matriz de filtro de cor com o raio laser, como mais precisamente explicado a seguir.

[0010] Segundo o estado atual da técnica é usual detectar um laser com um comprimento de onda de por exemplo 635 nm em um canal de vermelho separado com um sensor de imagem separado ou uma câmera e um filtro de cor óptico separado. Se fosse empregado um raio laser com um comprimento de onda de 635 nm em combinação com o um sensor de imagem ou fotosensor em combinação com uma matriz de filtro de cor para a operação da focalização, então não seria incondicionalmente garantido que o raio laser incidisse em áreas da matriz de filtro de cor, que sejam suficientemente transmissíveis para luz vermelha desse comprimento de onda de 635 nm. Uma matriz de filtro de cor consiste, usualmente, em distintos tipos de elemento de filtro para distintos canais de cor, especialmente ao menos dos tipos canal vermelho e canal verde, particularmente de preferência ainda também do tipo canal azul. A matriz de filtro de cor é então composta de uma disposição bidimensional de uma pluralidade de elementos de filtro de cor, sendo que em uma direção de disposição elementos de filtro de cor entre si diretamente vizinhos são respectivamente de um tipo distinto de elemento de filtro. Portanto, com uma matriz de filtro de cor não pode ser assegurado que o raio laser incida em um elemento de filtro de um canal de cor adequado ou do canal vermelho da matriz de filtro de cor e então seja suficientemente transmitido ao sensor de imagem. Por isso um emprego de um tal laser a 630 nm em combinação com o sensor de imagem e a matriz de filtro de cor para a focalização seria problemática, pois poderia levar a uma indesejada supressão da luz do laser por determinadas áreas ou elementos de filtro da matriz de filtro de cor.

[0011] Devido ao fato de que, de acordo com a invenção, é empregado um raio laser na faixa de infravermelho próximo e que o sensor de imagem possui a matriz de filtro de cor anteposta, é aproveitado um efeito surpreendente: matrizes de filtro de cor usuais no comércio podem ser suficientemente transmissível para luz na faixa de infravermelho próximo em todos os seus canais ou em todas as suas áreas parciais de distintos canais, especialmente para um comprimento de onda maior do que 780, de preferência maior do que 800 nm, especialmente igual ou maior do que 850 nm.

[0012] Com isso, portanto, tanto para a detecção da imagem fluorescente em forma de uma imagem de cor como também para a focalização por meio do raio laser pode ser empregado o mesmo sensor de imagem, embora ao sensor de imagem seja anteposta uma matriz de filtro de cor. Devido ao fato de que a imagem fluorescente é detectada como uma imagem de cor, é também precisamente possível que ao usuário possa ser apresentada uma imagem que não apresenta descolorações e/ou fluorescência em um único canal verde, mas sim descolorações e/ou fluorescência de outras faixas de cor ou canais de cor como por exemplo um canal vermelho. Imagens fluorescentes de amostras biológicas, como por exemplo tecidos biológicos, apresentam não apenas uma cor verde pura devido a ligações de corantes fluorescentes, mas sim eventualmente também ainda colorações próprias, que são visíveis não apenas em uma faixa verde mas sim também por exemplo em uma faixa laranja ou marrom, de modo que frações de vermelho são suportadas. Além disso, tecidos ou tecidos orgânicos também apresentam uma assim chamada autofluorescência, que é visível para o usuário igualmente em uma faixa laranja ou faixa marrom. O usuário, por exemplo um médico, quer então realizar uma pesquisa e usualmente está acostumado a olhar por uma ocular de um microscópio e observar opticamente uma consideração da imagem fluorescente sem outras descolorações ou seleções de canal de cor, para então realizar uma pesquisa. Se, como conhecido do estado atual da técnica, fosse empregado apenas um canal verde, então o usuário poderia com uma tal imagem fluorescente de canal verde pura não perceber outras frações de cor depois posteriormente quando da reprodução da imagem fluorescente. Portanto, precisamente de maneira vantajosa é disponibilizado um processo, em que um sensor de imagem com uma matriz de filtro de cor anteposta é empregada para obtenção da imagem fluorescente como uma imagem de cor, sendo que esse sensor de imagem com a matriz de filtro de cor anteposta é simultaneamente emprego também para a focalização com base no raio laser na faixa de infravermelho próximo. Não é portante necessária uma outra câmera adicional ou separada ou sensor de imagem para uma detecção de um raio laser refletido.

[0013] Formas de execução da invenção vantajosas são objeto das reivindicações dependentes e são mais detalhadamente explicadas na descrição a seguir com referência parcial às Figuras.

[0014] De preferência, a imagem fluorescente microscópica é uma imagem de cor digital, especialmente com ao menos uma fração verde e uma fração vermelha. Particularmente, de preferência a imagem de cor digital apresenta ainda uma fração azul. Tais frações de cor podem ser representadas por uma imagem de cor digital, que corresponde a uma codificação de cor RGB. Alternativamente, porém, também é viável que a imagem de cor represente tais frações de cor em uma outra codificação de cor, como por exemplo codificação de cor CMYK.

[0015] De preferência a matriz de filtro de cor é uma matriz com uma pluralidade de canais de cor apresentando ao menos um canal verde e um canal vermelho, especialmente ainda de preferência também um canal azul. Especialmente preferida é a matriz de filtro de cor uma matriz RGB.

[0016] O comprimento de onda é de preferência maior do que 780 nm, de preferência maior do que 800 nm. O comprimento de onda se situa, de preferência, em uma faixa de 780 nm a 1000 nm, de preferência em uma faixa de 800 a 1000 nm. Em uma forma de execução especial, o comprimento de onda importa em 850 nm.

[0017] A matriz de filtro de cor é de preferência uma matriz Bayer.

[0018] O fotosensor é de preferência um sensor CMOS ou um sensor CCD.

[0019] A detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel para uma respectiva distância relativa ocorre por meio de preferência de uma detecção de respectivas quantidades parciais de valores de intensidade de pixel de respectivos canais de cor, sendo que a respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel é determinada à base de uma respectiva quantidade parcial de valores de intensidade de pixel. De preferência então valores de intensidade de pixel de uma respectiva quantidade parcial são compensados com um fator de escala predeterminado, que depende de qual tipo de canal de cor pertence a respectiva quantidade parcial de valores de intensidade de pixel. Com isso, podem ser compensadas diferenças de transmissividade dos distintos canais de cor da matriz de filtro de cor.

[0020] De preferência, os respectivos canais de cor da matriz de filtro de cor apresentam no comprimento de onda do raio laser uma respectiva transmissividade, que divergem no máximo em um fator 5 entre si. Com isso é possível determinar uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel de intensidades de pixel dos respectivos canais de cor por meio de escala dos valores de intensidade de pixel dependentes do canal de cor, sendo que precisamente os valores de intensidade de pixel dos respectivos canais de cor não divergem tanto entre si que um escalonamento dos respectivos valores em função do tipo do canal de cor produzisse uma demasiada deterioração com relação a uma relação sinal-ruído.

[0021] O raio laser de preferência é um feixe de raios paralelo, essencialmente colimado.

[0022] De preferência em uma via de raios de detecção entre a objetiva e o sensor de imagem está disposta uma lente ou um sistema de lentes, que reproduz um plano focal da objetiva no sensor de imagem.

[0023] De preferência ocorre uma determinação de um respectivamente máximo valores de intensidade de pixel como uma respectiva métrica de foco para uma respectiva distância relativa à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel. Além disso ocorre de preferência uma determinação de um curso dos máximos valores de intensidade de pixel por associação do respectivamente máximo valor de intensidade de pixel à respectiva distância relativa. De preferência ocorre uma determinação da distância relativa preferida com base em ao menos um máximo curso dos valores de intensidade de pixel.

[0024] De preferência ocorre uma alteração da distância relativa por meio de redução da distância relativa a partir de uma distância máxima para uma distância mínima com emprego de uma primeira resolução de distância, de modo que o curso apresenta valores máximos. De preferência ocorre uma determinação de uma distância relativa temporariamente preferida à base dos vários máximos. De preferência ocorre então um aumento da distância relativa da distância relativa temporariamente preferida com emprego de uma segunda resolução de distância, que é maior do que a primeira resolução de distância, com simultânea detecção de respectivos outros valores de intensidade de pixel máximos como respectivas métricas de foco a respectivas outras distâncias relativas. De preferência ocorre uma detecção de uma presença de um máximo local à base dos outros valores de intensidade de pixel máximos e determinação da distância relativa final, preferida, como a distância relativa, à qual há o máximo local.

[0025] É proposto ainda um sistema de microscópio para a tomada de uma imagem fluorescente microscópica de uma região de amostra com uma amostra biológica. O sistema de microscópio apresenta um suporte de amostra para sustentação da região de amostra que apresenta ao menos uma área limítrofe, além de uma fonte de laser para a produção de um raio laser, uma fonte de luz de excitação para emissão de luz de excitação sobre a região de amostra, ao menos uma objetiva, que é executada para dirigir o raio laser para a região de amostra e, além disso, produzir uma focalização do raio laser em um plano de focalização, bem como um sensor de imagem para detecção de uma quantidade de valores de intensidade de pixel, que são produzidos pelo raio laser refletido na área limítrofe e retransmitido pela objetiva a correspondentes pixels de sensor do sensor de imagem.

