CN110785692B - 用于拍摄图像的方法和显微镜系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于拍摄样品区域的图像的方法和显微镜系统，所述方法具有：将激光束借助至少一个物镜指向到样品区域上，该样品区域包括至少一个边界面，其中，物镜实现将激光束成像到聚焦点上，该聚焦点位于物镜的光轴上或与该光轴平行的轴线上并且该聚焦点还位于聚焦平面中；使物镜和样品区域彼此沿物镜的光轴相对移动到多个不同的相对移动位置处；针对相应的相对移动位置，检测在边界面处反射的并且穿过物镜的激光束的多个强度值，所述强度值由显微镜相机的探测面的二维的部分区域的像素探测到；针对相应的相对移动位置，确定相应最高的强度值；确定最高强度值的变化曲线；由变化曲线的至少一个最大值确定参考相对移动位置；检测在所述参考相对移动位置处样品区域的至少一个图像。

Description

用于拍摄图像的方法和显微镜系统
技术领域
本发明涉及一种用于拍摄样品区域的图像、尤其是用于拍摄荧光图像的方法，并且还涉及一种用于拍摄样品区域的图像的显微镜系统。
背景技术
DE102008015885A1描述一种用于对光学设备进行自动聚焦的方法，其中，设置有测量光源和物镜，该物镜用于将从测量光源出发的基本上平行的射线束成像到观察物体上，以产生反射图像，其中，还设置有评估和调节单元，该评估和调节单元适合于由反射图像确定聚焦位置并且定位物镜。在此拍摄具有同中心环的图像，其直径根据到正确的焦点位置的距离而改变。
WO2016/133787A1公开用于将显微镜自动聚焦在样品上并且用于拍摄样品的聚焦的图像的方法和系统。分析所采用的测量以确定哪个测量具有峰值，其中，测量反射的激光束被理解为峰值，该峰值表示作为基片沿显微镜的光轴的位置相对于物镜的位置的函数的最大强度。
DE102014002584公开一种用于对处于三维样品区域内的物体进行成像的方法和光学装置，其中，借助光学相干干涉法确定样品区域的深度轮廓，识别在深度轮廓中的峰值，该峰值由物体点处的反射造成，确定峰值的光学路径长度位置，并且其中，基于此计算物体点的几何路径长度位置。最后基于所述几何路径长度位置对显微镜进行聚焦以便使物体成像。
常规地拍摄在不同深度位置(Z位置)处的显微镜图像，其中，通过对图像拍摄的结构清晰度进行评估来确定最佳焦点位置。但这种方法相对费时，使得对大量样品的高通量处理变得困难。
在诸如US20170090176A1的现有技术的解决方案中，有时平面延伸的图案投影到诸如反射的边界面的平面上，其中，然后对反射的图案借助图像检测单元在虚拟掩模区域中逐像素地进行评估并且借助合并虚拟掩模内的多个像素的强度值推导出用于在物镜与边界面或样品区域之间进行聚焦的度量。
因此，现有技术的方法和系统不能在所有条件下都确保对在显微镜、尤其是荧光显微镜中的样品快速且可靠地进行聚焦。
发明内容
因此，需要一种用于拍摄样品区域的图像的方法和显微镜系统，其中，可以确保快速且可靠地尤其是对嵌入在三维样品区域中的物体进行聚焦。
所述需求通过按照本发明的用于拍摄样品区域的图像的方法以及按照本发明的用于拍摄样品区域的图像的显微镜系统来满足。
根据本发明的一种实施形式提供一种用于拍摄样品区域的图像的方法，其具有：将激光束借助至少一个物镜指向到样品区域上，该样品区域包括至少一个边界面，其中，物镜实现将激光束成像到聚焦点上，该聚焦点位于聚焦平面中，其中，该聚焦平面平行于焦平面并且尤其是与焦平面重合，并且聚焦点优选位于物镜的光轴上或与该光轴平行的轴线上，其中，聚焦平面还优选垂直于物镜的光轴；使物镜和样品区域彼此沿物镜的光轴相对移动到多个不同的相对移动位置处；针对相应的相对移动位置，检测在边界面处反射的并且穿过物镜的激光束的多个强度值，所述强度值由显微镜相机的探测面的二维部分区域的像素探测到；针对相应的相对移动位置，确定所述部分区域的相应多个检测到的强度值中相应最高的强度值；通过将相应最高的强度值与相应的相对移动位置关联来确定最高强度值的变化曲线；由最高强度值的变化曲线的至少一个局部最大值确定参考相对移动位置并且优选移动到参考相对移动位置；优选通过读取显微镜相机的探测面或另一个显微镜相机的探测面来检测在参考相对移动位置处样品区域的至少一个图像。
