BR112019025303B1 - Processo e sistema de microscopia para gravação de imagem - Google Patents

Abstract

São providos um processo e um sistema de microscopia para gravação de uma imagem de uma região de amostra, apresentando orientação de um raio laser por meio de pelo menos uma objetiva para a região de amostra, a qual contém pelo menos uma superfície limite, sendo que a objetiva provoca uma ilustração do raio laser em um ponto de focalização que fica no eixo ótico da objetiva ou um eixo paralelo ao mesmo e que fica ainda em um plano de focalização; deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra em relação uma à outra ao longo do eixo ótico da objetiva para várias posições de deslocamento relativo distintas; detecção, para uma respectiva posição de deslocamento, de vários valores de intensidade do raio laser refletido na superfície limite e que passa pela objetiva, os quais são detectados por pixels de uma região parcial bidimensional de uma superfície de detecção de uma câmera microscópica; determinação, para uma respectiva posição de deslocamento relativo, de um respectivo valor de intensidade mais elevado; determinação de uma linha dos valores de intensidade mais elevados; determinação de uma posição de deslocamento relativo de referência a partir de pelo menos um máximo da linha; determinação de (...).

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um processo para gravação de uma imagem de uma região de sonda, especialmente para gravação de uma imagem fluorescente, e refere-se ainda a um sistema de microscopia para gravação de uma imagem de uma região de amostra.

[0002] O documento DE 10 2008 015 885 A1 descreve um processo para autofocalização de aparelhos óticos, sendo que estão previstas uma fonte de luz de medição e uma objetiva para ilustração de um feixe de raios substancialmente paralelos emitido pela fonte de luz de medição sobre um objeto de observação para geração de uma imagem de reflexão, sendo que ainda está prevista uma unidade de avaliação e ajuste, a qual é adequada para determina a posição vocal a partir da imagem de reflexão e posicionar a objetiva. Nesse caso grava- se uma imagem com anéis concêntricos, cujos diâmetros se alteram em função do distanciamento em relação à posição focal correta.

[0003] O documento WO 2016/133787 A1 divulga processos e sistemas para focalização automática de um microscópio em uma sonda e para gravação de uma imagem focalizada da sonda. As medições gravadas são analisadas, para determinar qual medição apresenta um pico, sendo que como valor de pico entende-se uma medição de um raio laser refletido, o qual significa uma intensidade máxima como uma função da posição do substrato ao longo do eixo ótico do microscópio em relação à posição da lente objetiva.

[0004] O documento10 2014 002 584 divulga um processo e um dispositivo ótico para ilustração de um objeto que se encontra dentro de uma região de amostra tridimensional, sendo que um perfil de profundidade da região de amostra é determinado por meio de interferometria de coerência ótica, um pico é reconhecido no perfil deprofundidade, o qual provém de uma reflexão em um ponto do objeto, uma posição de comprimento de caminho ótica do pico é determinada e sendo que, com base nisso, uma posição de comprimento de caminho geométrica do ponto do objeto é calculada. Finalmente o microscópio é focalizado com base na posição de comprimento de caminho geométrica para ilustração do objeto.

[0005] Convencionalmente imagens de microscópio são gravadas em diversas posições de profundidade (posições Z), sendo que a posição focal ótima foi determinada através de uma avaliação da nitidez estrutural das gravações de imagem. Esse processo, porém, é relativamente demorado, de modo que fica dificultado um processamento de alta transferência de dados de uma pluralidade de amostras.

[0006] Em soluções do estado da técnica, como no documento US 20170090176 A1 são projetados modelos expandidos bidimensionalmente em um plano como uma superfície limite refletora, sendo que então o modelo refletido é avaliado em pixels em uma região de máscara virtual por meio de uma unidade de detecção de imagens e, por meio de uma união dos valores de intensidade de vários pixels dentro da máscara virtual, deriva-se uma medida para a focalização entre objetiva e superfície limite ou região de amostra.

[0007] Assim, os processos e sistemas do estado da técnica não podem garantir, em todas as condições, uma focalização rápida e segura de amostras na microscopia, especialmente microscopia de fluorescência.

[0008] Portanto, há uma necessidade de um processo e um sistema de microscopia para gravação de uma imagem de uma região de amostra, sendo que pode ser garantida uma focalização rápida e segura, especialmente de um objeto embutido em uma região de amostra tridimensional.

[0009] A necessidade é satisfeita através dos objetos das reivindicações independentes, as quais estão dirigidas a um processo ou a um sistema de microscopia para gravação de uma imagem de uma região de amostra. As reivindicações dependentes especificam formas de realização especiais da presente invenção.

[0010] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, é provido um processo para gravação de uma imagem de uma região de amostra, apresentando: direcionamento de um raio laser, por meio de pelo menos uma objetiva, a uma região de amostra, a qual contém pelo menos uma superfície limite, sendo que a objetiva provoca uma imagem do raio laser em um ponto de focalização que fica em um plano de focalização, sendo que o plano de focalização fica paralelo ao plano focal e coincide especialmente com o plano focal, sendo que o ponto de focalização preferivelmente fica no eixo ótico da objetiva ou em um eixo paralelo ao mesmo, sendo que o plano de focalização ainda preferivelmente está perpendicular ao eixo ótico da objetiva; deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra em relação uma à outra ao longo do eixo ótico da objetiva para várias posições de deslocamento relativo distintos; detecção, para uma respectiva posição de deslocamento relativo, de vários valores de intensidade do raio laser refletido na superfície limite e através da objetiva, os quais são detectados por pixels de uma região parcial bidimensional de uma superfície de detecção de uma câmara microscópica; determinação, para uma respectiva posição de deslocamento relativo, de um respectivo valor de intensidade mais alto dos respectivos vários valores de intensidade detectados da região parcial; determinação de uma linha do valor de intensidade mais alto através de associação do respectivo valor de intensidade mais alto à respectiva posição de deslocamento relativo; determinação de uma posição de deslocamento relativo de referência a partir de pelo menos um máximo local da linha dos valores de intensidade mais altos e preferivelmente aproximação da posição de deslocamento relativo de referência; detecção de pelo menos uma imagem da região de amostra na posição de deslocamento relativo de referência preferivelmente por meio de leitura da superfície de detecção da câmara microscópica ou de uma superfície de detecção de outra câmara microscópica.

[0011] Para esclarecer ao leitor uma ou várias vantagens do processo de acordo com a invenção e do dispositivo de acordo com a invenção, são feitas agora exposições mais precisas.

[0012] A objetiva está configurada de tal modo, que ela projeta raios laser que ocorrem paralelamente entre si como marcha de raios paralelos ou um feixe de raios colimado, paralelo em sua abertura ótica na direção da fonte de luz laser, para um ponto de um plano focal da objetiva no outro lado do objeto, sendo que o ponto pode ser o ponto focal ou um ponto defasado do ponto focal no plano focal, caso o feixe de raios não esteja concentrado simetricamente com precisão em relação ao eixo ótico da objetiva. Raios laser que a partir deste ponto exato, especialmente do ponto focal, no plano focal, entram de volta na objetiva são convertidos em uma marcha de raios paralelos no lado de abertura ou lado ótico na direção da fonte de laser ou da câmara microscópica.

[0013] Se, por exemplo, o raio laser é um feixe de raios colimados, paralelos, então a objetiva gera uma projeção do raio laser em toda a sua intensidade em um ponto, especialmente o ponto focal, no plano focal da objetiva. A marcha de raios capturada através da objetiva a partir deste ponto, especialmente deste ponto focal, a qual é enfeixada no outro lado da objetiva em uma marcha de raios colimados, pode ser projetada então, por meio de uma lente ligada a jusante da objetiva, preferivelmente de uma lente tubular, sobre um ponto de ilustração em que está disposta a superfície de detecção ou a câmara microscópica.

[0014] No caso de que o raio laser seja uma marcha de raios paralelos, combinados, o raio laser é projetado então através da objetiva sobre um ponto do plano focal, sendo que o ponto pode ser o monto focal ou um ponto defasado do ponto focal no plano focal. Assim existe uma intensidade ótica máxima do raio laser neste ponto no plano focal. Neste caso ou neste exemplo, o plano de focalização e o plano focal coincidem. Se a superfície limite da região de amostra se encontra exatamente no plano focal, através de alteração da posição de deslocamento relativo, então ocorre uma reflexão do raio laser projetado sobre o ponto do plano focal de volta para a objetiva, sendo que a objetiva e a lente tubular então provocam uma imagem dessa reflexão sobre a superfície de detecção ou câmera microscópica. Ou seja, pelo menos um pixel ou um pequeno número de pixels com intensidade especialmente alta se encontra na região parcial da superfície de detecção. Assim, na região parcial pode-se levar em conta o valor de intensidade mais elevado dentro da região parcial, de maneira vantajosa, para obter uma medida para a focalização da região de amostra. Ou seja, em virtude do emprego descrito aqui do raio laser, não é preciso mais processamento ou filtragem dos muitos valores de intensidade da região parcial, mas sim é preciso apenas verificar qual dos valores de intensidade mais elevados correspondentes na posição de deslocamento relativo correspondente está dentro da região parcial. Nesse caso não é importante saber qual pixel detectou o valor máximo dos valores de intensidade, de modo que o processo é especialmente rápido. Se a região de amostra é deslocada em relação à objetiva para outra posição de deslocamento relativo, então ocorre uma reflexão do raio laser não em um ponto individual, que anteriormente era o ponto no plano focal e especialmente o ponto focal, mas sim a reflexão ocorre em uma região de superfície da região de amostra ou superfície limite. Assim a intensidade ótica do raio laser é distribuída através de uma Petição 870220117028, de 14/12/2022, pág. 15/124 região maior da região parcial do que se o raio laser for refletido apenas em um único ponto do plano focal. Portanto, também dentro da região parcial, sobre a superfície de detecção ou na câmara microscópica, resultam valores de intensidade que, na soma, representam ou podem representar ainda toda a intensidade ótica do raio laser, sendo que, porém, o valor de intensidade mais elevado é também menor do que o valor de intensidade mais elevado na configuração em que o raio laser é refletido exatamente no ponto do plano focal por meio da superfície limite. Ou seja, não é preciso levar em conta uma filtragem precisa de um modelo refletido, por exemplo, por meio de um diafragma, através de avaliação da região parcial ou seu pixel, mas sim a avaliação do valor de intensidade mais elevado para uma respectiva posição de deslocamento relativo permite uma focalização especialmente simples e rápida ou determinação da posição de deslocamento relativo de referência com uma resolução local especialmente alta. No caso de existirem várias superfícies limite, pode-se detectar, por meio da linha dos valores de intensidade mais elevados, por exemplo, uma terceira superfície limite, para determinar uma posição de deslocamento relativo de referência. Assim, a sensibilidade do processo pode ser aumentada e a expansão do raio laser ilustrado na direção de profundidade pode ser substancialmente igual a uma profundidade de campo da ótica.