[0026] A objetiva e a região de amostra são deslocáveis relativamente entre si ao longo de um eixo óptico da objetiva, para variar uma distância relativa entre objetiva e região de amostra.

[0027] O sistema de microscopia apresenta ainda um processador. O processador é executado para ativar de tal maneira a objetiva e/ou o suporte de amostra que a objetiva e a região de amostra apresentem respectivas distâncias relativas distintas entre si. O processador é ainda executado para detectar uma distância relativa respectiva de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel por meio do sensor de imagem e ainda determinar uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel. O processador é ainda executado para determinar uma distância relativa preferida à base das métricas de foco determinadas. O processador é ainda executado para ativar a objetiva e/ou o suporte de amostra de tal maneira que seja ajustada a distância relativa preferida, ativar ainda a fonte de luz de excitação bem como detectar a imagem fluorescente microscópica por meio do sensor de imagem.

[0028] O sistema de microscopia é caracterizado pelo fato de que o sensor de imagem é um fotosensor com uma matriz de filtro de cor anteposta, de que a imagem fluorescente microscópica é uma imagem de cor, especialmente uma imagem de cor não-monocromática, e de que o raio laser apesenta um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo.

[0029] É ainda proposto um processador apresentando uma ou várias interfaces.

[0030] O processador é executado para disponibilizar por uma ou as várias interfaces um primeiro sinal de controle para ativação de uma fonte de luz laser, um segundo sinal de controle para ativação de uma objetiva e/ou um suporte de amostra, de modo que a objetiva e o suporte de amostra apresentam respectivas distâncias relativas entre si, bem como de um sensor de imagem com uma matriz de filtro de cor anteposta para receber em uma respectiva distância relativa uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel. O processador é ainda executado para determinar uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel bem como determinar à base das métricas de foco determinadas uma distância relativa preferida. O processador é ainda executado para disponibilizar por uma ou várias interfaces o segundo ou um outro sinal de controle para ativação e/ou do suporte de amostra de tal maneiro que a distância relativa preferida seja ajustada; além de um terceiro sinal de controle para ativação de uma fonte de luz de ativação bem como receber do sensor de imagem valores de intensidade de pixel. O processador é ainda executado para determinar à base dos valores de intensidade de pixel recebidos uma imagem fluorescente microscópica, sendo que a imagem fluorescente microscópica é uma imagem de cor e sendo que a fonte de luz de laser apresenta um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo.

[0031] A seguir, a invenção será mais detalhadamente explicada com base em formas de execução especiais sem restrição da ideia inventiva geral com base nas Figuras. Mostram então:

[0032] Figura 1 uma forma de execução preferida de um sistema de microscopia proposto,

[0033] Figura 2 uma região de amostra a título de exemplo com uma amostra biológica,

[0034] Figura 3a um sensor de imagem,

[0035] Figura 3buma matriz de filtro de cor,

[0036] Figuras 4a, 4b e 4c exemplos de intensidades de pixel de uma região parcial de uma área de detecção de um sensor de imagem com imagens parciais tomadas a diferentes distâncias relativas,

[0037] Figura 4d um exemplo de uma área predeterminada dentro da região parcial,

[0038] Figura 4e um exemplo de intensidades de pixel de um sensor de imagem durante uma focalização,

[0039] Figura 5 um curso de máximos valores de intensidade em função de uma distância relativa,

[0040] Figura 6 um outro exemplo de um local máximo em um curso de valores máximos em função de uma distância relativa, como determinado segundo uma forma de execução do processo;

[0041] Figuras 7a e 7b imagens de pixel detectadas por meio de um sensor de imagem de um raio laser refletido com emprego de um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo,

[0042] Figuras 7c e 7d imagens de pixel resultantes quando de detecção de um raio laser refletido com um comprimento de onda de 650 nm com emprego de um sensor de imagem com matriz de filtro de cor anteposta,

[0043] Figura 8 uma transmissividade de distintos canais de cor de uma matriz de filtro de cor a título de exemplo,

[0044] Figura 9 uma imagem fluorescente a título de exemplo de um tecido como uma imagem de valor cinza, sendo que as intensidades da imagem de valor cinza se baseiam em intensidades de vários canais de cor,

[0045] Figura 10 a imagem fluorescente a título de exemplo com caracterização de duas estruturas de tecido,

[0046] Figura 11 uma fração verde pura da imagem fluorescente com caracterização das duas estruturas de tecido,

[0047] Figura 12 uma fração vermelha da imagem fluorescente com caracterização das duas estruturas de tecido,

[0048] Figura 13 um fluxograma para realização de etapas de processo segundo uma forma de execução preferida.

[0049] A Figura 1 mostra um sistema de microscopia ou um dispositivo V, em que uma região de amostra P é disponibilizada sobre um suporte de objeto OT. A região de amostra P apresenta uma amostra biológica; A região de amostra P é retida em um suporte de amostra PH, que fica disposto de preferência em uma mesa TI deslocável em direção z ou em sua altura. A mesa TI e o suporte de amostra PH podem ser considerados como uma unidade combinada ou um suporte de amostra PH, TI combinado.

[0050] O suporte de amostra PH é deslocável em uma direção Z para uma objetiva O ao longo de um eixo OA óptico da objetiva. A objetiva OB pode também ser designada como uma unidade OE óptica.

[0051] Nesse exemplo aqui representado, o suporte de amostra PH, TI é deslocável relativamente à objetiva OB. Alternativamente, a objetiva OB também pode ser deslocável relativamente ao suporte de amostra PH, TI. A deslocabilidade se refere ao ajuste de uma distância relativa entre região de amostra P e objetiva OB. Em outras palavras: a objetiva OB e a região de amostra P ou o suporte de amostra PH, TI são deslocáveis relativamente entre si ao longo do eixo OA óptico da objetiva OB, para variar uma distância relativa entre objetiva OB e região de amostra P.

[0052] A região de amostra P apresenta ao menos uma área limítrofe.

[0053] A Figura 2 mostra a região de amostra 2 P em detalhe. A região de amostra 2 compreende um suporte de objeto com biochip embutido, como ilustrado em maior detalhe em uma vista em corte lateral esquemática na fig. 2. A região de amostra 2 compreende um suporte de objeto 41, que tem uma estrutura em forma de placa com um recorte 43. No recorte 43 do suporte de objeto 41 está disposto um biochip 45 e aplicado por meio de um adesivo 47 no suporte de objeto 41. Em torno do biochip 45 está enchida glicerina 49 dentro do recesso 43. Sobre o biochip 45 está disposta uma amostra 51 (biológica). A amostra 51 fica assim embutida na glicerina 49. Um vidro de cobertura 53 cobre a reentrância 43 com a amostra 51 nela disposta envolta com glicerina 49. O vidro de cobertura 53 tem uma superfície 55, que forma uma primeira área limítrofe, e uma superfície 57 inferior, que forma uma segunda área limítrofe. A superfície 59 do biochip 45 forma uma terceira área limítrofe. Especialmente essa terceira área limítrofe 59 é determinada em um processo para focalização segundo uma forma de execução da presente invenção.

[0054] A distância relativa preferida (distância vertical relativa entre a objetiva e a região de amostra) é tomada quando o raio laser está focado da objetiva para superfície 59 (isto é, a terceira área limítrofe) do biochip 45. Tão logo essa distância relativa preferida é encontrada, podem ser tomadas uma ou várias imagens por leitura de preferência da área de detecção total do sensor de imagem, especialmente quando a amostra 51 é por exemplo iluminada com luz estimulando fluorescência.

[0055] Na região de amostra pode se tratar de uma região de amostra dilatada em três dimensões, que assim é dilatada em duas direções laterais bem como em uma direção de profundidade a isso perpendicular. Especialmente dentro da região de amostra em uma determinada profundidade pode se encontrar uma amostra (biológica), da qual deve ser tomada uma imagem focada, especialmente imagem fluorescente. O processo (e o sistema de microscopia) pode assim sem empregado especialmetne no diagnóstico autoimune para avaliação de preparados de imunofluorescência. Especialmente podem o processo e o sistema de microscopia auxiliar um teste de imunofluorescência indireto (IIFT). O processo pode assegurar um rápido processamento das amostras a serem encontradas, o que requer uma rápida focalização das amostras.

[0056] A ao menos uma área limítrofe pode, por exemplo, ser uma área limítrofe plana, por exemplo entre um material sólido e ar, entre um material sólido e um líquido ou entre um material sólido e uma amostra (orgânica). A presença da ao menos uma área limítrofe pode facilitar uma focalização ou aumentar uma confiabilidade da focalização.