为了使读者了解按照本发明的方法和按照本发明的装置的一个或多个优点，现在对此进行更准确的论述。
所述物镜这样构造，使得物镜将作为平行的光学路径或准直平行的射线束而相互平行地朝向激光光源进入其光学开口中的激光束投影到物镜的另一侧上的焦平面的一个点上，其中，该点可以是焦点，或者如果射线束不是相对于物镜的光轴精确地对称地定中心，则该点是在焦平面中相对于焦点偏移的点。从精确地焦平面中的所述点、尤其是焦点返回进入到物镜中的激光束再次在开口侧或光学侧上朝向激光源或显微镜相机成形为平行的光学路径。
因此，例如如果激光束是准直平行的射线束，则物镜产生激光束以其整个强度在物镜的焦平面中一个点、尤其是焦点上的投影。因此，通过物镜从所述点、尤其是从所述焦点获得的光学路径(该光学路径在物镜的另一侧上被聚集成平行准直的光学路径)可以借助连接在物镜下游的透镜、优选镜筒透镜投影到探测面或显微镜相机所在的成像点上。
因此，在激光束是平行准直的光学路径的情况下，激光束通过物镜被投影到焦平面的一个点上，其中，该点可以是焦点或者是相对于焦点在焦平面中偏移的点。由此，激光束的最大光强度位于焦平面中的该点处。因此，在所述情况下或在所述示例中聚焦平面和焦平面重合。如果通过改变相对移位位置所述样品区域的边界面位于恰好焦平面处，则投影到焦平面的点上的激光束反射回到物镜，其中，物镜和镜筒透镜然后实现使这种在探测器面或显微镜相机上的投影成像。因此，至少一个像素或少量的具有特别高强度的像素位于探测器面的部分区域中。由此，然后可以在所述部分区域中以特别有利的方式简单地调整到所述部分区域内的最高强度值，以便获得用于对样品区域进行聚焦的度量。因此，基于在此描述的激光束的使用，不需要有时对所述部分区域的多个强度值进行进一步处理或过滤，而是仅须确定在相应的相对移动位置处相应的最高强度值中哪个在所述部分区域内。在此，哪个像素已经探测到强度值的最大值并不重要，从而该方法特别快。如果样品区域相对于物镜继续移动到另一个相对移动位置，则激光束的反射不在单个点上进行，该点是先前在焦平面中的点并且尤其是焦点，而是所述反射在样品区域或边界面的平面区域中进行。由此，与如果激光束仅在焦平面的唯一的点中被反射的情况相比，激光束的光强度分布在部分区域的较大区域上。因此，在探测器面或显微镜相机上的部分区域内也产生强度值，该强度值在总和上虽然仍代表或可以代表激光束的总光学强度，但其中，现在最高的强度值也小于在如下配置中的最高强度值，在该配置中激光束借助边界面精确地在焦平面的一个点中反射。因此，通过评估所述部分区域或其像素，不必例如借助光圈来调整对反射的图案的精确滤出，而是对于相应的相对移动位置的最高强度值的评估允许特别简单且快速的聚焦或以特别高的位置分辨率确定参考相对位置。在存在多个边界面的情况下，可以借助最高强度值的变化曲线然后例如探测第三边界面，以确定参考相对移动位置。因此可以提高所述方法的灵敏度并且已成像的激光束在深度方向上的延伸尺寸可以基本上等于光学系统的景深。