[0015] No caso de que o raio laser convirjam da fonte de luz laser para a abertura da objetiva, resulta uma focalização do raio laser sobre o ponto de focalização em um plano de focalização não coincide com o plano focal da objetiva, mas fica paralelo ao mesmo; o plano de focalização passa estende-se então perpendicular ao eixo ótico da objetiva. Se então uma reflexão do raio laser em uma superfície limite é detectado da maneira descrita anteriormente por meio de consideração do valor de intensidade mais elevado, então a superfície limite encontra- se no plano de focalização, mas não no plano focal da objetiva, mas sim especialmente um pouco mais próxima em relação à objetiva do que o plano de focalização. Se essa defasagem entre o plano de focalização e o plano focal for conhecida, uma vez que o ângulo de convergência do raio laser antes da entrada na objetiva é conhecido, então essa defasagem pode ser empregada como um valor armazenado ou predeterminado, para provocar uma focalização final da região de amostra na direção do plano focal. Isto pode ser vantajoso especialmente quando inicialmente em uma primeira resolução de afastamento mais grosseira é estimada com o auxílio de vários máximos da linha dos valores de intensidade mais elevados e quando então, após uma inversão de direção do deslocamento relativo, a objetiva e a região de amostra são posicionadas ou deslocadas em relação uma à outra novamente em uma segunda resolução de distanciamento mais fina. Se, durante esse segundo deslocamento, for detectado o máximo correspondente da linha, com a solução de distanciamento mais elevada, então será detectada a existência do máximo com maior precisão somente durante o segundo deslocamento, quando pelo menos dois valores de intensidade mais elevados sucessivos indicarem uma primeira derivação positiva na direção de deslocamento atual. Então a defasagem ótica conhecida descrita anteriormente entre o plano de focalização e o plano focal pode ser utilizada para provocar um alinhamento definitivo da região de amostra em relação à objetiva para uma focalização efetiva da região de amostra no plano focal, sem que seja necessária uma invenção de direção durante o deslocamento relativo. No caso de uma inversão de direção durante o deslocamento relativo, tolerâncias de alinhamento de elementos de guia mecânicos da objetiva e/ou da região de amostra podem ter tal efeito, que a posição relativa desejada entre objetiva e região de amostra é falsificada. Tais tolerâncias de alinhamento são designadas também como jogo de inversão da mecânica. Por meio das variantes descritas aqui com desdobramento do plano de focalização e do plano focal, pode-se dispensar a referida inversão de direção, para assim evitar um efeito negativo de tolerâncias de alinhamento.

[0016] De acordo com uma forma de realização, o raio laser apresenta um feixe de raios colimados, paralelos, sendo que o plano de focalização do raio laser coincide com o plano focal da objetiva. Especialmente o ponto de focalização coincide, de preferência, com o ponto focal da objetiva. Especialmente um diâmetro de seção transversal do raio laser é substancialmente igual à abertura da objetiva.

[0017] No sentido deste pedido de patente o conceito plano focal pode ser designado também como o conceito de plano de distância focal.

[0018] De acordo com uma forma de realização o processo proposto apresenta ainda as etapas: deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra em relação uma à outra por meio de redução de um distanciamento relativo entre a objetiva e a região de amostra a partir de um distanciamento maior para um distanciamento menor com o emprego de uma solução de distanciamento, de modo que a linha apresenta vários máximos; determinação da posição de deslocamento relativo de referência com base nos vários máximos como uma primeira posição de deslocamento relativo de referência; ampliação do distanciamento relativo em relação à primeira posição de deslocamento relativo de referência com uma segunda resolução de distanciamento, a qual é mais alta do que a primeira resolução de distanciamento, com detecção simultânea de outros valores de intensidade mais elevados, outras posições de deslocamento relativa; detecção de uma presença de um máximo local com base nos outros valores de intensidade mais elevados. com o plano focal da objetiva. Nesse caso ocorre então um ajuste da posição de deslocamento relativo como uma posição de deslocamento relativo de referência, na qual está ou esteve presente o máximo local detectado com base nos outros valores de intensidade mais elevados.

[0019] De acordo com uma forma de realização o raio laser apresenta um feixe de raios colimado, paralelo, na direção da objetiva, sendo que, além disso, o plano de focalização do raio laser coincidecom o plano focal da objetiva. Nesse caso ocorre então um ajuste da posição de deslocamento relativo como uma posição de deslocamento relativo de referência, na qual está ou esteve presente o máximo local detectado com base nos outros valores de intensidade mais elevados.

[0020] De acordo com uma forma de realização o raio laser apresenta um feixe de raios convergente na direção da objetiva, sendo que, além disso, o plano de focalização do raio laser não coincide com o plano focal da objetiva. Nesse caso ocorre então uma nova ampliação do distanciamento relativo em um valor padrão predeterminado em uma posição de deslocamento relativo de referência final. O plano de focalização, nesta forma de realização, não coincide com o plano focal da objetiva, mas fica paralelo a ela, sendo que o plano de focalização estende-se perpendicularmente ao eixo ótico.

[0021] Antes da leitura dos pixels da superfície de detecção de uma ou da outra câmera microscópica, a fonte do raio laser pode ser desativada e uma fonte de luz fluorescente pode ser ativada para excitação de uma radiação fluorescente da amostra.

[0022] O raio laser pode compreender radiação eletromagnética na faixa de comprimentos de onda visível e/ou invisível (por exemplo, infravermelha, ultravioleta).

[0023] O processo pode ser realizado com um sistema de microscopia de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0024] No caso da região de amostra pode tratar-se de uma região de amostra expandida em três dimensões, a qual assim está expandida em duas direções laterais, bem como está expandida em uma direção de profundidade perpendicular àquelas. Especialmente, dentro da região de amostra, em uma determinada profundidade, pode-se encontrar uma amostra (biológica), da qual se pode gravar uma imagem focalizada, especialmente imagem fluorescente. O processo (e o sistema de microscopia) pode ser empregado especialmente no diagnóstico autoimune para avaliação de preparados de fluorescência imunológica. Especialmente o processo e o sistema de microscopia podem apoiar um teste de fluorescência imunológica (IIFT) infectado. O processo pode garantir um processamento rápido das amostras encontradas, o que requer uma focalização rápida das amostras.

[0025] A objetiva pode compreender uma ou várias lentes, as quais podem estar dispostas uma atrás da outra ao longo do eixo ótico da objetiva. A objetiva pode proporcionar, por exemplo, uma ampliação de 10 vezes, 20 vezes ou, por exemplo, 40 vezes e apresentar, por exemplo, uma abertura numérica entre 0,3 e 0,8. A luz que provém da região de amostra por último utilizada para uma gravação da imagem pode compreender luz visível, por exemplo, luz verde, luz vermelha e/ou luz azul e pode ter sido emitida da região de amostras especialmente através de emissão de fluorescência após excitação de fluorescência.

[0026] A região (de profundidade), na qual a amostra é processada nitidamente no plano de objetiva do microscópio, a chamada profundidade de campo, depende então da abertura numérica NA da objetiva. Nesse caso existe, entre a profundidade de campo tw, o comprimento de ondas do centro de gravidade Ào do espectro de luz a ser ilustrado e a abertura numérica NA a seguinte relação

[0027] Tw = À0/NA2.

[0028] A profundidade de campo pode ficar, por exemplo, entre 500 nm e 6000 nm, especialmente entre 700 nm e 1100 nm. Formas de realização da presente invenção podem determinar a posição de deslocamento relativo de referência com uma precisão que é substancialmente igual à profundidade de campo da objetiva. Assim pode-se garantir uma focalização segura.

[0029] Para o deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra a objetiva e/ou a região de amostra podem ser deslocadas. Nesse caso o distanciamento entre objetiva e região de amostra é variado, ocorre um movimento relativo entre objetiva e região de amostra. Esse deslocamento pode ocorrer através de um controle de um meio de acionamento através de um processador, sendo que o meio de acionamento altera e desloca a objetiva e/ou a região de amostra em sua posição.

[0030] Para deslocamento relativo (ou movimento ao longo da direção z, isto é, da direção de profundidade) da objetiva e da região de amostra, a região de amostra pode ser movimentada, por exemplo, em relação a uma objetiva estacionária ou a objetiva pode ser movimentada em relação a uma região de amostra estacionaria (na direção Z, isto é, direção de profundidade).

[0031] Um laser empregado pode apresentar, por exemplo, um espectro de emissões na faixa de comprimento de ondas vermelha visível. Especialmente esse raio laser pode apresentar comprimentos de onda que se sobrepõem com comprimentos de onda que estão previstos para gravação da imagem da região de amostra. Por exemplo, o comprimento de ondas do raio laser pode sobrepor-se com um espectro de emissões que é detectado na microscopia de fluorescência. Assim preferivelmente apenas uma (única) câmera de microscópico é necessária, para, por um lado, apoiar uma focalização e, por outro lado, apoiar a gravação tensionada da imagem. O raio laser pode ser acoplado, por exemplo, na marcha dos raios com o auxílio de um divisor de raios. De preferência, uma expansão de seção transversal do raio laser pode ser substancialmente igual a um diâmetro da região de entrada (ou da abertura ou da abertura de pupila) da objetiva.

[0032] A dita pelo menos uma superfície limite pode ser, por exemplo, uma superfície limite plana, por exemplo, entre um material sólido e ar, entre um material sólido e um líquido ou entre um material sólido e uma amostra (orgânica). A existência da dita pelo menos umasuperfície limite pode facilitar uma focalização ou aumentar a segurança da focalização.

[0033] A câmera microscópica ou outra câmera microscópica pode estar prevista convencionalmente para gravação da imagem, sendo que a imagem pode estar formada através da totalidade dos valores de intensidade dos pixels da superfície de detecção da câmera microscópica. Porém, para focalização - e especialmente para determinação da posição de deslocamento relativo de referência - somente pixels de uma região parcial bidimensional de toda a superfície de detecção da câmera microscópica são necessários ou lidos, sem ter que ler, com gasto de tempo, os pixels restantes da superfície de detecção fora da região parcial. Assim o processo pode ser acelerado. A região parcial bidimensional pode ter, por exemplo, um tamanho de 16 x 16 pixels em uma superfície de detecção preferida de 2440 x 2080 pixels, a qual corresponda especialmente a cerca de 0,005% da superfície de detecção.

[0034] Raios laser que partem de um ponto em diferentes direções, especialmente o ponto focal do plano focal da objetiva do lado de objetiva são quebrados através da objetiva em raios paralelos, de modo que existe um feixe de raios paralelos a partir da vista do plano focal atrás (ou a jusante da corrente de luz) da objetiva. Uma lente conectada a jusante da objetiva (como, por exemplo, uma lente tubular) coleta os raios paralelos em um plano focal do lado da imagem dessa outra lente em um ponto. Nesse caso a superfície de detecção da câmera microscópica fica no plano focal do lado da imagem dessa outra lente. No caso da superfície de detecção pode tratar-se, por exemplo, de um conjunto ou um campo (especialmente campo bidimensional) de células sensíveis à luz, por exemplo, células sensíveis a CCD ou CMOS.

[0035] O tamanho da superfície predeterminada da região parcial pode estar escolhido preferivelmente de tal modo, que fica asseguradoque substancialmente só luz que é emitida a partir de um determinado ponto no plano focal do lado de objetiva da objetiva em diferentes direções, é detectada através dos pixels da superfície predeterminada. Assim luz que provém não do plano de objeto da objetiva pode ser excluída pela detecção. O tamanho da superfície predeterminada pode ser, por exemplo, de alguns micrômetros quadrados.

[0036] Enquanto que o distanciamento entre a objetiva e a região de amostra é variado na direção de profundidade ao longo das posições de deslocamento relativo discretas, simultaneamente os valores de intensidade dos pixels da região parcial bidimensional são lidos; então para cada posição de deslocamento relativo (isto é, para cada distanciamento entre objetiva e região de amostra) é determinado o valor de intensidade mais elevado dos valores de intensidade dos pixels. Ou seja, como valor de intensidade mais elevado é determinado o valor exatamente de um pixel da região parcial para uma respectiva posição de deslocamento relativo.