[0057] Segundo uma forma de execução da presente invenção, o processo é de tal maneira executado que ao menos uma área limítrofe, especialmente duas áreas limítrofes, não fica contígua ao ar, sendo que a região de amostra abrange especialmente uma amostra orgânica, que assenta sobre um biochip, está embutida em uma substância líquida e é coberta por um vidro de cobertura, sendo que ainda especialmente o lado superior do vidro de cobertura forma uma primeira área limítrofe, sendo que o lado inferior do vidro de cobertura forma uma segunda área limítrofe, e sendo que a superfície do biochip forma uma terceira área limítrofe. A amostra orgânica pode, por exemplo, compreender uma amostra histológica, que por exemplo é tingida, e/ou foi provida de um ou vários marcadores de fluorescência ou moléculas de fluorescência. Os marcadores de fluorescência ou moléculas de fluorescência podem estar unidos à amostra orgânica em pontos predeterminados ou receptores ou antígenos. A substância líquida pode, por exemplo, compreender glicerina. A amostra orgânica pode, por exemplo, ser uma amostra orgânica úmida, podendo ser impedido que a amostra resseque. Formas de execução da invenção possibilitam reproduzir uma amostra orgânica embutida em um líquido (tridimensionalmente, isto é, essencialmente por todos os lados). As áreas limítrofes podem ser caracterizadas por uma alteração do índice de refração acima e abaixo da área limítrofe. Por exemplo, quando da passagem na área limítrofe entre um meio fluido e um meio sólido o índice de refração varia bem menos do que quando da passagem em uma área limítrofe de ar para um meio sólido, por exemplo vidro. O grau de reflexão na área limítrofe pode ser tanto menor quanto menor for a alteração do índice de refração na área limítrofe. Apesar de uma reflexão relativamente pequena na terceira área limítrofe, esta pode ser detectada pelo processo de acordo com a invenção.

[0058] Segundo a Figura 1, dispositivo V apresenta uma fonte de luz laser ou fonte de laser LL, que produz uma luz laser um ou raio laser LS. O raio laser LS é dirigido por um divisor de raio SP2 em direção da objetiva OB e entra em uma abertura óptica OF da objetiva OB. O raio laser é especialmente um feixe de raios paralelo, essencialmente colimado. O divisor de raio SP2 é especialmente um divisor de raios, que reflete uma primeira fração de potência de uma luz em queda e transmite uma segunda fração da luz em queda.

[0059] Luz de laser, que é refletida em uma área limítrofe da região de amostra P, é então pela objetiva OB refletida por um divisor de raio SP1 dicroico e um filtro F12 óptico e o divisor de raio SP2 para uma lente ou lente de tubo TL. A lente de tubo TL juntamente com a objetiva produz uma reprodução do raio laser em um sensor de imagem BS, que é especialmente um fotosensor OS. Ao sensor de imagem BS está anteposta uma matriz de filtro de cor FFM. O sensor de imagem BS e a matriz de filtro de cor FFM são de preferência componentes de uma câmera K, que apresenta de preferência uma óptica de câmera KO.

[0060] A objetiva OB é de tal maneira executada que projeta raios laser, que entram paralelamente entre si como uma via de raios paralela ou um feixe de raios paralelo, colimado, em sua abertura OF óptica voltada para a fonte de luz laser LL, a um ponto de um plano focal da objetiva no outro lado da objetiva, sendo que o ponto pode ser o ponto focal ou um ponto deslocado para o ponto focal no plano focal, caso o feixe de raios não se estenda precisamente paralelo ao eixo óptico da objetiva. Raios laser, que são refletidos precisamente desse ponto, especialmente o ponto focal, no plano focal e dali entram de volta na objetiva, são de novo formados no lado de abertura ou no lado óptico OF para o sensor de imagem BS para uma via de raios paralela.

[0061] Sendo portanto, por exemplo, raio laser LS um feixe de raios paralelo, colimado, então a objetiva OB produz uma projeção do raio laser em toda a sua intensidade em um ponto, especialmente o ponto focal, no plano focal da objetiva. A via de raios captada pela objetiva a partir desse ponto, especialmente desse ponto focal, que é enfeixado no outro lado da objetiva para uma via de raios paralela, colimada, pode então ser projetada por meio de uma lente TL, conectada após a objetiva OB, de preferência uma lente tubular, para um ponto de reprodução, em que está disposto o sensor de imagem BS. Em outras palavras, a objetiva OB e a lente Tubus TL produzem uma reprodução do raio laser refletido o sensor de imagem BS.

[0062] No sentido desse Pedido, o termo plano focal pode também ser designado como o termo plano de amplitude focal. Especialmente um diâmetro de seção transversal do raio laser LS é essencialmente igual à abertura de entrada da objetiva OB. A abertura de entrada pode também ser designada como abertura.

[0063] A objetiva pode compreender uma ou várias lentes, que podem estar dispostas uma atrás da outra ao longo do eixo óptico da objetiva. A objetiva pode, por exemplo disponibilizar um aumento de 10 vezes, 20 vezes ou por exemplo 40 vezes e, por exemplo, apresentar uma abertura numérica entre 0,3 e 0,8. O diâmetro do raio laser paralelo, colimado, é de preferência de tal maneira dimensionado que toda a abertura da objetiva microscópica é iluminada.

[0064] No caso de que o raio laser LS seja uma via de raio paralela, colimada, então o raio laser é projetado pela objetiva OB sobre o ponto do plano focal, sendo que o ponto pode ser o ponto focal ou um ponto deslocado para com o ponto focal no plano focal. Tem-se assim uma intensidade óptica máxima do raio laser nesse ponto no plano focal. Coincidem então nesse caso ou nesse exemplo o plano de focalização. Encontrando-se por variação da distância relativa a área limítrofe da região de amostra precisamente no plano focal, então ocorre uma reflexão do raio laser projetado no ponto do plano focal para a objetiva OB, sendo que a objetiva OB e a lente Tubus TL pode produzir uma reprodução em um ponto do sensor de imagem BS. Portanto então ao menos um pixel ou um pequeno número de pixels com uma intensidade especialmente alta se encontram em uma região do sensor de imagem.

[0065] O sensor de imagem BS está novamente mostrado na Figura 3A. O sensor de imagem BS apresenta distintos pixels individuais P11,..., P14.

[0066] Ao sensor de imagem está anteposta uma matriz de filtro de cor FFM da Figura 3b. Distintos elementos de filtro de cor ou elementos de canal de cor P1 a P9 estão igualmente representados. Um respectivo canal de cor é fixado por uma respectiva escolha de cor determinada, podendo se tratar aqui nesse exemplo de execução de uma matriz de filtro de cor RGB. Alternativamente, é viável uma matriz de filtro de cor CMYK. Ao pixel P11 do sensor BS da Figura 3 está anteposto, por exemplo, o elemento de filtro de cor P5. A um respectivo elemento de pixel do sensor de imagem BS está anteposto ou associado respectivamente um respectivo elemento de filtro de cor, especialmente precisamente um respectivo elemento de filtro da matriz de filtro de cor FFM.

[0067] Uma obtenção de uma imagem de cor por meio de um sensor de imagem BS da Figura 3a com uma matriz de filtro de cor FFM da Figura 3b anteposta pode ocorrer por um assim chamado processo DE-Bayering.

[0068] Segundo a Figura 1, o dispositivo V apresenta ainda uma fonte de luz de excitação AL para emissão de luz de excitação AS. Essa luz de excitação AS é novamente filtrada de preferência por um filtro óptico Fl1, antes que por meio do divisor de raio dicroico SP1 seja dirigida para a objetiva OB e, com isso, para a região de amostra ou sobre a região de amostra. Essa luz de excitação serve a uma excitação de fluorescência na região de amostra P. A fonte de luz de excitação é de preferência um LED, sobretudo um LED azul.

[0069] Radiação fluorescente FS da amostra biológica pode então retornar da região de amostra P através da objetiva OB pelo divisor de raio SP2 para um filtro ótico Fl2. O filtro Fl2 óptico filtra de preferência luz da radiação de excitação AS. A radiação fluorescente FS atravessa então o divisor de raio SP2 e passa dali à lente Tubus, que juntamente com a objetiva OB produz uma reprodução no sensor de imagem BS e uma matriz de filtro de cor FM anteposta ao sensor. A combinação do filtro Fl1 óptico, do filtro óptico Fl2 bem como do divisor de raio dicroico SP1 pode também ser designada como uma unidade óptica OE2.

[0070] Em outras palavras, a objetiva OB é executada para dirigir o raio laser para a região de amostra e produzir uma focalização do raio laser em um plano de focalização. O sensor de imagem BS é executado para detectar uma quantidade de valores de intensidade de pixel, que sejam produzidos pelo raio laser refletido na área limítrofe da região de amostra P e retransmitidos pela objetiva a correspondentes pixels de sensor do sensor de imagem, sendo que o raio laser não é reproduzido apenas pela objetiva OB, mas sim de preferência também ainda pela lente ou lente Tubus TL sobre o sensor de imagem BS.