在来自激光源的激光束朝着物镜的开口会聚的情况下，激光束被聚焦到聚焦平面中的聚焦点上，该聚焦平面不与物镜的焦平面重合但与其平行；在此，聚焦平面垂直于物镜的光轴延伸。因此，如果通过考虑所述部分区域的最高强度值以上述方式探测到激光束在边界面处的反射，则边界面虽然位于聚焦平面中，但不在物镜的焦平面中，而是尤其是大致比聚焦平面更靠近物镜。如果聚焦平面与焦平面之间的偏移是已知的，因为激光束在进入到物镜中之前的会聚角度是已知的，则所述偏移可被用作存储的或预先给定的值，导致样品区域朝向焦平面的最终聚焦。如果首先以第一较粗略的距离分辨率借助最高强度值的变化曲线的多个最大值估计参考相对移动位置并且然后在相对移动的换向之后物镜和样品区域再次以更精细的第二距离分辨率相对于彼此定位或移动，则这可以是特别有利的。如果在具有较高距离分辨率的所述第二种方法期间再次探测到变化曲线的决定性的最大值，则当至少两个相继的最高强度值指示在当前的移动方向上的一阶负导数时，才可以在第二方法期间探测到具有精确精度的最大值的存在。然后可以利用之前描述并且已知的聚焦平面与焦平面之间的光学偏移，以便对于样品区域在焦平面中的实际聚焦导致样品区域相对于物镜的最终定向，而在相对移动期间不需要换向。在相对移动期间换向的情况下，物镜和/或样品区域的机械导向元件的对准公差可能这样影响，使得物镜与样品区域之间的实际期望的相对位置有误。这样的对准公差有时也被称为机械装置的逆转间隙。借助在此描述的具有聚焦平面和焦平面的发散的变型方案可以省去所谓的换向，以便因此避免对准公差的不利影响。
根据一种实施形式，所述激光束具有准直平行的射线束，其中，激光束的聚焦平面与物镜的焦平面重合。尤其是优选地，聚焦点与物镜的焦点重合。尤其是，激光束的横截面直径基本上等于物镜的孔径。
在本申请的意义上，术语“焦平面”也可被称作术语“焦距平面”。
根据一种实施形式，所提出的方法还具有以下步骤：在使用第一距离分辨率的情况下通过使物镜和样品区域之间的相对距离从最大距离开始朝向最小距离减小而使物镜和样品区域彼此相对移动，使得所述变化曲线具有多个最大值；基于所述多个最大值确定所述参考相对移动位置作为第一参考相对移动位置；以第二距离分辨率增大朝向第一参考相对移动位置的相对距离，所述第二距离分辨率高于第一距离分辨率，同时检测在相应其它的相对移动位置处的其它最高强度值；基于所述其它最高强度值探测局部最大值的存在。
根据一种实施形式，所述激光束具有朝向物镜准直平行的射线束，其中，此外激光束的聚焦平面与物镜的焦平面重合。在此，然后设定如下相对移动位置作为最终的参考相对移动位置，在所述相对移动位置处存在或存在过基于其它最高强度值探测到的局部最大值。
根据一种实施形式，所述激光束具有朝向物镜会聚的射线束，其中，此外激光束的聚焦平面与物镜的焦平面不重合。在此，然后又将相对距离以预先确定的预设值增大到最终的参考相对移动位置。因此，在所述实施形式中，聚焦平面不与物镜的焦平面重合但与其平行，其中，聚焦平面垂直于光轴延伸。
在读取所述一个或另一个显微镜相机的探测面的像素之前，可以使激光束的源去除激活，并且可以激活荧光光源以用于激发样品的荧光辐射。
激光束可以包括在可见的和/或不可见的波长范围(例如红外线、紫外线)内的电磁辐射。
该方法可以利用根据本发明的一种实施形式的显微镜系统来实施。
所述样品区域可以是以三维延伸的样品区域，其因此在两个横向方向上延伸并且在与其垂直的深度方向上延伸。尤其是，(生物)样品可以处于在样品区域内一定的深度中，由所述样品可以拍摄聚焦的图像、尤其是荧光图像。因此，该方法(以及显微镜系统)尤其是可以被用于自身免疫性诊断来评估免疫荧光制剂。尤其是，该方法和显微镜系统可以辅助间接免疫荧光测试(IIFT)。该方法可以确保快速处理待判断的样品，这要求对样品进行快速聚焦。
所述物镜可以包括一个或多个透镜，这些透镜可以沿物镜的光轴依次相继地设置。物镜可以例如提供10倍、20倍或例如40倍的放大率并且例如具有在0.3至0.8之间的数值孔径。最终被考虑用于拍摄图像的从样品区域发出的光可以包括可见光，例如绿光、红光和/或蓝光，并且尤其是可以通过荧光激发之后的荧光发射从样品区域发射出来。
在显微镜的物镜平面中样品被清晰成像的(深度)范围(所谓的景深)在此与物镜的数值孔径NA有关。在此，在景深tw、待成像的光谱的重心波长λ0与数值孔径NA之间存在以下关系：tw＝λ0/NA2。