[0037] Cada valor de intensidade mais elevado determinado dessa maneira é associado à respectiva posição de deslocamento relativo. Assim uma pluralidade de valores de intensidade mais elevados é determinada para a pluralidade de distintas posições de deslocamento relativo. A linha resultante para diversas posições de deslocamento relativo pode apresentar então vários máximos locais ou um máximo global. Os máximos locais e também o máximo global podem indicar uma respectiva reflexão do raio laser em uma das superfícies limite. A posição de deslocamento relativo de referência pode corresponder então, por exemplo, a um distanciamento entre a objetiva e a região de amostra, na qual o raio laser é focalizem uma determinada superfície limite dentro da região de amostra, especialmente uma superfície limite entre um suporte de substrato, doravante designado como Biochip (especialmente superfície do Biochip), e um meio de cobertura (ou meio de embutimento). A determinação da posição de deslocamento relativo de referência pode facilitar então um ajuste de uma posição de deslocamento relativo para gravação da imagem. Por exemplo, a imagem pode ser gravada quando do ajuste da posição de deslocamento relativo de referência; então preferivelmente outras imagens podem ser gravadas em posições em torno da posição de deslocamento relativo de referência, por exemplo, em outras posições de deslocamento relativo, as quais tenham um distanciamento um pouco (alguns micrômetros) maior (e/ou menor) entre objetiva e região de amostra. Maiores conhecimentos sobre a natureza e a geometria de uma amostra que se encontre dentro da região de amostra podem facilitar um ajuste adequado de uma posição de deslocamento relativo para gravação da imagem a partir da posição de deslocamento relativo de referência.

[0038] Para determinação da posição de deslocamento relativo de referência, preferivelmente uma pluralidade de imagens parciais pode ser recebida durante o deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra e ser avaliada continuamente no sentido do respectivo valor de intensidade mais elevado. Nesse caso, por exemplo, podem ser gravadas umas mil imagens parciais por segundo. Os tempos de exposição podem ficar na faixa de microssegundos. Um incremento na direção de profundidade entre duas imagens parciais pode ficar entre 200 nm e 1000 nm, especialmente em cerca de 500 nm. O incremento entre duas imagens parciais não deve ser maior do que a profundidade de campo do microscópio.

[0039] Assim pode ser garantida uma focalização segura para gravação da imagem e pode ficar garantido um alto rendimento em virtude da rápida determinação de foco.

[0040] De acordo com uma forma de realização, o processo apresenta ainda as etapas: deslocamento relativo da objetiva e daregião de amostra entre si ao longo do eixo ótico em respectivas posições de deslocamento relativo terminais acima e/ou abaixo da posição de deslocamento relativo de referência ou da posição de deslocamento relativo de referência final; detecção de respectivas imagens nas respectivas posições de deslocamento relativo terminais por meio da primeira ou da outra câmera microscópica e armazenamento das respectivas imagens; determinação das respectivas métricas de foco para as respectivas imagens; seleção da imagem que apresenta a melhor métrica de foco. Preferivelmente rejeição das outras imagens que não apresentam a melhor métrica de foco. Assim é possibilitado obter, de maneira automatizada, uma imagem que seja ótima no sentido de sua focalização, sem ter que mandar um usuário observar e fazer um ajuste através do mesmo, uma vez que a imagem é diretamente armazenada; o microscópio então não precisa ser colocado em um estado operacional no fim do processo, no qual objetiva e região de amostra estejam alinhados entre si de maneira ótima, mas sim a imagem pode ser chamada de uma memória em um momento posterior. A métrica de foco mencionada aqui pode basear-se preferivelmente em um ou vários dos seguintes operadores: Marr- Hildreth-Operator, Laplacian-of-Gaussian e Difference-of-Gaussian.

[0041] De acordo com uma forma de realização, um diâmetro do raio laser está dimensionado de tal modo, que a abertura total da objetiva é iluminada.

[0042] De acordo com uma forma de realização, a região parcial é inferior a 1/10 da superfície de detecção, especialmente inferior a 1/100 da superfície de detecção. Preferivelmente a região parcial é inferior a 50x50 Pixels, especialmente inferior a 20x20 Pixels.

[0043] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que a região parcial tem um tamanho entre 305 μmA2 e 6400 μmA2, especialmente entre 750 μmA2 e 1300 μmA2, e especialmente esteja formado de 16 x 16 Pixels, sendo que a superfície de detecção tem especialmente um tamanho que é entre 10 e 100 vezes maior do que o tamanho da região parcial. Quanto menor a região parcial for escolhida, tanto mais rapidamente o processo pode ser realizado.

[0044] De acordo com uma forma de realização, em uma marcha dos raios de detecção entre a objetiva e a superfície de detecção, está disposta uma lente, especialmente uma lente tubular, que ilustra um plano focal da objetiva na superfície de detecção. Atrás (ou a jusante do fluxo de luz da) da objetiva pode haver uma marcha de raios paralelos e os raios paralelos podem ser ilustrados pela lente tubular em um plano focal do lado de imagem. Assim um deslocamento da objetiva em relação à lente tubular não tem influência sobre a ilustração dos raios paralelos no plano focal do lado de imagem da lente tubular. Em um determinado ponto dentro da região parcial da superfície de detecção só chegam raios que partiram de um determinado ponto em comum no plano focal da objetiva em diversas direções, especialmente o ponto focal. Através de escolha adequada do tamanho da superfície predeterminada luz difusa (que não partiu de um ponto no plano focal do lado de objeto da objetiva em diversas direções) pode ser excluída pela detecção para focalização.

[0045] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que pelo menos uma superfície limite, especialmente duas superfícies limite, não confina com ar, sendo que a região de amostra compreende especialmente uma amostra orgânica, a qual encosta sobre um Biochip, está embutida em uma substância líquida e está coberta por um vidro de cobertura, sendo que ainda especialmente o lado superior do vidro de cobertura forma uma primeira superfície limite, sendo que o lado inferior do vidro de cobertura forma uma segunda superfície limite, e sendo que a superfície Petição 870220117028, de 14/12/2022, pág. 26/124 do Biochip forma uma terceira superfície limite. A amostra orgânica pode compreender, por exemplo, uma amostra histológica, a qual está colorida, por exemplo, e/ou foi destacada com um ou vários marcadores de fluorescência ou uma ou várias moléculas de fluorescência. Os marcadores de fluorescência ou as moléculas de fluorescência podem estar ligados (as) à amostra orgânica em pontos ou receptores ou antígenos predeterminados. A substância líquida pode compreender, por exemplo, glicerina. A amostra orgânica pode ser, por exemplo, uma amostra orgânica úmida, sendo que pode estar impedido que a amostra se seque. Formas de realização da invenção possibilitam ilustrar uma amostra orgânica embutida em um líquido (tridimensionalmente, isto é, substancialmente por todos os lados). As superfícies limite podem estar caracterizadas através de uma alteração do índice de refração acima e abaixo da superfície limite. Por exemplo, na superfície limite entre um meio líquido e um meio sólido, o índice de refração pode alterar-se menos do que em uma superfície limite de ar em relação a um meio sólido, por exemplo, vidro. O grau de reflexão na superfície limite pode ser tanto menor quanto menor for a alteração do índice de refração da superfície limite. Apesar de uma reflexão relativamente pequena na terceira superfície limite, esta pode ser detectada através do processo de acordo com a invenção.

[0046] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que um distanciamento relativo entre a objetiva e a região de amostra a partir de um distanciamento maior é inicialmente reduzido, enquanto que valores de intensidade dos pixels da região parcial são detectados, de modo que, especialmente no começo, são detectados um primeiro máximo local da reflexão do raio laser procedente da primeira superfície limite, depois um segundo máximo local da reflexão do raio laser procedente da segunda superfície limite e, finalmente, um terceiro máximo local da reflexão do raio laser procedente da terceira superfície limite. O primeiro máximo local pode ser um máximo global da linha de máximos em função da posição de deslocamento relativo. Se todos os três máximos (locais) são detectados na linha dos máximos em função da posição de deslocamento relativo, então a confiabilidade da focalização pode ser melhorada. Dentro da linha dos máximos em função da posição de deslocamento relativo pode ser determinado então um máximo (local), por exemplo, quando um determinado valor limite da intensidade do pixel for ultrapassado. O valor limite pode ser derivado, por exemplo, do máximo (local) detectado anteriormente. O primeiro máximo local pode ser maior do que o segundo máximo local e o segundo máximo local, por sua vez, pode ser superior ou substancialmente igual ao terceiro máximo local. Se esta sequência de máximos for detectada, então uma confiabilidade da identificação das superfícies limite e, com isso, a determinação de foco, pode ser elevada. A posição de deslocamento relativo de referência é determinada então com base no terceiro máximo.

[0047] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que a posição de deslocamento relativo de referência corresponde à posição de deslocamento relativo para a qual o raio laser refletido na terceira superfície limite, especialmente a superfície do Biochip, focaliza é ilustrado na região parcial da superfície de detecção, sendo que especialmente a posição de deslocamento relativo é ajustada para gravação da imagem a partir de conhecimento prévio sobre a amostra, a partir da posição de deslocamento relativo de referência. Por exemplo, a espessura da amostra (no Biochip) pode ser conhecida previamente, pelo menos aproximadamente, e ser predeterminada como valor padrão. A partir da posição de deslocamento relativo de referência (em que a superfície do Biochip fica no plano focal da objetiva) o distanciamento entre objetiva e região de amostra pode ser alterado ou corrigido, por exemplo, em função do valor padrão, por exemplo, em alguns micrômetros (dependendo da espessura da amostra conhecida previamente, para atender a um tipo de amostra ou tipo de substrato. Preferivelmente podem ser gravadas várias imagens em posições de deslocamento, as quais ficam em torno da posição de deslocamento relativo de referência corrigida.

[0048] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que, entre a fonte do raio laser e a objetiva, para reflexão do raio laser através da objetiva, está disposto um divisor de raios dicroico ou não dicroico, o qual apresenta especialmente um grau de reflexão para o raio laser de entre 5% e 20%. Assim o raio laser pode ser acoplado na marcha de raios da objetiva de maneira simples. Quando o grau de reflexão para o raio laser é relativamente pequeno, por exemplo, substancialmente 10%, então somente uma pequena parte da luz, que está prevista para gravação da imagem, pode ser excluída pela detecção através da câmera microscópica. Em outras formas de realização, o divisor de raios pode ser removido da marcha dos raios também quando a imagem da região de amostra é gravada.

[0049] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que o divisor de raios apresenta uma forma de cunha, sendo que planos de um lado anterior e de um lado posterior do divisor de raios se cortam em um ângulo de cunha, o qual fica especialmente, por exemplo, entre 0,1 grau e 1 grau, sendo que o ângulo de cunha e o tamanho da região parcial estão escolhidos especialmente de tal modo, que apenas um reflexo do raio laser, o qual é ilustrado na região parcial após reflexão ou do lado anterior ou do lado posterior do divisor de raios e após reflexão da região de amostra. O divisor de raios com uma forma de cunha pode impedir a ocorrência de interferências, as quais podem ocorrer através de reflexão em um lado anterior ou um lado posterior de um divisor de raios formado como placa plana. Para focalização pode-se empregar especialmente a luz de laser refletida no lado anterior do divisor de raios em forma de cunha. A luz de laser refletida no lado posterior do divisor de raios em forma de cunha é focalizada no plano focal do lado de objeto da objetiva em um local lateralmente diferente. Através de escolha adequada do tamanho e da posição da região parcial bidimensional da superfície de detecção da câmera microscópica um raio laser refletido no divisor de raios em forma de raios pode ser excluído pela detecção. Assim o processo pode ser aperfeiçoado. Preferivelmente a região parcial compreende todos os pixels da superfície de detecção.