[0071] Segundo uma forma de execução, em uma via de raios de detecção entre a objetiva OB e a área de deflexão está disposta uma lente TL, especialmente uma lente Tubus, que reproduz um plano focal da objetiva sobre o sensor de imagem. Atrás da objetiva (ou a jusante da corrente de luz) pode haver uma via de raios paralela e os raios paralelos podem ser reproduzidos pela lente Tubus em um plano focal do lado da imagem. Assim, um deslocamento da objetiva relativamente à lente Tubus não tem influência ou influência essencial sobre a reprodução dos raios paralelos no plano focal da lente Tubus do lado da imagem. Em um determinado ponto dentro da região parcial da área de detecção chegam assim apenas raios, que partiram de um determinado ponto comum no plano focal da objetiva em diversas direções, especialmente do ponto focal. Por seleção apropriada do tamanho da área predeterminada pode assim ser excluída da detecção para a focalização luz difusa (que não partiu de um ponto do plano focal da objetiva do lado do objeto e diversas direções).

[0072] O sensor de imagem BS é um fotosensor, especialmente um sensor CMOS ou um sensor CCD. A matriz de filtro de cor FFM é, de preferência, uma matriz Bayer.

[0073] A matriz de filtro de cor FFM apresenta, de preferência, uma pluralidade de canais de cor, especialmente ao menos um canal verde e um canal vermelho, particularmente de preferência um canal azul.

[0074] O dispositivo V da Figura 1 apresenta um processador P, que por uma interface SC4 por meio de um sinal de controle ST4 pode ativar o suporte de amostra Pt. Tl, de modo que a objetiva OB a região de amostra P apresentar respectivas distâncias relativas entre si diferentes.

[0075] Por meio de uma interface SC2 é executado o processador P, para emitir um sinal de controle ou vários sinais de controle SC2 à câmera K ou ao sensor de imagem BS, de modo que pelo sensor de imagem são detectados valores de intensidade de pixel PW pelo sensor de imagem ou valores de sensor SW. O sensor de imagem BS disponibiliza esses valores de intensidade de pixel PW ou valores de sensor SW então pela interface SC2 ao processador P. Com isso, portanto, o processador P por meio do sensor de imagem BS detecta para uma distância relativa respectiva uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel. O processador P pode, portanto, deslocar o suporte de amostra PH, TI continuamente ou gradualmente e então detectar respectivas distâncias relativas entre objetiva OB e região de amostra P respectivamente uma imagem ou uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel. É detectada portanto para uma respectiva distância relativa uma respectiva quantidade própria de valores de intensidade de pixel como uma imagem ou, de preferência, uma imagem parcial do sensor de imagem. Para uma respectiva distância relativa determina o processador P uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel ou à base da respectiva imagem para a respectiva distância relativa.

[0076] Um ajuste da distância relativa entre região de amostra P e objetiva B pode ocorrer de preferência alternativamente pelo processador P na medida em que o processador P ativa por uma interface SC6 por meio de um sinal de controle ST6 a objetiva OB de tal maneira que a objetiva altera o eixo óptico AO da objetiva OB relativamente à região de amostra P ao longo de sua distância relativa.

[0077] Por meio de uma interface SC7 pode o processador P por um sinal de controle ST7 ativar ou desativar essa fonte de luz laser LL.

[0078] Por meio de uma interface SC3 pode o processador P ativar ou desativar por um sinal de controle ST3 a fonte de luz de excitação AL.

[0079] O processor P determina com base nas métricas de foco determinadas uma distância relativa preferida entre objetiva OB e região de amostra P.

[0080] O processador P ativa então a objetiva OB e/ou o suporte de amostra PH de tal maneira que é ajustada a distância relativa preferida, além disso é ativada a fonte de luz de excitação AL bem como, além disso, por meio do sensor de imagem BS, detectada a imagem fluorescente microscópica como uma imagem de cor.

[0081] A detecção da imagem fluorescente microscópica como uma imagem de cor é assim produzida por parte do processador, na medida em que o processador P recebe os valores de pixel PW ou valores de sensor SW do sensor de imagem BS pela interface SC2 e gera com base nesses valores de pixel uma correspondente imagem de cor.

[0082] O processador P não precisa ser parte integrante do dispositivo V, podendo ser logicamente substituído pelo dispositivo como registrado na Figura 1 por uma separação TR lógica. Nesse caso, as interfaces SC2, SC7, SC3, SC6, SC4 podem ser total ou parcialmente reunidas como uma ou várias interfaces de dados, especialmente ligadas por cabo ou não ligadas por cabo, portanto sem fio, especialmente em forma de uma interface Local-Area-Network (LAN).

[0083] De preferência, o processador P apresenta uma interface SC1 para uma rede N. A rede N é de preferência uma rede de dados, como por exemplo a Internet.

[0084] Pela interface SC1 pode o processador P receber de preferência da rede N um sinal de entrada ES, que indica uma solicitação ao processador P para executar o processo proposto, para produzir uma focalização e detectar a imagem fluorescente como uma imagem de cor.

[0085] De preferência, apresenta o processador P uma interface SC5 para uma unidade de saída, pela qual o processador pode disponibilizar dados de imagem BD. A unidade de saída AE pode então, de preferência, ser um monitor ou um mostrador, de modo que os dados de imagem BD podem ser por exemplo dados e imagem digitais segundo o padrão HTMI. São possíveis outros padrões de dados de imagem. A unidade de saída AE pode, por sua vez, em uma forma de execução ser uma interface de rede, pela qual o processador por meio da interface SC5 transmite os dados de imagem BD em forma digital em uma rede. A interface SC5 e a interface SC1 podem, no caso de que a unidade de saída AE seja uma interface de rede, ser dadas em forma de uma interface integral ou igual.

[0086] A fig. 4e mostra uma imagem geral de uma reflexão de laser puntiforme, como foi toda a área total de um sensor de imagem de valor cinza tomada sem matriz de filtro de cor anteposta para um comprimento de onda de 650 nm. Toda a imagem 63 compreende por exemplo 1024 x 1024 pixel.

[0087] De preferência, apenas uma região parcial do sensor de imagem ou do pixel é lida, enquanto que a distância relativa entre a objetiva OB e a região de amostra P é alterada.

[0088] Figuras 4a, 4b e 4c ilustram para tanto por exemplo regiões parciais 65a, 65b, 65c e os valores de intensidade de pixel detectados dos pixels aí contidos ou intensidades como valores cinza de uma imagem de um raio laser refletido para diversas distâncias relativas. As regiões parciais 65a, 65b, 65c podem ser formadas por exemplo de 16 x 16 Pixels. Os valores de intensidade de pixel do pixel da região parcial 65a correspondem então a uma quantidade de valores de intensidade de pixel para uma distância relativa. Isso se aplica analogamente às regiões 65b ou 65c para outras distâncias relativas. As Figuras 4a, 4b e 4c ilustram, portanto, intensidades de pixel ou imagens, em que z = -0,5 µm, z = 0 µm e z = +0,5 µm, que resultam com distância relativa entre objetiva e região de amostra, sendo que a superfície 59 do biochip 45 fica disposta no plano focal da objetiva, de modo que a distância relativa a ser determinada é tomada para z = 0 µm. O respectivo máximo valor de intensidade Gmax é igualmente ilustrado. Sendo o plano de foco da objetiva movido para longe da correspondente área limita no suporte de objeto (ver fig. 4a, 4c), então o sinal de laser é escondido ou ampliado. Das figs. 4a, 4b e 4c fica claro, que já com deslocamentos de cerca de +/- 500 nm diminui a ativação dos distintos pixels nitidamente, isto é, a máxima intensidade de pixel pela região parcial é máxima quando precisamente é assumida a distância relativa preferida, isto é, no caso da fig. 4b. Pelo emprego do sistema aqui descrito com uma focalização do raio laser em um ponto focal no plano focal da objetiva pode ser obtida uma resolução local da posição z particularmente precisa. Se um modelo total e expandido em plano em vários pixels da região parcial fosse projetado, então esse modelo também na posição de focalização ideal apresentaria uma dilatação espacial maior do que o raio laser aqui empregado, de modo que também uma resolução local em direção z seria mais grosseira ou imprecisa. Sendo utilizado por exemplo como métrica de foco o respectivamente máximo valor de intensidade de pixel, então resultam outras vantagens: Em uma projeção de padrão não bastaria observar apenas uma única intensidade de pixel máxima da região parcial como medida para uma focalização, mas sim deveriam ser reunidos vários pixels e por uma análise dos vários pixels deveria ser determinada uma focalização com relação ao padrão plano como uma medida para uma focalização, que tomaria nitidamente mais tempo do que a observação da máxima intensidade de pixel do sensor de imagem ou de uma região parcial do mesmo.