所述景深例如可以在500nm与6000nm之间、尤其是在700nm与1100nm之间。本发明的实施形式可以以基本上等于物镜景深的精度来确定参考相对移动位置。因此，可以确保可靠的聚焦。
为了使物镜和样品区域相对移动，物镜和/或样品区域可以被移动。在此，物镜与样品区域之间的距离发生变化，进行物镜与样品区域之间的相对移动。所述方法可以通过由处理器操控驱动机构来进行，其中，该驱动机构改变物镜和/或样品区域的位置或使其移动。
为了使物镜和样品区域相对移动(或者说沿Z方向、即深度方向移动)，样品区域例如可以相对于固定的物镜被移动，或物镜可以相对于固定的样品区域(沿Z方向、即深度方向)被移动。
所使用的激光例如可以具有在可见的红色波长范围内的发射光谱。尤其是，所述激光束可以具有与设置用于拍摄样品区域的图像的波长重叠的波长。例如激光束的波长可以与在荧光显微镜中被探测到的发射光谱重叠。因此，优选仅需要一个(唯一的)显微镜相机，以便一方面辅助聚焦并且另一方面辅助有意地拍摄图像。激光束例如可以借助分束器被耦入到物镜的光学路径中。激光束的横截面延伸尺寸可以优选基本上等于物镜的入射区域(或孔径或光瞳开口)的直径。
所述至少一个边界面可以是例如平坦的边界面，例如在固体材料与空气之间、在固体材料与液体之间、或在固体材料与(有机)样品之间。所述至少一个边界面的存在可以使聚焦变得容易或提高聚焦的可靠性。
所述显微镜相机或另一个显微镜相机可以常规地设置用于拍摄图像，其中，图像可以由显微镜相机的探测面的像素的强度值的总和构成。然而为了聚焦并且尤其是为了确定参考相对移动位置，仅需要或读取显微镜相机的整个探测面的二维部分区域的像素，而不必费时地读取探测面的在所述部分区域之外的其余像素。由此可以加速该方法。所述二维部分区域例如可以具有在优选探测器面为2440×2048个像素的情况下为16×16个像素的尺寸，该像素尤其是对应于探测器面的约0.005％。
在不同的方向上从物镜的物镜侧焦平面的点、尤其是焦点出发的激光束被物镜折射成平行的射线，从而从焦平面的视角来看在物镜后面(或者说在光电流下游)存在平行的射线束。位于物镜下游的透镜(例如镜筒透镜)将平行的射线在所述另一个透镜的图像侧焦平面内会聚在一点上。在此，显微镜相机的探测面位于所述另一个透镜的图像侧的焦平面内。所述探测面例如可以是光敏单元、例如CCD或CMOS光敏单元的阵列或场(尤其是二维场)。
所述部分区域的预先规定的面的大小可以优选尤其是这样选择，使得确保基本上仅从物镜的物镜侧焦平面中的特定点出发或从该点沿不同方向上被发射出的光通过预先规定的面的像素被探测到。因此，从物镜的物镜平面发出的光不能被探测排除。预先规定的面的大小例如可以为几平方微米。
物镜与样品区域之间的距离在深度方向上沿离散的相对移动位置发生变化，而同时读取二维部分区域的像素的强度值；然后，针对每个相对移动位置(即针对物镜与样品区域之间的每个距离)确定像素的强度值中的最高强度值。因此，针对相应的相对移动位置确定部分区域的恰好一个像素的值作为最高强度值。
每个这样确定的最高强度值与相关的相对移动位置(即物镜与样品区域之间的距离)相关联。因此，针对多个不同的相对移动位置确定多个最高强度值。在此，针对不同的相对移动位置的所产生的变化曲线可以具有多个局部最大值或全局最大值。局部最大值以及全局最大值可以分别表示激光束在其中一个边界面上的反射。在此，所述参考相对移动位置例如可以对应于物镜与样品区域之间的距离，其中，激光束被聚焦到样品区域内特定的边界面上、尤其是在基底载体(以下也称为生物芯片)与封固剂(或嵌入介质)之间的边界面上。参考相对移动位置的确定可以使调节用于拍摄图像的相对移动位置变得容易。例如可以在调节参考相对移动位置时拍摄图像；然后，可以优选在所述参考相对移动位置周围的位置处、例如在具有稍微(几微米)更大(和/或更小)的物镜与样品区域之间距离的其它相对移动位置处拍摄其它图像。关于处于样品区域内的样品的性质和几何形状的其它知识可以使从参考相对移动位置出发合适地调节用于拍摄图像的相对移动位置变得容易。