[0050] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o processo está configurado de tal modo, que, entre 1000 e 10000 vezes por segundo, os valores de intensidade dos pixels da região parcial são lidos durante o deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra, para determinar a posição de deslocamento relativo de referência.

[0051] Deve-se entender que características que estão descritas, esclarecidas ou previstas individualmente ou em alguma combinação em relação ao processo para gravação de uma imagem podem ser aplicadas também individualmente ou em alguma combinação a um sistema de microscopia para gravação de uma imagem de uma região de amostra, de acordo com formas de realização da presente invenção.

[0052] De acordo com uma forma de realização da presente a objetiva provoca ainda uma ilustração do raio laser em um ponto de focalização, fica em um plano de focalização, o qual é paralelo ao plano focal e preferivelmente coincide com o mesmo, e o qual preferivelmente fica no eixo ótico da objetiva ou de um eixo paralelo àquele; além disso, a objetiva pode ser deslocada para várias posições de deslocamento relativo distintas em relação à região de amostra ao longo do eixo ótico; apresentando ainda pelo menos uma câmera microscópica com uma superfície de detecção, sendo que a câmera microscópica está configurada para detectar, para uma respectiva posição de deslocamento relativo, vários valores de intensidade do raio laser refletido na superfície limite e que passa pela objetiva, sendo que os valores de intensidade são detectados por pixels de uma região parcial bidimensional de uma superfície de detecção de uma câmera microscópica são detectados; pelo menos um processador, o qual está configurado para determinar, para uma respectiva posição de deslocamento relativo, um respectivo valor de intensidade mais elevado dos valores de intensidade detectados da região parcial, o qual está configurado, o qual está configurado ainda para determinar uma posição de deslocamento relativo de referência a partir de um máximo local da linha 67 dos valores de intensidade mais elevados, o qual está configurado ainda para ajustar um meio de acionamento 15 para aproximação da posição de deslocamento relativo de referência, e o qual está configurado ainda para detectar uma imagem da região de amostra por meio da câmera microscópica ou de uma outra câmera microscópica.

[0053] Formas de realização da presente invenção são esclarecidas agora com referência aos desenhos anexos. A invenção não está limitada às formas de realização descritas e ilustradas.

[0054] Figura 1 mostra, em uma vista lateral esquemática, um sistema de microscopia de acordo com uma forma de realização dapresente invenção;

[0055] Figura 2 mostra, em uma vista lateral esquemática ou vista de corte lateral, uma região de amostra com uma amostra, da qual se pode gravar uma imagem com utilização do sistema de microscopia ilustrado na figura 1;

[0056] Figura 3 ilustra um exemplo de uma imagem gravada por uma câmera microscópica;

[0057] Figuras 4a, 4b e 4c ilustram exemplos de uma região parcial de uma superfície de detecção de uma câmera microscópica com imagens parciais gravadas em diversas posições de deslocamento relativo e a figura 4d mostra um exemplo de uma superfície predeterminada dentro da região parcial;

[0058] Figura 5 ilustra uma linha de valores de intensidade mais elevados em função de uma posição de deslocamento relativo, como ele é determinado de acordo com uma forma de realização do processo;

[0059] Figura 6 mostra outro exemplo de um máximo local em uma linha de valores máximos em função de uma posição de deslocamento relativo, como determinado de acordo com uma forma de realização do processo;

[0060] Figura 7 ilustra uma vista de corte lateral esquemática de um sistema de microscopia de acordo com uma forma de realização da presente invenção na região de um divisor de raios em forma de placa;

[0061] Figura 8 ilustra, em uma vista de corte lateral esquemática, uma parte de um sistema de microscopia de acordo com uma forma de realização da presente invenção na região de um divisor de raios em forma de cunha; e

[0062] Figura 9 ilustra uma forma de realização do sistema de microscopia de acordo com a invenção, na qual ocorre uma focalização do raio laser em um plano de focalização que não coincide com o plano focal da objetiva; Petição 870220117028, de 14/12/2022, pág. 32/124

[0063] Figuras 10a e 10b ilustram uma reflexão do raio laser em uma superfície limite em distintos planos óticos, e

[0064] Figuras 11a a 11d ilustram distintas posições da região de amostra em uma realização de uma forma de realização do processo de acordo com a invenção, na qual o plano de focalização do raio laser está devassado em relação ao plano focal da objetiva.

[0065] O sistema de microscopia 100 ilustrado em uma vista de corte lateral esquemática na figura 1 compreende uma objetiva 3, a qual pode ser deslocada em relação à região de amostra 2 ao longo de um eixo ótico 13 da objetiva. Geralmente a objetiva 3 e a região de amostra 2 podem ser deslocadas em relação uma à outra ao longo do eixo ótico 13. Para isto está previsto um meio de acionamento 15, o qual está configurado para deslocar uma mesa microscópica 1 (ou a objetiva 3) ao longo das direções de sega 17 (isto é, em direção Z ou em direção vertical), enquanto que a objetiva 3 está fixa, ou deslocar a objetiva, enquanto que a mesa está fixa. O sistema de microscopia 100 compreende ainda um laser 10, o qual está configurado para gerar um raio laser 19, o qual é dirigido para a região de amostra 2 através da objetiva. A fonte de luz laser ou o laser 10 contém uma ótica de colimação 10a, por meio da qual o raio laser pode ser conformado em um feixe de raios paralelos, colimados. Preferivelmente a ótica de colimação 10a é ajustável, para formar o raio laser como um feixe de raios convergentes. A região de amostra contém pelo menos uma superfície limite, como é esclarecido mais abaixo em relação à figura 12. Para desviar o raio laser 19 através da objetiva 3, está previsto ainda um divisor de raios 11. A objetiva 3 provoca uma ilustração do raio laser em um ponto de focalização que fica no eixo ótico da objetiva ou em um eixo paralelo ao mesmo e que ainda fica em um plano de focalização que fica paralelo ao plano focal da objetiva e preferivelmente coincide com o plano focal. O plano de focalização estende-se perpendicularmente ao eixo ótico da objetiva 3.

[0066] Em uma forma de realização, o plano de focalização do raio laser 19 coincide com o plano focal da objetiva, sendo que, de preferência, especialmente o ponto de focalização coincide com o ponto focal da objetiva. O ponto de focalização fica preferivelmente no plano focal. Preferivelmente o raio laser 19 apresenta um feixe de raios colimados, paralelos, como representado na figura 1. Preferivelmente assim um diâmetro de seção transversal d do raio laser 19 é substancialmente igual à abertura da objetiva 3 no ponto em que o raio laser 19 entra na objetiva 3; em outras palavras, o diâmetro d do raio laser 19 está dimensionado de tal modo, que a abertura total da objetiva 3 no ponto em que o raio laser 19 entra na objetiva 3 é iluminada.

[0067] Em outra forma de realização o raio laser apresenta um feixe de raios convergente para a objetiva, como será descrito ainda em relação à figura 9. Preferivelmente nesse caso o plano de focalização do raio laser não coincide com o plano focal da objetiva, de modo que especialmente o ponto de focalização não coincide com o ponto focal da objetiva. Preferivelmente o plano de focalização do raio laser apresenta um menor distanciamento da objetiva do que o plano focal da objetiva. Porém, neste caso também o plano de focalização se estende perpendicularmente ao eixo ótico da objetiva 3. Neste caso também o plano de focalização se estende paralelamente ao plano focal.

[0068] O sistema de microscopia 100 da figura 1 compreende ainda pelo menos uma câmera microscópica 8 com uma superfície de detecção 29, a qual está configurada para detectar valores de intensidade detectados por pixels de uma região parcial bidimensional do raio laser 19 refletido a partir da região de amostra 2 e que passa através da objetiva 3. Na forma de realização 100 do sistema de microscopia ilustrada aqui na figura 1, para desvio de luz vermelha que entrou através da objetiva 3 bem como da lente tubular 6, está previsto um conjunto de filtro 7 para refletir luz com uma percentagem vermelha para a câmera microscópica 8. Para isto o conjunto de filtro 7 está previsto para uma separação de canais vermelho-verde. Especialmente o conjunto de filtro 7 compreende um espelho 21 semipermeável, bem como um filtro vermelho 23, o qual filtra comprimentos de onda fora de uma faixa de comprimentos de onda vermelha, de modo que somente comprimentos de onda de uma faixa vermelha desejada incidem sobre a superfície de detecção 29 da câmera microscópica 8.

[0069] O conjunto de filtro 7 compreende ainda, preferivelmente, um filtro verde 25, para deixar passar apenas uma faixa verde desejada preferivelmente para a segunda câmera microscópica 9 existente. A segunda câmera microscópica 9 é opcional, em outras formas de realização só precisa estar prevista uma única câmera microscópica. O conjunto de filtro 7 também é opcional e pode ser omitido em outras formas de realização. Nestas formas de realização a câmera microscópica 8 pode estar disposta ao longo do eixo ótico 13, em vez da segunda câmera microscópica 9. Para determinados exames de fluorescência, porém, pode ser vantajoso receber a luz fluorescente de vários fluoróforos separadamente através de duas câmeras microscópicas ou dois canais de detecção.

[0070] O sistema de microscopia compreende ainda uma lente 6 (representada esquematicamente na figura 1), especialmente uma lente tubular, ou um sistema de lentes 6, a qual ou o qual está disposta (o) entre a objetiva 3 e a câmera microscópica 8 em uma marcha de raios e que forma, juntamente com a objetiva 3, um plano focal 27 da objetiva 3 na superfície de detecção 29 da câmera microscópica 8. Especialmente a objetiva e a lente 6 formam juntas um sistema ótico que provoca uma ilustração do ponto focal do plano focal da objetiva em um pondo de imagem de um plano de imagem em que a superfície de detecção 26 se encontra. A superfície de detecção 29 da câmera de microscopia 8 fica em um plano focal 31 da lente 6.

[0071] O sistema 100 pode detectar vários valores de intensidade do raio laser refletido na superfície limite e que passa pela objetiva, para uma respectiva posição de deslocamento relativo, sendo que os valores de intensidade são detectados por pixels de uma região parcial bidimensional da superfície de detecção 29 da câmera microscópica 8.

[0072] O sistema de microscopia 100 compreende ainda um processador 33, o qual está configurado para determinar um respectivo valor de intensidade mais elevado dos valores de intensidade detectados da região parcial 65 para uma respectiva posição de deslocamento relativo. Um valor de intensidade mais elevado determinado desta maneira é associado à posição de deslocamento relativo correspondente, de modo que, a partir de tais respectivos valores de intensidade mais elevados para respectivas posições de deslocamento relativo, é determinada uma linha de valores de intensidade mais elevados. Então é determinada uma posição de deslocamento relativo de referência a parir de pelo menos um máximo especialmente local da linha dos valores de intensidade mais elevados. O processador controla então, com o emprego de uma unidade de controle 37, o meio de acionamento 15 para aproximação da posição de deslocamento relativo de referência. Além disso, o processador 33 detecta, por meio da câmera microscópica 8 ou de outra câmera microscópica 9, uma imagem da região de amostra. Nesse caso o processador 33 transmite um sinal de exigência 38 do controle 37 para exigir um ajuste de uma determinada posição na direção z.