[0089] A Figura 4d ilustra, por exemplo, uma área predeterminada, de preferência empregada, ou uma região parcial 66, na qual valores de intensidade de pixel são detectados e avaliados, para de preferência se determinar um máximo valor de intensidade de pixel para essa região (65a, 65b, 65c).

[0090] Para cada imagem parcial registrada para uma determinada distância relativa pode, portanto, de preferência ser determinado o máximo valor cinza de pixel ou o máximo valor de intensidade. Por meio do conhecimento do sinal de solicitação ST4 ao dispositivo de mesa Tl 37 pode o processador realizar a conexão dos dados de câmera ou valores de intensidade com as correspondentes distâncias relativas, bem como ainda determinar a distância relativa preferida.

[0091] As reflexões de um raio laser, representadas nas Figuras 4a, 4b, 4c bem como 4e, como valores de pixel de um sensor de imagem são apresentadas para o caso de que ao sensor de imagem não esteja anteposta uma matriz de filtro de cor e que, com isso, não ocorra precisamente uma alteração de uma intensidade de pixel do raio laser refletido do comprimento de onda de 650 cm por distintas regiões parciais e uma matriz de filtro de cor.

[0092] As Figuras 7c e 7d mostram valores de intensidade de pixel resultantes a título de exemplo no caso em que com emprego de um sensor de imagem com matriz de filtro de cor anteposta é empregado um comprimento de onda de laser de 635 nm. Na Figura 7c para o caso de uma ligeira desfocalização é mostrada uma distribuição de intensidade resultante pela região de pixel. Fica claro que não para todos os pixels é dada uma intensidade a ser esperada, mas que determinados pixels são quase esmaecidos, pois esses pixels se encontram atrás dos elementos de filtro de cor, que não estão associados a um canal vermelho e, com isso, não transmitem suficientemente comprimento de onda de 635 nm.

[0093] A Figura 7d mostra, com emprego de um sensor de imagem com matriz de filtro de cor anteposta, para o caso de uma focalização, valores de intensidade de pixel então resultantes. Em oposição à Figura 4b, não se pode ver aqui um ponto claro com uma alta intensidade do raio laser refletido, mas sim também aqui na Figura 7b pixels individuais estão quase escondidos. Um tal desaparecimento de determinados pixels no decorrer de uma detecção de valores de intensidade de pixel resultantes como representação de um raio laser refletido pode ter influência negativa sobre métricas de foco a serem determinadas. Em outras palavras, os valores de intensidade de pixel resultantes das Figuras 7c e 7d estão sujeitos a artefatos, que são provocados pelas distintas transmissividades dos distintos canais de cor da matriz de filtro de cor. Esses artefatos têm influência sobre as métricas de foco a serem determinadas, de modo que um resultado de determinação da distância relativa preferida pode ser dificultado ou falsificado. O resultado final pode então ser que para a detecção da imagem fluorescente não se tem uma focalização suficiente.

[0094] Uma métrica de foco a título de exemplo pode ser um máximo valores de intensidade de pixel dentro de uma região parcial, como representado na Figura 7c ou 7d. Métricas de foco alternativas aqui mencionadas podem, por exemplo, se basear em um ou vários dos seguintes operadores: valor médio compensado das intensidades de pixel na região de imagem selecionada, avaliação da largura de meio valor das intensidades de pixel, avaliação de máximo ou valor médio da imagem de aresta das intensidades de pixel. Uma imagem de aresta pode ser obtida especialmente por meio de um dos operadores Prewitt-Operator, Sobel-Operator, Laplacian-of-Gaussian/Marr-Hildreth-Operator ou Difference-of-Gaussian. Tais operadores são especialmente sensíveis contra artefatos como os que podem ser vistos nas Figuras 7c e 7d.

[0095] A Figura 7a e a Figura 7b mostram valores de intensidade de pixel resultantes no caso de que com emprego de sensor de imagem e matriz de filtro de cor da Figura 1 é empregado adicionalmente um laser na faixa de infravermelho próximo, especialmente a 850 nm. Fica claro para o caso de uma ligeira desfocalização da Figura 7a uma distribuição a ser esperada de uma intensidade de pixel, como mostrado também anteriormente na Figura 4a. Pode-se determinar então uma métrica de foco de modo robusto e seguro.

[0096] A Figura 7b mostra para o caso de uma focalização quase precisa um raio laser acentuadamente refletido com uma forte intensidade em uma faixa central, como também mostrado anteriormente em configuração semelhante.

[0097] A solução de acordo com a invenção com emprego do sensor de imagem e da matriz de filtro de cor anteposta permite, com base na seleção do comprimento de onda do raio laser na faixa de infravermelho próximo, obter nas respectivas distâncias relativas respectivas imagens ou respectivas quantidades de valores de intensidade de pixel, como são mostrados nas Figuras 7a e 7b, e determinar então de modo seguro e robusto para a determinação de respectivas métricas de foco para respectivas distâncias relativas à base das respectivas imagens ou respectivas quantidades de valores de intensidade de pixel.

[0098] Problemas com alinhamento falho do raio laser refletido com relação a regiões parciais da matriz de filtro de cor podem resultar então especialmente quando a região de amostra P não fica alinhada completamente perpendicular com relação ao eixo OA óptico da objetiva OB da Figura 1. Em um tal caso em que a região de amostra P fica ligeiramente inclinada relativamente ao eixo óptico AO da objetiva OB pode ocorrer que o raio laser LS refletido de volta, que é guiado até ao sensor de imagem BS, se encontra acentuadamente inclinado com relação ao plano da matriz de filtro de cor.

[0099] Sendo então a distância relativa entre região de amostra P e objetiva OB variada parcialmente ou gradualmente ou mesmo continuamente, então pode ocorrer que o raio laser LS incida de tal maneira sobre a matriz de filtro de cor FFM que para distâncias relativas distintas o raio laser incida sobre regiões parciais respectivamente distintas P1, ..., P9 então precisamente em função da respectiva distância relativa, que é ajustada entre objetiva OB e região de amostra P, é transmitido com intensidade distinta pelas distintas regiões parciais P1, ..., P9 da matriz de filtro de cor FFM.

[0100] Isso é compensado pela invenção pelo fato de que precisamente sempre é ainda empregável um sensor de imagem BS com matriz de filtro de cor FFM anteposta, pois o laser é selecionado com um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo.

[0101] A Figura 8 mostra transmissividades T1, T2, T3 para respectivos canais de cor para uma matriz de filtro de cor a título de exemplo. A transmissividade T1 mostra um canal azul, a transmissividade T2 mostra um canal verde, a transmissividade T3 mostra um canal vermelho. O sensor de imagem aqui empregado com matriz de filtro de cor é de preferência um sensor do tipo SONY IMX250.

[0102] Está representado um comprimento de onda WA de 650 nm. Nesse comprimento de onda WA não são transmissivamente suficientes elementos de filtro de cor como o elemento P8 da Figura 3b, de modo que com emprego de um sensor de imagem BS com a matriz de filtro de cor FFM anteposta a esse comprimento de onda WA do laser deveria ser empregado um sensor de imagem separado em um canal vermelho separado.

[0103] Isso é evitado pela invenção, pois o comprimento de onda do laser é empregado em uma faixa a partir do comprimento de onda W1 de 780 nm, de preferência a partir da faixa de comprimento de onda W2 de 800 nm até ao comprimento de onda W3 de 1000 nm. Como se pode depreender da Figura 8, especialmente a partir da faixa de comprimento de onda W2 é a transmissividade de elementos de filtro de cor nos respectivos canais de cor suficientemente alta, de modo que por meio de um outro escalonamento, ainda mais precisamente explicado adiante, dos valores de intensidade de pixel ou de um escalonamento das distintas informações de canal de cor podem ser determinadas imagens de raios laser refletidos, como representados nas Figuras 7a e 7b. Particularmente vantajoso é o emprego do comprimento de onda de 850 nm no comprimento de onda W3 da Figura 8, pois aqui possivelmente pode ser dispensado um escalonamento de distintas informações de canal de cor, por as distintas transmissividades dos canais de cor individuais são suficientemente pequenas.

[0104] Como a detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel para uma respectiva distância relativa ocorre por meio de preferência de uma detecção de respectivas quantidades parciais de valores de intensidade de pixel para respectivos canais de cor, sendo que a respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel é determinada à base das quantidades parciais. O sensor de imagem disponibiliza de preferência para cada canal de cor uma respectiva quantidade parcial de pixels ou uma respectiva quantidade parcial de valores de intensidade de pixel, sendo que para cada pixel ou cada valor de intensidade de pixel é conjuntamente indicada sua posição espacial bidimensional. Com isso, o processador da Figura 1 pode então determinar ou compor a quantidade de valores de intensidade de pixel das quantidades parciais. O processador pode então, especialmente por meio de uma unidade de memória, disponibilizar para um respectivo canal de cor um correspondente fator de escalonamento, de modo que inicialmente valores de intensidade de pixel de uma quantidade parcial de um determinado canal de cor são multiplicados com o fator de escalonamento determinado, associado ao canal de cor, antes de então o processador determinar ou compor a quantidade de valores de intensidade de pixel das quantidades parciais. Valores de intensidade de pixel de uma respectiva quantidade parcial são então compensados com um fator de escalonamento predeterminado, que depende de a qual tipo de canal de cor pertence da respectiva quantidade parcial de valores de intensidade de pixel. Assim podem ser compensadas diferenças de transmissividade dos distintos canais de cor da matriz de filtro de cor no comprimento de onda do laser.