[0073] Para isto o processador 33, que pode estar compreendido, por exemplo, em um computador, está ligado cumulativamente com a câmera microscópica 8, para detectar ou ler sinais de intensidade 35 das intensidades dos pixels da região parcial da superfície de detecção 29, especialmente em um canal vermelho. Através dessa câmera 8, oprocessador 33 pode detectar ou ler também, preferivelmente, sinais de intensidade 35 das intensidades dos pixels da superfície de detecção 29, para detectar uma imagem da região de amostra, especialmente em um canal vermelho.

[0074] Preferivelmente o computador 33 está ligado ainda cumulativamente a outra câmera microscópica 9, para ler, preferivelmente, sinais de intensidade 35a das intensidades dos pixels de uma superfície de detecção 29a, para detectar uma imagem da região de amostra, especialmente em um canal verde.

[0075] O sistema de microscopia 100 compreende ainda uma unidade de controle ou um controle 37, a qual igualmente está ligada ao processado 33 (ou compreende o processador) e a qual está configurada para controlar o acionamento 15 através de sinais de controle 39 para deslocamento da mesa microscópica 1 (ou da objetiva 3). Além disso, pode estar previsto um sistema de medição MS, o qual mede independentemente a posição Z (isto é, posição de deslocamento relativo) e comunica ao controle 37.

[0076] Para gravação de uma imagem da região de amostra 2, é determinada e ajustada uma posição de deslocamento relativo para gravação da imagem com base na posição de deslocamento relativo de referência e, finalmente, a imagem é gravada por meio da câmera microscópica 8 ou da câmera microscópica 9.

[0077] A região de amostra 2 compreende um suporte de objeto com um Biochip embutido, como está ilustrado em detalhe ampliado em uma vista de corte lateral na figura 2. A região de amostra 2 compreende um suporte de objeto 41, o qual tem uma estrutura em forma de placa com um rebaixo 43. No rebaixo 43 do suporte de objeto 41 está disposto um Biochip 45 e instalado no suporte de objeto 41 por meio de um adesivo 47. Em torno do Biochip 45 glicerina 49 está colocada dentro do rebaixo 43. Sobre o Biochip 45 está colocada uma amostra (biológica) 51. A amostra 51 está embutida na glicerina 49. Um vidro cobertura 53 cobre o rebaixo 43 com uma amostra 51 dentro dele cercado de glicerina 49. O vidro de cobertura tem uma superfície superior 55, a qual forma uma primeira superfície limite, e uma superfície inferior 57, a qual forma uma segunda superfície limite. A superfície 59 do Biochip 45 forma uma terceira superfície limite. Especialmente esta terceira superfície limite 59 é determinada em um processo para focalização de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0078] A posição de deslocamento relativo (distanciamento vertical relativo entre a objetiva 3 e a região de amostra 2) está assumida quando o raio laser 19 está focalizado na superfície 59 (isto é, a terceira superfície limite) do Biochip 45. Assim que esta posição de deslocamento relativo de referência está encontrada, pode-se gravar uma ou podem-se gravar várias imagens através de leitura preferivelmente de toda a superfície de detecção 29 da câmera microscópica 8, quando a amostra 51 é iluminada, por exemplo, com luz visível ou é iluminada com luz de excitação fluorescente adequada. Alternativamente emprega-se, nesse caso, a superfície de detecção 29a da câmera 9.

[0079] Na forma de realização ilustrada na figura 1, para alteração da posição de deslocamento relativo (distanciamento entre objetiva 3 e região de amostra 2) desloca-se a mesa microscópica 1 verticalmente, enquanto que a objetiva fica fixa. Nas outras formas de realização a mesa microscópica 1 pode estar fixa, enquanto a objetiva 3 pode ser deslocada verticalmente.

[0080] Para excitação de fluorescência na amostra 51 (que pode estar destacada, por exemplo, com fluoróforos) emprega-se uma fonte de luz 4 (por exemplo, um LED), a qual gera luz de excitação 201 de um espectro de emissão adequado, por exemplo, azul. Através de um conjunto de filtro de fluorescência 5 ocorre a separação espectral de luzde excitação e luz fluorescente. Com o auxílio da objetiva 3 e da lente tubular 6 a luz fluorescente emitida no plano de objeto 27 é ilustrada aumentada para as duas câmeras microscópicas 8, 9. Os raios de luz da luz fluorescente passam entre a objetiva 3 e a lente tubular 6 paralelamente; o espaço entre objetiva 3 e lente tubular 6 é designado, portanto, como "espaço-infinito" também. O conjunto de filtro de fluorescência 5 pode compreender um espelho dicroico 61, o qual reflete a luz de excitação de fluorescência 201, enquanto pode deixar passar a luz fluorescente de modo substancialmente não refletido.

[0081] Para focalização rápida antes de uma gravação de imagem a amostra é medida oticamente com o auxílio do sistema baseado em laser-e-câmera antes da gravação microscópica. Nesse caso, para determinação da posição de profundidade da superfície do Biochip, a luz do laser 10 é empregada, por exemplo, com espectro de emissão vermelho visível e acoplada ao eixo ótico 13 da objetiva 3 com o auxílio da placa de divisor de raios 11. O raio laser 19 está conformado então em um feixe de raios paralelos 19 através de uma ótica não ilustrada. Nesta forma de realização o raio laser apresenta um feixe de raios colimados, paralelos. Em uma forma de realização o plano de focalização do raio laser coincide com o plano de distância focal da objetiva. Preferivelmente um diâmetro de seção transversal do raio laser é substancialmente igual à abertura da objetiva.

[0082] O raio laser 19 passa pelo conjunto de filtro de fluorescência 5 e é focalizado no plano de objeto 27 do sistema de microscopia 100 pela objetiva 3. Se uma superfície limite ótica se encontra no plano focal 27 da objetiva 3, então surge uma reflexão em forma de ponto do raio laser 19, a qual é ilustrada na superfície de detecção 29 da câmera microscópica 8, especialmente na superfície de reflexão 29 da câmera microscópica 8, através da objetiva 3. A reflexão do raio laser 19 aparece então como um sinal em forma de ponto na imagem da câmera, cuja intensidade é independente da transição de superfície limite para os materiais do suporte de objeto.

[0083] A figura 3 mostra uma imagem completa de uma reflexão de laser em forma de ponto, como foi gravada antes de toda a superfície de detecção 29 da câmera microscópica. Toda a imagem 63, como foi registrada pela câmera microscópica 8, compreende, por exemplo, 1024 x 1024 pixels.

[0084] No processo para determinação da posição de deslocamento relativo de referência (isto é, da posição em que a superfície 59 do Biochip 45 está disposto no plano focal 27 da objetiva 3) somente uma região parcial de toda a superfície de detecção 29 da câmera microscópica 8 é lida, enquanto que o distanciamento entre a objetiva 3 e a região de amostra 2 ou a posição de deslocamento relativo é alterado.

[0085] As figuras 4a, 4b e 4c ilustram, a título de exemplo, regiões parciais 65a, 65b, 65c da superfície de detecção 29 e as intensidades detectadas pelos pixels contidos nela como valores cinca da imagem do reflexo de laser para diversas posições de deslocamento relativo. As regiões parciais 65a, 65b, 65c podem estar formadas, por exemplo, por 16 x 16 pixels. As figuras 4a, 4b e 4c ilustram então imagens parciais, que surgem em z = -0,5 μm, z = 0 μm e z = +0,5 μm em relação ao distanciamento relativo entre objetiva 3 e região de amostra 2, sendo que a superfície 59 do Biochip 45 está disposta no plano focal 27 da objetiva, de modo que a posição de deslocamento relativo de referência a ser determinada é assumida para z = 0 μm. O respectivo valor de intensidade mais elevado Gmax está igualmente ilustrado. Se o plano focal da objetiva for afastado da superfície limite correspondente no suporte de objeto (vide figuras 4a, 4c), então o sinal de laser é ilustrado enfraquecido ou ampliado. Nas figuras 4a, 4b e 4c observa-se que já com deslocamentos de cerca de +/- 500 nm a modulação dos pixels individuais diminui nitidamente, isto é, a intensidade de pixel elevada através da região parcial em maior quando exatamente a posição de deslocamento relativo de referência é assumida, isto é, no caso da figura 4b. Através do emprego do sistema descrito aqui com focalização do raio laser em um ponto focal no plano focal da objetiva pode-se alcançar uma resolução local especialmente precisa da posição z. Se um modelo expandido bidimensionalmente e completo fosse projetado sobre vários pixels da região parcial, então esse modelo apresentaria também, na posição de focalização ideal, uma expansão espacial maior do que o raio laser empregado aqui, de modo que também uma resolução local na direção z seria mais grosseira ou imprecisa. Além disso, em tal projeção de modelo não bastaria apenas considerar uma intensidade de pixel mais elevada individual da região parcial como medida para uma focalização, como possível no caso do processo de acordo com a invenção, mas também vários pixels teriam que ser unidos e, através de uma análise conjunta, dos vários pixels, teria que ser determinada uma focalização em relação ao modelo bidimensional como medida para uma focalização, a qual seria nitidamente mais demorada do que a consideração de acordo com a invenção da intensidade mais elevada de um pixel individual da região parcial.

[0086] Para determinar a posição focal da superfície de Biochip (isto é, o distanciamento relativo entre objetiva 3 e região de amostra 2, em que a superfície 59 do Biochip 45 est no plano focal 27 da objetiva 3), o suporte de objeto 1 é movimentado na direção Z 17 através do plano de foco 27 do sistema de microscopia 100, preferivelmente com uma primeira resolução de distanciamento ou resolução local. Isto pode ser alcançado com o auxílio de uma gravação de objetiva motorizada na direção Z ou através de movimento do suporte de objeto 1. Para a determinação de foco a linha de intensidade da reflexão de laser é registrada pela câmera microscópica 8 com uma taxa de detecção de Petição 870220117028, de 14/12/2022, pág. 41/124 imagem correspondente à resolução de distanciamento ou resolução local. Para poder alcançar taxas de imagem tão altas quanto possível, apenas uma pequena região parcial (por exemplo, região parcial 65 ilustrada nas figuras 4a, 4b, 4c) é lida e transmitida ao processador 33. Por exemplo, a região parcial pode compreender 16 x 16 pixels, pelo que taxas de detecção de imagem de vários milhares de imagens podem ser alcançadas, por exemplo, cerca de 300 imagens, por segundo.

[0087] A figura 4d ilustra, a título de exemplo, uma superfície 66 predeterminada preferivelmente empregada, na qual valores de intensidade de um ou vários pixels são detectados e avaliados, para determinar o máximo sobre a região parcial (por exemplo, 65a, 65b, 65c). A superfície predeterminada 66 pode corresponder exatamente à superfície de um pixel individual, ou podem ser utilizados vários pixels, para cobrir a superfície 66 predeterminada.

[0088] Para cada imagem parcial gravada para um determinado distanciamento relativo (posição de deslocamento relativo) pode-se determinar o valor cinca de pixel mais elevado ou o valor de intensidade mais elevado. Por meio de conhecimento do sinal de exigência 28 do controle 37 o processador 33 pode fazer o acoplamento dos dados de câmera ou valores de intensidade às posições de deslocamento relativo bem como ainda determinar a posição de deslocamento relativo de referência.