[0105] De preferência, como métrica de foco pode ser empregado o máximo valor de intensidade de uma região parcial do sensor de imagem. De preferência, portanto, em uma região parcial do sensor de imagem de modo preferencial pode ser ajustado para o máximo valor de intensidade dentro da região parcial, para se obter uma métrica de foco ou uma medida para a focalização da região de amostra. Nesse caso preferido, então, devido ao emprego aqui descrito do máximo valor de intensidade de pixel não é preciso um ulterior processamento ou filtragem dos muitos valores de intensidade de pixel do sensor de imagem ou de uma região parcial do sensor de imagem entre si, devendo antes ser apenas estabelecido qual máximo valor de intensidade correspondente à correspondente distância relativa é o máximo valor de intensidade dentro do sensor de imagem ou da região parcial considerada. Não é então considerável qual pixel detectou o máximo valor dos valores de intensidade, de modo que o processo é particularmente rápido. Sendo a região de amostra relativamente à objetiva ulteriormente deslocada para uma outra distância relativa, então ocorre uma reflexão do raio laser não em um ponto específico, que ficara antes do ponto no plano focal e especialmente era o ponto focal, mas sim a reflexão ocorre em uma região placa da região de amostra ou da área limítrofe. Com isso, então, a intensidade óptica do raio laser é distribuída por uma faixa maior da região parcial do que é o caso quando o raio laser é refletido apenas no único ponto do plano focal. Por isso, também dentro da faixa parcial no sensor de imagem resultam valores de intensidade, que na soma de fato podem ainda representar a total intensidade óptica do raio laser, sendo que, no entanto, valor de intensidade agora máximo é precisamente também menor do que o máximo valor de intensidade em cada configuração, em que o raio laser é refletido por meio da área limítrofe precisamente no ponto do plano focal. Portanto, por avaliação da região parcial ou de seu pixel não se ajusta para uma filtragem precisa de um padrão refletido, por exemplo, por meio de uma abertura, mas sim a avaliação do máximo valor de intensidade de pixel para uma respectiva distância relativa permite uma focalização ou determinação particularmente simples e rápida da posição de deslocamento relativa com uma resolução local particularmente alta. No caso de que haja várias áreas limítrofes, por meio do decurso dos máximos valores de intensidade de pixel pode, então, por exemplo, ser detectada uma terceira área limítrofe para se determinar uma distância relativa preferida. Com isso, pode, portanto, ser aumentada a sensibilidade do processo e uma dilatação do raio laser formado na direção de profundidade pode compensar essencialmente uma intensidade de profundidade da óptica.

[0106] A Figura 5 ilustra um exemplo de um decurso 67 dos máximos valores de intensidade de pixel determinados (para cada distância relativa) em função da distância relativa como uma curva 67 em um sistema de coordenadas, sendo que em uma abscissa 69 está registrada a distância relativa (posição Z) e sendo que na ordenada 71 está registrado o respectivo calor de intensidade de pixel máximo na região parcial à correspondente distância relativa. O valor Z mínimo indica então uma posição, em que a região de amostra se encontra ao máximo distanciada da objetiva; o máximo valor Z indica então uma posição, em que a região de amostra fica mais próxima da objetiva. Inicialmente ocorre um deslocamento da objetiva e da região de amostra entre si por meio de redução de uma distância relativa entre a objetiva e a região de amostra de uma distância máxima para uma distância mínima com uma primeira resolução de distância, sendo que é determinado o decurso dos valores de intensidade de pixel máximo, que apresenta vários máximos. O decurso apresenta especialmente um primeiro máximo 73 local, depois um segundo máximo local 75 e finalmente um terceiro máximo 77 local do decurso.

[0107] A curva 67 mostra um padrão de sinal característico ("sinal de autofoco"), que se baseia na geometria da região de amostra, como é ilustrada na fig. 2. Como a estrutura da região de amostra 2 é conhecida, do decurso de sinal 67 pode ser determinada a posição Z do biochip 45, especialmente a superfície 59 do biochip 45.

[0108] A curva 67 (sinal de autofoco) apresenta um primeiro máximo 73, que decorre da reflexão do raio laser 10 na primeira área limítrofe 55 (superfície superior do vidro de cobertura 53). Além disso, a curva 67 apresenta um segundo máximo 75, que decorre da reflexão do raio laser 19 da superfície 57 inferior (segunda área limítrofe) do vidro de cobertura 53. Finalmente, a curva 67 apresenta um terceiro máximo 77, que decorre da reflexão do raio laser 19 da superfície 59 do biochip 45 (terceira área limítrofe). A posição de foco da superfície de biochip 59 ou a distância relativa resulta então da determinação da posição Z 79 do terceiro máximo de sinal 77.

[0109] Com auxílio de um controle ou de um processador e de um meio de acionamento para o deslocamento da objetiva 3 em seguida sob aumento da distância entre objetiva e região de amostra de novo há um recuo em direção do local de foco determinado ou da distância relativa preferida. A distância relativa preferida é então especialmente uma distância relativa temporariamente preferida. Isso ocorre especialmente com emprego de uma segunda resolução de distância, que é maior ou menor do que a primeira resolução de distância. O comprimento do deslocamento pelo sinal de autofoco é então, de tal maneira controlado, que simultaneamente é monitorado e avaliado para com o movimento em Z. Ocorre então uma determinação de respectivamente outros valores de intensidade de pixel máximos em respectivas outras distâncias relativas bem como uma detecção de uma presença do máximo 82 da Figura 6 à base dos outros valores de intensidade de pixel máximos. De preferência, ocorre então no caso de que o raio laser apresente um feixe de raios paralelo, colimado para com a objetiva, e, ainda, o plano de focalização do raio laser coincida com o plano focal da objetiva, um ajuste da distância relativa final a uma tal posição final, em que há ou houve o máximo local detectado com base nos outros valores de intensidade de pixel locais máximos localizados.

[0110] A fig. 6 ilustra para tanto um sinal de auto focalização, que se baseia na reflexão do raio laser 19 da superfície 59 do biochip 45, isto é, um máximo 82 terceiro em um decurso em uma posição 85. O decurso 81 dos outros valores de intensidade de pixel máximos na região parcial em função da posição Z na abscissa 83 foi determinado com emprego de uma objetiva com aumento de 20 vezes com uma abertura numérica de 0,5, sendo que foi empregado um laser com um comprimento de emissão de onda de λ0 = 635 nm. A resolução axial desse sinal 81 pode, por exemplo, ser determinada da largura de meio valor Δ para cerca de 2,1 µm. A distância relativa 85 final preferida pode, por exemplo, ser determinada como a posição Z, em que o máximo 82 ocorre ou como um centro de gravidade do máximo 82. A objetiva pode então ser deslocada relativamente à região de amostra para a distância relativa 85 final preferida, em que se tinha o máximo 82 dos outros valores de intensidade de pixel máximos.

[0111] A posição de foco como a distância relativa final preferida vale, de preferência, como alcançada e o movimento de deslocamento é de preferência parado, quando estão satisfeitas de preferência em conjunto as seguintes condições:

[0112] – Um valor limiar previamente definido do sinal de autofoco foi ultrapassado. Esse valor limiar é determinado da altura de sinal do sinal de autofoco previamente determinado.

[0113] – O sinal de autofoco atinge um máximo 82 local.

[0114] A superfície do biochip não deve, contudo, representar o ótimo plano de fornecimento de imagem para a microscopia fluorescente, pois a espessura de camada da amostra 51 pode ser em parte maior do que a profundidade de campo do sistema de microscopia. Por isso em torno da posição de foco determinada ou da distância relativa final determinada preferida podem ser produzidas várias tomadas de fluorescência. Portanto, então, de preferência, a partir da distância relativa final preferida pode ocorrer uma detecção de várias imagens da região de amostra por meio do sensor de imagem. Ocorre então uma alteração da distância relativa da objetiva e da região de amostra entre si ao longo do eixo óptico a distâncias relativas respectivas acima e/ou abaixo da posição relativa preferida final. Ocorre então ainda uma detecção de respectivas imagens nas respectivas distâncias relativas por meio do sensor de imagem. O processador armazena então as respectivas imagens e determina respectivas métricas de foco para as respectivas imagens. O processador seleciona então aquela imagem, que apresenta a melhor métrica de foco. De preferência, o processador dispensa as outras imagens, que não apresentam a melhor métrica de foco.

[0115] Como se depreende da fig. 5, os máximos apresentam alturas de sinal de um determinado padrão. Do decurso pode, de preferência, o terceiro máximo 77 ser reconhecido como confiavelmente detectado por exemplo, caso a altura de sinal do máximo 77 local seja maior do que um valor limiar previamente determinado ou dado e quando, além disso, efetivamente há um máximo local, isto é, os valores de intensidade à direita e à esquerda da distância relativa 79 preferida são menores do que a intensidade precisamente com a distância relativa preferida. Com isso, de preferência, pode ser determinada de maneira confiável a distância relativa preferida, em que o raio laser é focado sobre a superfície do biochip. Para se poder separar entre si confiavelmente os máximos 73, 75 e 77, segundo uma forma de execução da presente invenção a resolução do sistema autofoco é aproximadamente igual à profundidade de campo do sistema de microscopia. Pela avaliação de uma máxima intensidade de pixel ou da máxima intensidade de pixel pode resultar uma elevada resolução local do processo de focalização em direção Z.

[0116] Segundo uma forma de execução da presente invenção, o processo é de tal maneira executado que uma distância relativa entre a objetiva e a região de amostra a partir de uma distância máxima pode ser inicialmente reduzida, enquanto de valores de intensidade do pixel da região parcial são detectados, de modo que especialmente primeiramente é detectado um primeiro máximo local da reflexão do raio laser da primeira área limítrofe, depois um segundo máximo local da reflexão do raio laser da segunda área limítrofe e, finalmente, um terceiro máximo local da reflexão do raio laser da terceira área limítrofe. O primeiro máximo local pode ser um máximo global do decurso dos máximos em função da distância relativa. Sendo detectados todos os três máximos (locais) no decurso dos máximos em função da distância relativa, então pode ser melhorada a confiabilidade da focalização. Dentro do decurso dos máximos em função da distância relativa pode ser então determinado um máximo (local) por exemplo quando é ultrapassado um determinado valor limiar da intensidade do pixel. O valor limiar pode, por exemplo, ser derivado do máximo (local) previamente detectado. O primeiro máximo local pode ser maior do que o segundo máximo local e o segundo máximo local pode, por sua vez, ser maior ou essencial igual ao terceiro máximo local. Sendo detectada essa sucessão de máximos, então pode ser aumentada uma confiabilidade da identificação das áreas limítrofes, e com isso a determinação de foco. A distância relativa preferida é então determinada portanto à base do terceiro máximo.

[0117] A Figura 9 mostra uma imagem fluorescente a título de exemplo de um tecido como imagem de valor cinza, sendo que as intensidades de imagem cinza se baseiam em intensidades de vários canais de cor, especialmente um canal verde, um canal vermelho e um canal azul. É mostrada uma imagem fluorescente de um rim de ratos após incubação com um soro de paciente e um anticorpo secundário, que é marcado com um corante fluorescente.

[0118] Para um usuário ou médico, que quer produzir um achado, é então especialmente importante saber que valor de claridade ou valor de intensidade provém de qual faixa de cor ou espaço de cor.

[0119] Na Figura 10 está mostrada uma imagem fluorescente igual à da Figura 9, sendo que ainda estão registradas rebordadas duas estruturas SK1, SK2, que apresentam ou iluminam ambas uma certa claridade até um certo grau.

[0120] Uma tal iluminação pode, de um lado, ser produzida pela excitação de um corante fluorescente unido ao tecido. Alternativamente ou adicionalmente pode também haver uma assim chamada autofluorescência do tecido em uma faixa marrom ou laranja, portanto com uma fração vermelha, que está no tecido independentemente de uma ligação de corantes fluorescentes do anticorpo secundário no tecido. Além disso, uma região do tecido pode também ser iluminada pelo fato de que luz da fonte de luz de excitação é refletida pelo tecido.

[0121] A Figura 11 mostra uma mera informação de canal verde da mesma imagem das Figuras 9 e 10. Vê-se claramente que a estrutura SK1 em um canal verde ou com uma fração de verde é mais intensamente iluminada do que é o caso para a estrutura SK2.

[0122] A Figura 12 mostra uma mera informação de canal vermelho da mesma imagem das Figuras 9 e 10. Aqui se pode ver que tanto a estrutura SK1 como também a estrutura SK2 iluminam no canal vermelho ou com uma fração de vermelho para uma medida aproximadamente igual.

[0123] Com isso, portanto, pode ficar claro que as estruturas SK1 e SK2 iluminando com intensidade semelhante nas Figuras 9 e 10 podem iluminar com base em frações de cor distintas. A estrutura SK1 é antes dominada por sua fração verde enquanto que ambas as estruturas SK1 e SK2 iluminam para uma medida aproximadamente igual com uma fração vermelha. Para um médico de relatório é, portanto, vantajoso receber apresentada uma plena informação de cor de um tecido ou de uma imagem fluorescente como uma imagem de cor com fração de vermelho e fração de verde, para então na imagem de cor com base nas distintas colorações poder concluir se quando da iluminação ou da fluorescência

- se trata de uma fluorescência com base de em uma autofluorescência apenas ou então
- de uma autofluorescência em conjunto com uma fluorescência com base em uma ligação de um específico anticorpo do soro do paciente em combinação com uma ligação do anticorpo secundário marcado com o corante fluorescente.

[0124] O processo de acordo com a invenção bem como o dispositivo de acordo com a invenção são particularmente vantajosos, pois por meio do sensor de imagem e da matriz de filtro de cor, de um lado, pode ser detectada a imagem fluorescente como uma imagem de cor digital com fração de verde e fração de vermelho, mas simultaneamente também sem emprego de um outro sensor de imagem uma reflexão do raio laser por meio do mesmo sensor de imagem com matriz de filtro de cor anteposta, para produzir uma focalização, pois o laser apresenta um comprimento de onda na faixa de infravermelho próximo.

[0125] A Figura 13 mostra um fluxograma de etapas, que o processo executa segundo uma forma de execução preferida.

[0126] Em uma etapa S1 o processador disponibiliza o sinal de controle ST7 para ativação de uma fonte de luz laser. Em uma etapa S2, o processador disponibiliza o sinal de controle ST4 e/ou ST6 para ativação de uma fonte de luz laser. Em uma etapa S2 o processador disponibiliza o sinal de controle ST4 e/ou ST6 para ativação da objetiva e/ou o suporte da amostra, de modo que a objetiva e o suporte da amostra apresentam respectivas distintas distâncias entre si. Em uma etapa S3 detecta o processador respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel para respectivas distâncias relativas, na medida em que o processador recebe do sensor de imagem com a matriz de filtro de cor anteposta para uma respectiva distância relativa uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel.

[0127] De preferência na etapa S3 ocorre especialmente a detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel por meio da detecção de respectivas quantidades parciais de valores de intensidade de pixel de respectivos canais de cor para a correspondente distância relativa. Para tanto, o processador recebe do sensor respectivas quantidades parciais de valores de intensidade de pixel de respectivos canais de cor. O processador determina então a respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel com base nas respectivas quantidades dos respectivos canais de cor por meio de escalonamento dos valores de intensidade de pixel em função do canal de cor e por meio de composição da quantidade dos valores de intensidade de pixel das respectivas quantidades escalonadas de valores de intensidade de pixel.

[0128] Em uma etapa S4 o processador determina para uma respectiva distância relativa uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel detectada ou determinada para a respectiva distância relativa.

[0129] Em uma etapa S5, o processador ajusta pelo sinal de controle ST4 e/ou o sinal de controle ST6 a distância relativa preferida. Em uma etapa S6, o processador ativa por meio do sinal de controle ST3 a fonte de luz de excitação.

[0130] Em uma etapa S7 o processador recebe valores de intensidade de pixel do sensor de imagem e determina ou detecta assim a imagem fluorescente microscópica por meio do sensor de imagem (BS).

[0131] Deve ser entendido que características, que são descritas, explicadas ou previstas individualmente ou em qualquer combinação em conjunto com o processo para tomada de uma imagem de uma região de amostra, podem ser igualmente, individualmente ou em qualquer combinação em um sistema de microscopia, bem empregadas para tomada de uma imagem de uma região de amostra, segundo formas de execução da presente invenção.