[0089] A figura 5 ilustra um exemplo de linha 67 dos valores de intensidade mais elevados determinados (para cada posição de deslocamento relativo) em função da posição de deslocamento relativo como uma curva 67 em um sistema de coordenadas, sendo que em uma abscissa 69 a posição de deslocamento relativo (posição-Z) e sendo que na ordenada 71 o respectivo valor de intensidade mais elevado está registrado na região parcial na respectiva posição de deslocamento relativo. O valor Z mais baixo indica nesse caso uma posição em que a região de amostra se encontra mais distante da objetiva, o valor Z mais elevado indica então uma posição em que a região de amostra se encontra mais próxima da objetiva. Inicialmente ocorre um deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra em relação uma à outra por meio de redução de um distanciamento relativo entre a objetiva e a região de amostra a partir de um distanciamento maior para um distanciamento menor com uma primeira resolução de distanciamento, sendo que a linha dos valores de intensidade mais elevados é determinada, a qual apresenta vários máximos. A linha apresenta especialmente um primeiro máximo local 73, depois um segundo máximo local 75 e, finalmente, um terceiro máximo local 77 da linha.

[0090] A curva 67 mostra um modelo de sinal característico (sinal de autofoco), baseado na geometria da região de amostra, como está ilustrado na figura 2. Como a construção da região de amostra 2 é conhecida, pode-se determinar a posição Z do Biochip 45, especialmente a superfície 59 do Biochip 45, a partir da linha de sinal 67.

[0091] A curva 67 (sinal de autofoco) apresenta um primeiro máximo 73, o qual provém da reflexão do raio laser 19 na primeira superfície limite 55 (superfície superior do vidro de cobertura 53). Além disso a curva 67 apresenta um segundo máximo 75, o qual provém de superfície inferior 57 (segunda superfície limite) do vidro de cobertura 53. Finalmente, a curva 67 apresenta um terceiro máximo 77, o qual provém da reflexão do raio laser 19 da superfície 59 do Biochip 45 (terceira superfície limite). A posição focal da superfície de Biotipo 59 ou posição de deslocamento relativo de referência resulta então da determinação da posição Z 79 do terceiro máximo de sinal 77.

[0092] Com o auxílio do microcontrolador ou do controle 37 e de um meio de acionamento para deslocamento da objetiva 3, a objetiva 3 pode ser deslocada para trás em seguida, com aumento do distanciamento entre objetiva e região de amostra novamente na direção do local de foco determinado ou a posição de deslocamento relativo de referência. Isto ocorre especialmente com o emprego de uma segunda resolução de distanciamento, a qual é mais elevada ou mais fina do que a primeira resolução de distanciamento. Nesse caso o comprimento deslocamento através do sinal de autofoco é controlado, o qual é monitorado e avaliado simultaneamente para movimento em Z. Nesse caso ocorre uma determinação dos respectivos outros valores de intensidade mais elevados em respectivas outras posições de deslocamento relativo bem como uma detecção de uma presença do máximo 83 da figura 6 com base nos outros valores de intensidade. Preferivelmente, no caso de que o raio laser apresente um feixe de raios colimado, paralelo na direção da objetiva e ainda o plano de focalização do raio laser coincida com o plano focal da objetiva, ocorre um ajuste da posição de deslocamento relativo para tal posição de deslocamento relativo de referência final, na qual o máximo local detectado com base nos outros valores de intensidade mais elevados está ou estava presente.

[0093] A figura 6 ilustra para isto um sinal de autofocalização, o qual provém da reflexão do raio laser 19 da superfície 59 do Biochip 45, isto é, um terceiro máximo 82 em uma linha em uma posição 85. A linha 81 dos outros valores de intensidade mais elevados na região parcial em função da posição Z na abscissa 83 foi determinada com o emprego de uma objetiva com ampliação de 20 vezes com uma abertura numérica de 0,5, sendo que um laser foi empregado com um comprimento de onda de emissão de Ào = 635 nm. A resolução axial do sinal 81 pode ser determinada, por exemplo, a partir da meia largura Δ em cerca de 2,1 μm. A posição de deslocamento relativo de referência 85 pode ser determinada, por exemplo, como posição Z, na qual o máximo 82 ocorre ou como um ponto de gravidade da curva 81 ou ponto de gravidade do máximo 82. Então a objetiva pode ser deslocada para a posição de deslocamento relativo 85 em relação à região de amostra, na qual estava o máximo 82 dos outros valores de intensidade mais elevados. Isto condiciona então, eventualmente, outra inversão de direção do acionamento 15 da figura 1, uma vez que um reconhecimento do valor 82 na posição 85 como o máximo 82, por exemplo, pode ocorrer quando uma presença seguinte do valor 82a na posição 85a é reconhecida, de modo que é preciso deslocamento da posição 85a de volta à posição 85.

[0094] A posição focal como posição de deslocamento relativo de referência final vale preferivelmente como alcançada e o movimento de deslocamento é parado preferivelmente quando as seguintes condições são atendidas:

[0095] um valor limite definido anteriormente do sinal de autofoco foi ultrapassado. Este valor limite é determinado a partir do nível de sinal do sinal de autofoco determinado anteriormente.

[0096] O sinal de autofoco alcança um máximo local 82.

[0097] A superfície do Biochip, porém não precisa representar o plano de imagiologia ótima para a microscopia de fluorescência, uma vez que a espessura de camada da amostra 51, em parte, pode ser maior do que a profundidade de campo do sistema de microscopia 100. Portanto, várias gravações de fluorescência podem ser feitas em torno da posição focal determinada ou da posição de deslocamento relativo de referência final determinada. Portanto, preferivelmente, a partir da posição de deslocamento relativo de referência final, pode ocorrer uma detecção de várias imagens da região de amostra por meio da câmera 8 ou da outra câmera 9 da figura 1. A câmera 8 detecta preferivelmente imagens em um canal vermelho. A câmera 9 detecta preferivelmente imagens no canal verde. Assim ocorre um deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra em relação uma à outra ao longo do eixo ótico para respectivas posições de deslocamento relativo final acima e/ou abaixo da posição de deslocamento relativo de referência final. Nesse caso ocorre ainda uma detecção de respectivas imagens nas respectivas posições de deslocamento relativo final por meio da primeira câmera microscópica 8 ou da outra câmera microscópica 9. O Processador 33 armazena então as respectivas imagens e determina respectivas métricas de foco para as respectivas imagens. O processador 33 seleciona então a imagem que apresenta a melhora métrica de foco. Preferivelmente o processador 33 confunde recusa as outras imagens que não apresentam a melhor métrica de foco.

[0098] Como se observa na figura 5, os níveis de sinal de máximo de um determinado modelo. A partir da linha o terceiro máximo 77 pode ser reconhecido como detectado com segurança, por exemplo, caso o nível de sinal do máximo local 77 seja maior do que um valor limite determinado anteriormente ou predeterminado e se existe ainda efetivamente um máximo local, isto é, valores de intensidade à direita e à esquerda da posição de deslocamento relativo de referência 79 são menores do que a intensidade exatamente na posição de deslocamento relativa de referência 79. Assim preferivelmente pode-se determinar, de maneira segura, a posição de deslocamento relativo de referência na qual o raio laser 19 é focalizado na superfície 59 do Biochip 45. Para poder separar os máximos 73, 75 e 77 um do outro de maneira segura, de acordo com uma forma de realização da presente invenção a resolução do sistema de autofoco é mais ou menos igual à profundidade de campo do sistema de microscopia. O diâmetro d do raio laser paralelo 19 (vide figura 1) é preferivelmente dimensionado de tal modo, que a abertura total da objetiva de microscópio 3 é iluminado. Por exemplo, emprega-se um laser que tenha um comprimento de onda de emissão vermelho (por exemplo, Ào = 635 nm), em compensação com uma abertura numérica de 0,5 resulta uma profundidade de campo de cerca de tw = 2,54 μm.

[0099] Para impedir que luz que é devolvida de fora do plano focal 27 interfira nas medições e reduza a resolução axial do deslocamento, as propriedades físicas de laser e detector são utilizadas vantajosamente, sem que seja requerido um diafragma de orifício empregado usualmente. A superfície de emissão ativa do laser 10 pode ser vantajosamente de poucos μm, de modo que existe uma fonte de luz pontual. Assim pode-se dispensar um diafragma de orifício de fonte de luz.

[00100] Também pode-se dispensar um diafragma de orifício de detector, uma vez que, de acordo com uma forma de realização da invenção, em cada ponto de medição Z (em cada posição de deslocamento relativo) a intensidade de sinal é definida unicamente através do pixel com o valor de intensidade mais elevado na região parcial d da superfície de detecção 29. Desta maneira um diafragma de orifício de poucos micrômetros quadrados pode ser simulado, cuja área corresponde à superfície de pixel. De acordo com o tamanho do pixel a área predeterminada pode ser dada através de um ou vários pixels. Através da região de imagem de câmera maior avaliada nesse caso de 16 x16 pixels o processo pode ser simultaneamente robusto em relação a desvios da posição de laser do centro de região de imagem. Com tempos de exposição curtos a influência de reflexões ilustradas não nítidas de fora do plano focal, a influência pode ser impedida de tal modo, que o sinal obtido é definido quase exclusivamente através de reflexão de laser a partir do plano de foco 27. Como tamanho de pixel pode-se empregar, por exemplo, 3,45 μm x 3,45 μm e os tempos de exposição podem ficar, por exemplo, entre 20 μs e 1000 μs.

[00101] A figura 7 ilustra, em uma vista de corte lateral esquemática, um divisor de raios 11a de acordo com uma forma de realização da presente invenção, o qual pode ser empregado, por exemplo, no sistema de microscopia 100 ilustrado na figura 1. No caso do divisor de raios 11a trata-se de um divisor de raios de placa paralela com uma superfície anterior 87 e uma superfície posterior 89, nas quais pode ser refletido o respectivo raio laser 1, para conduzir dois diferentes raios parciais I1 e I2 refletidos. Os dois raios parciais I1 e I2 são sobrepostos em um plano focal 27 através da objetiva 3, pelo que podem resultar oscilações de desempenho. Para reduzir essas oscilações de desempenho pode-se empregar uma fonte de luz constante baixa, pelo que as interferências podem ser reduzidas.

[00102] Alternativamente, para redução dessas oscilações de desempenho, pode-se empregar uma placa de distribuidor de raios 11b com um ângulo de cunha suave ("placa de cunha"), como está ilustrado esquematicamente em uma vista de corte na figura 8. A placa de cunha 11b tem uma superfície anterior 91 e uma superfície posterior 93, as quais não são paralelas entre si, mas sim estão ainda mais basculhadas uma contra a outra em um ângulo α. Através do emprego dessa placa de cunhe como divisor de raios 11 (por exemplo, no sistema de microscopia 100 ilustrado na figura 1) as flexões de laser da luz de laser 19 são desviadas em distintas direções no lado anterior 91 e no lado posterior 93, para resultarem em raios parciais I1 e I2, os quais, como resultado, entram na objetiva em diversos ângulos e, consequentemente, são focalizados em dois diferentes locais 95 ou 97. Os locais 95 e 97 estão defasados lateralmente no plano de objeto 27. Uma superposição dos dois raios parciais I1, e I2 no local de observação não ocorre mais e, assim, também não ocorre interferência perturbadora.

[00103] Na pupila de entrada da objetiva os dois raios parciais I1 e I2 podem sobrepor-se ainda mais. Entretanto, no local de sobreposição forma-se uma modulação de interferência, cuja frequência espacial depende do ângulo de cunha do divisor de raios. Para evitar perdas de desempenho através de uma posição desfavorável dos mínimos e máximos do modelo de modulação na pupila de entrada, o ângulo de cunha deve ser escolhido pelo menos tão grande, que o modelo de interferência apresente pelo menos 10 máximos ou mínimos através da abertura completa da objetiva.

[00104] O divisor de raios 11b com um ângulo de cunha pode ter também uma influência sobre a imageria do sistema de microscopia 100. Assim, por exemplo, resultam deslocamentos laterais dependentes do comprimento de onda da imagem microscópica bem como distorções na direção unidimensional. Portanto, o ângulo de cunha máximo do divisor de raios depende da respectiva aplicação de microscopia. Por exemplo, pode-se escolher ângulo α = 0,5 graus como ângulo de cunha.

[00105] Em princípio quaisquer erros de ilustração podem ser corrigidos através de elementos óticos adicionais adequados ou de processo na avaliação da imagem. Por exemplo, pode estar prevista uma segunda placa de divisor de raios em forma de cunha, a qual é idêntica à primeira placa de divisor de raios e está disposta no espaço- infinito do microscópio de tal modo, que as alterações de ângulo podem equilibrar-se entre si através da forma de cunha dos dois divisores de raio.

[00106] O Processo e os sistemas de acordo com a presente invenção podem apresentar diversas vantagens:

[00107] Através da utilização dupla da câmera microscópica no canal vermelho para focalização e para detecção de uma ou várias imagens da região de amostra não é necessário nenhum detector adicional. Assim resulta uma economia de custos de componentes e gasto de ajustagem. Assim o número de componentes necessários adicionalmente pode limitar-se a um módulo de laser alargado com raios, colimado e um divisor de raios.

[00108] Através da avaliação de um pixel individual nos dados de câmera pode resultar uma alta resolução na direção Z, comparável com uma combinação fotodetector-diafragma de orifício (Konfokaltechnik = técnica confocal). Ao mesmo tempo o alto dispêndio de ajustagem usual em aplicações de diafragma de orifício pode ser omitido, uma vez que para cada profundidade de medição é detectada uma região de detecção com uma pluralidade de pixels (tipicamente 16 x 16). Nesse caso não tem importância saber qual pixel dentro da região, isto é, da região parcial, detecta ou apresenta o valor cinza máximo.

[00109] Como também a escolha da região de detector pode ocorrer dinamicamente (por exemplo, durante a fase de inicialização do microscópio), o sinal de laser pode encontrar-se quase aleatoriamente na superfície de detector da câmera. Portanto, o processo é muito robusto em comparação com as aplicações de autofoco baseadas em diafragma de orifício.

[00110] Como fonte de luz pode-se empregar um módulo de laser, cujo comprimento de onda de emissão fique próximo ao infravermelho (NIR), por exemplo, em cerca de 830 nm. Neste caso pode-se empregar um divisor de raios dicroico 11 para acoplamento da luz de laser na marcha de raios da objetiva. Neste caso, não seria necessária uma placa de divisor de raios em forma de cunha.

[00111] Para prevenção de oscilações de sinal condicionadas por interferência, em princípio pode ser utilizada também uma fonte de luz de laser de coerência curta, por exemplo, um diodo superluminescenteou uma fonte de luz de laser com comprimento coerente reduzido. Neste caso, a placa de divisor de raios em forma de cunha poderia ser substituída por um divisor de raios simples. O comprimento de onda de emissão pode ficar então na região visível ou também na próxima ao infravermelho.

[00112] O movimento controlado por microcontrolador na direção Z (alteração da posição de deslocamento relativo) pode ser convertido com uma tomada de objetiva motorizada ou com uma mesa microscópica motorizada.

[00113] De acordo com formas de realização da presente invenção não se emprega diafragma de orifício rígido (andes da superfície de detecção), mas sim a clareza dos pixels individuais de uma região de detecção da câmera é avaliada. As dimensões da superfície 66 (vide figura 4D) predeterminada utilizada para a avaliação podem ficar na ordem de grandeza da abertura de diafragma de orifício físico empregado convencionalmente.

[00114] De acordo com a forma de realização do processo descrita anteriormente com referência às figuras 1, 5 e 6, o raio laser apresenta um feixe de raios colimado, paralelo na direção da objetiva e ainda o plano de focalização do raio laser coincide com o plano focal da objetiva. De acordo com esta forma de realização, após a determinação de uma primeira posição de deslocamento relativo de referência 79, com o auxílio do máximo 77 da figura 5, ocorre em seguida um aumento do distanciamento relativo em relação à primeira posição de deslocamento relativo de referência com uma segunda resolução de distanciamento, a qual é mais alta do que a primeira resolução de distanciamento. Nesse caso ocorre simultaneamente uma detecção de outros valores de intensidade mais elevados nas respectivas outras posições de deslocamento relativo, de modo que, quando da detecção de uma presença de um máximo local com base nos outros valores de intensidade mais elevados, aquela posição de deslocamento relativo é ajustada como uma posição de deslocamento relativo de referência final, na qual fica ou ficava o máximo local detectado com base nos outros valores de intensidade mais elevados. Como descrito anteriormente, isto pode condicionar outra inversão de sentido. Se ocorre tal inversão de sentido, então um chamado jogo de inversão da mecânica do meio de acionamento 15 da figura 1 pode condicionar um alinhamento errado entre objetiva e região de amostra, de modo que assim a qualidade de uma focalização pode ser diminuída.

[00115] Agora, com o auxílio da figura 9, é descrita outra forma de realização do processo, na qual tal inversão de sentido pode ser evitada, para evitar um alinhamento errado entre objetiva e região de amostra em virtude do jogo de inversão. A fonte de luz laser 10 é ajustada por meio da ótica de colimação 10a de tal modo, que o raio laser apresenta um feixe de raios 19a convergente para a objetiva. Isto faz com que através da objetiva 3 o plano de focalização 27b do raio laser 19a não coincida com o plano focal 27 da objetiva. Assim especialmente se faz com que o ponto de focalização não fique no plano focal 27. Nesse caso, o ponto de foco é deslocado do ponto focal do microscópio especialmente na direção da objetiva, através da ótica de colimação do laser do ponto focal do microscópico, preferivelmente em um valor de 3 a 10 vezes a profundidade de campo da objetiva. Neste caso, o ângulo de convergência (meio ângulo de abertura) do raio laser focalizado pode ficar preferivelmente na faixa entre -1 arcmin a -15 arcmin, mas não é limitado desta maneira.

[00116] Como a objetiva 3 e a lente 6 bem como a câmera 8, e especialmente o espelho 7, estão posicionados em seus respectivos distanciamentos óticos em relação um ao outro de tal modo, que raios procedentes de um ponto comum do plano focal 27, especialmente o ponto focal do plano focal 27, da objetiva 3 são ilustrados em um ponto da superfície de detecção 29, no caso de que a superfície limite ou superfície 59 do Biochip 45 se encontre no plano de focalização 27 não ocorre ilustração precisa de uma reflexão do ponto de raio laser em um ponto exato da superfície de detecção. Entretanto, existe outro plano de reflexão 27c entre o plano focal 27 e o plano de focalização 27b, no qual a superfície limite ou a superfície 59 do Biochip 45 provoca tal reflexão do raio laser, de modo que essa reflexão igualmente é ilustrada de modo punctiforme em um ponto do plano de detector 29.

[00117] As figuras 10a e 10b mostram, em detalhe, a abertura ótica da objetiva 3, o plano focal 27 com o ponto focal 271 da objetiva bem como o plano de focalização 27b do raio laser com o ponto de focalização 272. O outro plano de reflexão 27c fica entre o plano focal 27 e o plano de focalizçaão27b. Deve-se supor que a superfície limite ou a superfície 59 do Biochip se encontre no outro plano de reflexão 27c. Raios laser 19a que chegam são refletidos efetivamente no outro plano de reflexão 27c e redirecionados à objetiva como raios refletidos 19b. Esses raios laser 19b entram na objetiva 3 um ângulo que seria o mesmo se eles não tivessem refletidos para o outro plano de reflexão 27c, mas sim no plano focal 27 correto; em outras palavras: os raios laser 19a são refletidos na superfície limite de amostra no outro plano de reflexão 27c de tal modo, que os raios laser 19b de retorno vêm aparentemente como raios 19c de um ponto comum 271 do plano focal 27, especialmente do ponto focal 171 do plano focal 27 da objetiva 3. Portanto, para esses raios laser 19b refletidos no outro plano de reflexão 27c ocorre também uma ilustração correta, punctiforme, em um ponto do plano de detector 27 da figura 9.

[00118] O distanciamento ou o deslocamento V entre o outro plano de reflexão 27c e o plano focal 27 efetivo pode ser determinado inicialmente com o auxílio de uma amostra de referência colocada no microscópio para fins de calibração, de modo que um valor inicial pode ser armazenado no processador 33, o qual posteriormente pode entrar na forma de realização do processo.

[00119] A figura 10b ilustra o efeito do outro plano de reflexão mais uma vez para outras marchas de raios 10a, 19b, 19c. A seguir é descrito como esse efeito do deslocamento do ponto de foco, esclarecido com o auxílio das figuras 10a e 10b, pode ser utilizado para prevenção do jogode inversão.

[00120] Deve-se supor que inicialmente, como esclarecido anteriormente, um deslocamento relativo da objetiva e da região de amostra em relação uma à outra tenha ocorrido por meio de redução do distanciamento relativo a partir de um distanciamento maior para um distanciamento menor com o emprego de uma primeira resolução de distanciamento, de modo que a referida linha dos valores de intensidade mais elevados apresente vários máximos, como ilustrado na figura 5. Deve-se supor ainda que uma determinação da posição de deslocamento relativo de referência com base nos vários máximos tenha ocorrido como posição de deslocamento relativo de referência. Deve-se supor ainda que a superfície 59 do Biochip se encontre então entre o plano de foco 27b do raio laser e a objetiva 3, como ilustrado na figura 11a. Se agora ocorrer um aumento do distanciamento relativo entre objetiva 3 e região de amostra ou entre objetiva 3 e a superfície 59 do Biochip na direção da primeira posição de deslocamento relativo de referência em uma direção de deslocamento R com uma segunda resolução de distanciamento, a qual é mais alta do que a primeira resolução de distanciamento, e se ocorrer simultaneamente uma detecção de outros valores de intensidade mais elevados nas respectivas outras posições de deslocamento relativo, então pode-se supor que a curva 81 ilustrada na figura 6 foi deslocada da direita na direção do máximo 82.

[00121] Se então, como ilustrado na figura 11b, a superfície 59 do Biochip se encontrar exatamente no outro plano de reflexão 27c, então resulta, na linha 81 da curva, o valor máximo 82 na posição 85. Então a objetiva é deslocada em relação à região de amostra (ou vice-versa) para uma outra segunda precisão de resolução ou um segundo passo de precisão de resolução de tal modo, que a distância entre objetiva 3 e a região de amostra é aumentada ainda mais. A direção de deslocamento está designada como direção R.