[0132] Dependendo de determinados requisitos de implementação, exemplos de execução da invenção podem converter o processador em hardware e/ou em software. Uma conversão do processador aqui mencionado pode aqui ocorrer como ao menos uma unidade ou então por várias unidades em combinação. A implementação pode ser realizada com emprego de um meio de armazenagem digital, por exemplo um Floppy-Disk, um DVD, um Blu-Ray Disc, um CD, um ROM, um PROM, um EPROM, um EEPROM ou um FLASH-armazenador, ou uma placa fixa ou um outro armazenador magnético ou óptico, sobre o qual estão armazenados sinais de controle de leitura eletrônica, que podem de tal maneira cooperar ou cooperam com um componente de hardware programável que é executado o respectivo processo. Um componente de hardware programável pode ser formado como unidade de controle por um processador de computador (CPU = Central Processing Unit), um computador, um sistema de computador, um circuito integrado de aplicação específica (ASIC = Application-Specific Integrated Circuit, um circuito integrado (IC = Integrated Circuit), um EinChip-System (SOC = System on Chip), um elemento lógico programável ou um Gatterarray programável em campo com um microprocessador (FPGA = Field Programmable Gate Array). O meio de armazenagem pode, portanto, ser lido mecanicamente ou por computador. Alguns exemplos de execução compreendem, portanto, um suporte de dados, que apresenta sinais de controle de leitura eletrônica, que estão em condições de cooperar de tal maneira com um sistema de computador programável ou um componente de hardware programável que é executado um dos processos aqui descritos. Em geral, exemplos de execução ou partes dos exemplos de execução da presente invenção podem ser implementados como programa, "firmware", programa de computador ou produto de programa de computador com um código de programa ou como dados, sendo que o código de programa ou os dados são efetivos para executar um dos processos ou uma parte de um processo, quando o programa corre em um processador ou um componente de hardware programável.

Claims

Processo para tomada de uma imagem fluorescente microscópica de uma região de amostra (P) com uma amostra biológica, apresentando:
- - direção de um raio laser (LS) por meio de ao menos uma objetiva (OB) para a região de amostra (P), que apresenta ao menos uma área limítrofe (59), sendo que a objetiva (OB) produz uma focalização do raio laser (OB) em um plano de focalização,
- - alteração de uma distância relativa entre a objetiva (OB) e a região de amostra (P) ao longo de um eixo (AO) óptico da objetiva (OB), para produzir respectivas distâncias relativas distintas,
- - para uma respectiva distância relativa,
- - detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel, que são causadas pelo raio laser (LS) refletido na área limítrofe (57) e retransmitido pela objetiva (OB) em correspondentes pixels sensores de um sensor de imagem (BS),
- - bem como, além disso, determinação de uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel detectada para a respectiva distância relativa,
- - determinação de uma distância relativa preferida com base nas métricas de foco determinadas,
- - ajuste da distância relativa preferida, iluminação da região de amostra (P) com uma radiação de excitação (AS) bem como detecção da imagem fluorescente microscópica por meio do sensor de imagem (BS),
caracterizado pelo fato de que
- - o sensor de imagem (BS) é um fotosensor (PS) com uma matriz de filtro de cor (FFM) anteposta,
- - a imagem fluorescente microscópica é uma imagem em cores,
- - e o raio laser (LS) apresenta um comprimento de onda (WB) próximo à faixa de infravermelho.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a imagem fluorescente microscópica é uma imagem de cor digital, especialmente com ao menos uma fração verde e uma fração vermelha, particularmente de preferência a imagem de cor digital apresenta ainda uma fração azul.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o comprimento de onda é de preferência maior do que 780 nm.
Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o comprimento de onda é de preferência maior do que 800 nm.
Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o comprimento de onda se situa em uma faixa de 780 nm a 1000 nm, de preferência 800 nm a 1000 nm.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz de filtro de cor (FFM) é uma matriz com uma pluralidade de canais de cor, especialmente com ao menos um canal verde e um canal vermelho, de preferência além disso com um canal azul.
Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a matriz de filtro de cor (FFM) é uma matriz Bayer.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fotosensor (PS) é um sensor CMOS ou um sensor CCD.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção de uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel para uma respectiva distância relativa ocorre por meio de uma detecção de respectivas quantidades parciais de valores de intensidade de pixel de respectivos canais de cor, e sendo que a respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel é determinada à base das quantidades parciais.
Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os respectivos canais de cor apresentam no comprimento de onda do raio laser (LS) uma respectiva transmissividade, que divergem no máximo em um fator 5 entre si.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o raio laser (LS) é essencialmente um feixe de raios paralelo, colimado.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que em uma via de raios de detecção entre a objetiva (OB) e o sensor de imagem (BS) está disposta uma lente ou um sistema de lentes (TS), que reproduz um plano focal da objetiva (OB) no sensor de imagem.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de apresentar ainda
- - determinação de um respectivamente máximo valor de intensidade de pixel como uma respectiva métrica de foco para uma respectiva distância relativa à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel,
- - determinação de um curso (73) dos máximos valores de intensidade de pixel por associação do respectivamente máximo valor de intensidade de pixel à respectiva distância relativa,
- - determinação da distância relativa preferida com base em ao menos um máximo (77) curso (73) dos valores de intensidade de pixel.
Processo de acordo com a reivindicação 13, caraterizado pelo fato de apresentar ainda
- - alteração da distância relativa por meio de redução da distância relativa a partir de uma distância máxima para uma distância mínima com emprego de uma primeira resolução de distância, de modo que o curso apresenta valores máximos (73, 75, 77),
- - determinação de uma distância relativa (79) temporariamente preferida com emprego de uma segunda resolução de distância, que é maior do que a primeira resolução de distância, com simultânea detecção de respectivos outros valores de intensidade de pixel máximos (81) como respectivas métricas de foco a respectivas outras distâncias relativas,
- - detecção de uma presença de um máximo (82) local à base dos outros valores de intensidade de pixel máximos (81) e determinação da distância relativa final, preferida, como a distância relativa, à qual há o máximo local.
Sistema de microscopia (V) para a tomada de uma imagem fluorescente microscópica de uma região de amostra (P) com uma amostra biológica, apresentando
um suporte de amostra (PH) para sustentação da região de amostra (P) que apresenta ao menos uma área limítrofe (57), uma fonte de laser (LL) para a produção de um raio laser (LS), uma fonte de luz de excitação (AL) para emissão de luz de excitação (AL) sobre a região de amostra (P), ao menos uma objetiva (OB), que é executada para dirigir o raio laser (LS) para a região de amostra (P) e, além disso, produzir uma focalização do raio laser (LS) em um plano de focalização, bem como um sensor de imagem (BS) para detecção de uma quantidade de valores de intensidade de pixel, que são produzidos pelo raio laser (LS) refletido na área limítrofe (59) e retransmitido pela objetiva (OB) a correspondentes pixels de sensor do sensor de imagem (BS),
sendo que a objetiva (OB) e o suporte de amostra (PH) são deslocáveis relativamente entre si ao longo de um eixo (OA) óptico da objetiva (OB), de modo que uma distância relativa entre a objetiva (OB) e a região de amostra (P) pode ser alterada,
apresentando além disso ao menos um processador (P), que é executado,
- - para ativar de tal maneira a objetiva (OB) e/ou o suporte de amostra (PH) que a objetiva (OB) e o suporte de amostra ou a região de amostra (P) apresentem respectivas distâncias relativas distintas entre si,
- - para uma distância relativa respectiva, para detectar uma quantidade respectiva de valores de intensidade de pixel por meio do sensor de imagem (BS) e ainda para determinar uma respectiva métrica de foco com base na respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel,
- - determinar à base das métricas de foco determinadas uma distância relativa preferida,
- - para ativar a objetiva (OB) e/ou o suporte de amostra (PH) de tal maneira que seja ajustada a distância relativa preferida, ativar ainda a fonte de luz de excitação (AL) bem como detectar a imagem fluorescente microscópica por meio do sensor de imagem (BS),
caracterizado pelo fato de que
- - o sensor de imagem (BS) é um fotosensor com uma matriz de filtro de cor anteposta (FFM),
- - a imagem fluorescente microscópica é uma imagem de cor,
- - e o raio laser (LS) apresenta um comprimento de onda (WB) próximo à faixa de infravermelho.
Processador, apresentando uma ou várias interfaces, sendo que processador é executado para, por uma ou pelas várias interfaces
- - disponibilizar um primeiro sinal de controle para ativação de uma fonte de luz laser,
- - disponibilizar um segundo sinal de controle para ativação de uma objetiva (OB) e/ou um suporte de amostra (PH), de modo que a objetiva e o suporte de amostra apresentam respectivas distâncias relativas diferentes entre si,
- - bem como de um sensor de imagem com uma matriz de filtro de cor anteposta receber em uma respectiva distância relativa uma respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel,
sendo que o processador é ainda executado para determinar uma respectiva métrica de foco à base da respectiva quantidade de valores de intensidade de pixel, bem como determinar à base das métricas de foco determinadas uma distância relativa preferida,
sendo que o processador é executado para disponibilizar por uma ou várias interfaces
- - o segundo ou um outro sinal de controle para ativação da objetiva (OB) e/ou do suporte de amostra (PH) de tal maneira que a distância relativa preferida seja ajustada,
- - além de um terceiro sinal de controle para ativação de uma fonte de luz de ativação (AL),
- - bem como receber do sensor de imagem valores de intensidade de pixel,
sendo que o processador é ainda executado para determinar à base dos valores de intensidade de pixel recebidos uma imagem fluorescente microscópica,
caracterizado pelo fato de que a imagem fluorescente microscópica é uma imagem de cor e sendo que a fonte de luz de laser apresenta um comprimento de onda próximo à faixa de infravermelho.