[00122] Se a superfície 59 do Biochip se encontra na posição ilustrada na figura 11b, isto é, no outro plano de reflexão 27c, então resulta o valor máximo 82 da posição 85. Se a superfície 59 do Biochip se encontra na posição ilustrada na figura 11c, isto é, abaixo do outro plano de reflexão 27c, então resulta um valor menor 82a em relação ao valor máximo 82 na posição 85a. Então pode-se detectar, com o auxílio dos outros valores de intensidade mais elevados da linha 81, que na posição 85 anterior havia o máximo local 82. Agora preferivelmente a partir apenas da posição 85a, a qual corresponde à figura 11c, deve-se aumentar o distanciamento relativo entre a região de amostra ou a superfície 59 do Biochip e a objetiva em um valor padrão predeterminado para a posição de deslocamento relativo de referência final 85f, a qual corresponde à figura 11d com a região de amostra ou a superfície 59 do Biochip no plano focal. Esse aumento ou esse valor predeterminado é escolhido de acordo com a defasagem V entre o plano focal 27 e o outro plano de reflexão 27c menos um segundo passo de precisão de resolução, no qual a região de amostra ou a superfície 59 do Biochip já foi deslocada da posição da figura 11b para a posição da figura 11c. Esse aumento maior ocorre na mesma direção R sem uma inversão de sentidos. Assim, após detecção do máximo 82 (figura 6) por meio de deslocamento da região de amostra ou da superfície 59 do Biochip da posição 85a para a posição 85f, evita-se uma inversão de sentidos, de modo que uma imprecisão devida ao jogo de inversão da mecânica do acionamento 15 (figura 1) é impedida. Sem a defasagem V entre o plano focal e o plano de focalização teria que ocorrer uma inversão de sentidos da posição 85a na direção da posição 85, de modo que um jogo de inversão teria efeito negativo no sentido do posicionamento da região de amostra e, assim, também no sentido do resultado de focalização.

[00123] Como os valores de medição ou os outros valores de intensidade mais elevados da curva 81 podem estar também sobrepostos por oscilações e ruídos de fundo, para encontrar o máximo 82 e a posição de deslocamento relativo de referência final preferivelmente procede-se como descrito a seguir. Inicialmente ocorre um deslocamento da curva 81 da direita para a esquerda com o emprego da segunda resolução de distanciamento. Se então for constatada uma retirada de valores sequenciais de um valor anterior 82c da posição 85c ou um máximo atual 85c para um valor atual 82d da posição 85d, então se verifica, dentro de uma janela de posição seguinte para a esquerda, se pode ser encontrado outro valor que seja maior do que o máximo atual, detectado até agora. Deve-se supor que isto seja o caso, uma vez que uma aplicação da janela FE ilustrada da posição 85c para a esquerda faria com que valores maiores do que o valor 82c fossem encontrados. Se então, posteriormente, o máximo 82 for encontrado na posição 85, então é encontrado o menor valor 82a na posição 85a, porém dentro da janela FE para a esquerda nenhum valor que seja superior ao máximo 82 atual. Então a região de amostra ou a superfície 59 do Biochip se encontra na posição 85e. A defasagem V entre o plano de focalização e o plano focal pode ser considerada de maneira correspondente, de modo que a partir da posição 85e se desloca em um valor padrão ou avanço V2 da região de amostra ou a superfície 59 do Biochip mais para a posição 85f do que a posição de deslocamento relativo de referência final. O valor padrão V2 é determinado preferivelmente de acordo com V2=V-FE.

[00124] Formas de realização da presente invenção possibilitam uma focalização segura em superfícies limite óticas que se encontram dentro de uma região de amostra tridimensional, e especialmente apresentem superfícies limite que não confinam com ar. Reflexões de laser nas superfícies limite que ficam dentro da região de amostra sãomais fracas, em princípio, do que reflexões na superfície para o ar. Por exemplo, o grau de reflexão da superfície limite glicerina-Biochip (isto é, da terceira superfície) pode ser de apenas 0,029%. O grau de reflexão da superfície limite ar para o lado superior do vidro de cobertura, porém, pode ser de cerca de 4,3%. A superfície limite relevante para focalização fornece, portanto, um sinal que é menor em um fator de cerca de 150 do que o sinal da superfície de amostra para o ar. Em virtude do reconhecimento do modelo de reflexão característico em função da posição de deslocamento relativo, pode-se alcançar uma focalização segura na superfície Biochip.

[00125] Dependendo das exigências de implementação determinadas, exemplos de realização da invenção podem converter o processador e/ou a unidade de controle em Hardware e/ou Software. Uma conversão do processador mencionado aqui e/ou da unidade de controle mencionada aqui pode ocorrer aqui como pelo menos uma unidade ou, porém, através de várias unidades em cooperação. A implementação pode ser realizada com o emprego de um meio de armazenamento digital, por exemplo, um Floppy-Disk, um DVD, um Blu- Ray Disc, um CD, um ROM, um PROM, um EPROM, um EEPROM ou uma memória FLASH, um disco rígido ou outra memória magnética ou ótica, em que sinais de controle legíveis eletronicamente estejam armazenados, os quais possam interagir ou que interajam com um componente de hardware programável de tal modo, que o respectivo processo é realizado. Um componente de hardware programável pode estar formado como uma unidade de controle através de um processador de computador (CPU = Central Processing Unit), um computador, um sistema de computadores, um circuito integrado específico de aplicação (ASIC = Application-Specific Integrated Circuit), um circuito integrado (IC = Integrated Circuit), um sistema em chip (SOC - System on Chim), um elemento lógico programável ou um Gatterarray programável de campo com um microprocessador (FPGA = Field Programmable Gate Array). Portanto, o meio de memória digital pode ser legível por máquina ou computador. Muitos exemplos de realização compreendem um suporte de dados que apresenta sinais de controle legíveis eletronicamente, os quais estão em condições de interagir com um sistema de computador programável ou com um componente de hardware programável de tal modo, que um dos processos descritos aqui seja realizado. Em geral exemplos de realização ou partes dos exemplos de realização podem estar implementados com um código de programa ou como dados, sendo que o código de programa ou os dados é eficaz ou são eficazes a tal ponto de realizar um dos processos ou uma parte de um processo, quando o programa corre em um processador ou em um componente de hardware programável.

Claims (11)

1. Processo para gravação de uma imagem de uma região de amostra (2), caracterizado pelo fato de que compreende: direcionar um raio laser (19, 19a) por pelo menos uma objetiva (3) para a região de amostra (2), a região de amostra (2) contendo pelo menos uma superfície limite (59), sendo que a pelo menos uma objetiva provoca uma ilustração do raio laser em um ponto de focalização que fica em um plano de focalização (27,27b); deslocar relativamente a pelo menos uma objetiva (3) e a região de amostra (2) em relação uma à outra ao longo de um eixo ótico (13) da pelo menos uma objetiva (3) para várias posições diferentes de deslocamento relativo; detectar, para uma respectiva posição de deslocamento relativo (Z), uma pluralidade de valores de intensidade do raio laser refletido na pelo menos uma superfície limite (59) e que passa pela pelo menos uma objetiva (3), a pluralidade de valores sendo detectados por pixels de uma região parcial (65) bidimensional de uma superfície de detecção (29) de uma câmera microscópica (8); determinar, para a respectiva posição de deslocamento relativo (Z), um respectivo valor de intensidade mais elevado da pluralidade de valores de intensidade de exatamente um pixel individual da respectiva pluralidade de valores de intensidade detectados de uma região parcial (65) como uma intensidade mais elevada de um pixel individual; determinar uma linha (67) de valores de intensidade mais elevados através de associação de cada respectivo valor de intensidade mais elevado à cada respectiva posição de deslocamento relativo (Z); determinar uma posição de deslocamento relativo de referência (79) a partir de pelo menos um máximo da linha (67) dos valores de intensidade mais elevados; e detectar pelo menos uma imagem da região de amostra (2) na posição de deslocamento relativo de referência.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o raio laser (19) apresenta um feixe de raios colimado, paralelo e sendo que um plano de focalização do raio laser (19) coincide com um plano de focalização da pelo menos uma objetiva (3).

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um diâmetro do raio laser (19) está dimensionado de tal modo, que uma abertura total da pelo menos uma objetiva (3) é iluminada.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região parcial bidimensional é inferior a 1/10 da superfície de detector.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que em uma marcha de raios de detecção entre a pelo menos uma objetiva (3) e a superfície de detecção (29), está disposta uma lente ou um sistema de lentes (6), a qual ou o qual ilustra um plano focal (27) da pelo menos uma objetiva (3) na superfície de detecção (29).

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma superfície limite (57, 59) não confina com ar, sendo que a região de amostra (2) compreende uma amostra orgânica (51), a qual encosta sobre um suporte de substrato (45), está embutida em uma substância líquida (49) e está coberta por um vidro de cobertura (53), sendo que um lado superior (55) do vidro de cobertura forma uma primeira superfície limite, sendo que um lado inferior (57) do vidro de cobertura forma uma segunda superfície limite, e sendo que a pelo menos uma superfície limite (59) do suporte de substrato (45) forma uma terceira superfície limite.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distanciamento relativo entre a pelo menos uma objetiva (3) e a região de amostra (2) é reduzido inicialmente, a partir de um distanciamento maior, enquanto valores de intensidade dos pixels da região parcial bidimensional são detectados, sendo que a linha inicialmente apresenta um primeiro máximo local (73), depois um segundo máximo local (75) e finalmente um terceiro máximo local (77) da linha, sendo que a posição de deslocamento relativo de referência (79) é determinada com base no terceiro máximo local (77).

8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a posição de deslocamento relativo de referência corresponde à posição de deslocamento relativo (79) para a qual o raio laser refletido na terceira superfície limite é focalizado na região parcial bidimensional (65) da superfície de detecção (29), sendo que a posição de deslocamento relativo de referência (79) é ilustrada, sendo que a posição de deslocamento relativo de referência (79) é alterada ou corrigida para gravação da imagem baseada em um valor padrão.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, entre uma fonte (10) do raio laser (19) e a pelo menos uma objetiva (3), está disposto um divisor de raios dicroico ou não dicroico (11, 11a, 11b) para reflexão do raio laser (19) através da pelo menos uma objetiva.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o divisor de raios (11b) apresenta uma forma de cunha, sendo que planos de um lado anterior (91) e de um lado posterior (93) do divisor de raios (11b) cortam-se em um ângulo de cunha (α), o qual está entre 0,1 grau e 1 grau.

11. Sistema de microscopia (100) para gravação de uma imagem de uma região de amostra (2), caracterizado pelo fato de que apresenta: uma fonte de laser (10), a qual está configurada para gerar um raio laser (9, 19a); pelo menos uma objetiva (3) configurada para dirigir o raio laser (19, 10a) na região de amostra (2), a qual contém pelo menos uma superfície limite (59), sendo que a pelo menos uma objetiva (3) provoca uma ilustração do raio laser (19, 19a) sobre um ponto de focalização, que fica em um plano de focalização (27, 27b), e sendo que a pelo menos uma objetiva (3) é deslocável para várias posições de deslocamento relativo em relação à região de amostra (2) ao longo de um eixo ótico da pelo menos uma objetiva (3); pelo menos uma câmera microscópica (8) com uma superfície de detecção (29), sendo que a pelo menos uma câmera microscópica está configurada para detectar vários valores de intensidade do raio laser refletido na pelo menos uma superfície limite (59) e que passa pela pelo menos uma objetiva (3), para uma respectiva posição de deslocamento relativo (Z), sendo que valores de intensidade são detectados por pixels de uma região parcial (65) bidimensional de uma superfície de detecção (29) de uma câmera microscópica (8); e pelo menos um processador (33) configurado: para determinar um respectivo valor de intensidade mais elevado dentre os valores de intensidade detectados de exatamente um pixel individual da respectiva pluralidade de valores de intensidade detectados de uma região parcial (65) como uma intensidade mais elevada de um pixel individual, para determinar uma linha (81) de valores de intensidade mais elevados através de associação de cada respectivo valor de intensidade mais elevado à cada respectiva posição de deslocamento relativo (Z), valores de intensidade mais elevados, para ajustar um acionamento (15) para aproximar a pelo menos uma objetiva (3) da posição de deslocamento relativo de referência (79), e para detectar uma imagem da região de amostra (2) por meio da pelo menos uma câmera microscópica ou de outra câmera microscópica.