为了确定参考相对移动位置，优选可以在物镜和样品区域的相对移动期间拍摄多个局部图像，并且针对相应的最高强度值连续地评估这些局部图像。在此，例如每秒可以拍摄几千个局部图像。曝光时间可以在微秒范围内。两个局部图像之间的深度方向上的步幅可以在200nm至1000nm之间、尤其是大约500nm。两个局部图像之间的步幅大小应不大于显微镜的景深。
因此可以确保用于拍摄图像的可靠聚焦并且由于快速的焦点确定可以确保高通量。
根据一种实施形式，所述方法还具有以下步骤：使物镜和样品区域彼此沿光轴相对移动到所述参考相对移动位置上方和/或下方的相应最后的相对移动位置处；检测在相应最后的相对移动位置处相应的图像，以及存储所述相应的图像；确定用于相应图像的相应聚焦度量；选择具有最佳聚焦度量的那个图像。优选地，不采纳不具有最佳聚焦度量的其它图像。由此能够实现以自动的方式获得在其聚焦方面最优的图像，而不必由用户观察该图像并且不必由用户进行调节，因为该图像被直接存储；在本方法结束时显微镜不需要处于运行状态下，在该运行状态下物镜和样品区域最佳地彼此定向，而是图像可以在随后的时刻从存储器中查询。这里所述聚焦度量优选可以基于以下算子中的一个或多个：马尔-希尔德雷思算子、高斯拉普拉斯算子和高斯差分算子。
根据一种实施形式，激光束的直径这样确定尺寸，使得物镜的整个孔径被照射。
根据一种实施形式，所述部分区域小于探测器面的1/10、尤其是小于探测器面的1/100。优选地，所述部分区域为小于50×50个像素、尤其是小于20×20个像素。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得所述部分区域具有350μm^2和6400μm^2之间的、尤其是750μm^2和1300μm^2之间的尺寸并且尤其是由16×16个像素构成，其中，该探测面尤其是具有所述部分区域的尺寸的10至100倍之间那么大的尺寸。所述部分区域选择得越小，可以越快地实施该方法。
根据一种实施形式，在物镜与探测面之间的探测光束路径中设置有透镜、尤其是镜筒透镜，该透镜将物镜的焦平面成像到探测面上。在物镜的后面(或者说在光电流下游)可以存在平行的光学路径，并且这些平行的射线可以由管透镜成像到图像侧的焦平面中。因此，物镜相对于镜筒透镜的偏移不会影响平行的射线成像到镜筒透镜的图像侧的焦平面中。因此，只有从物镜的焦平面中特定的一个共同的点、尤其是焦点沿不同方向发出的光线到达探测面的部分区域内特定的点。通过适当地选择预先规定的面的大小，杂散光(该杂散光不是从物镜的物镜侧焦平面中不同方向上的点发出)可以从用于聚焦的探测中排除。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得至少一个边界面、尤其是两个边界面不邻接于空气，其中，所述样品区域尤其是包括有机样品，该有机样品放置在生物芯片上、嵌入在液态物质中并且由盖玻片覆盖，其中，此外尤其是所述盖玻片的上侧形成第一边界面，并且盖玻片的下侧形成第二边界面，并且所述生物芯片的表面形成第三边界面。所述有机样品例如可以包括组织学样品，其例如被染色和/或被掺入一种或多种荧光标记物或荧光分子。所述荧光标记物或荧光分子可以结合到有机样品上预先确定的位置上或受体或抗原上。液体物质可以包括例如甘油。有机样品例如可以是湿的有机样品，其中，可以防止样品变干。本发明的实施形式能够实现使(三维地，即基本上从所有的侧)嵌入到液体中的有机样品成像。所述边界面可以通过边界面上方和下方的折射率的变化来表征。例如在液体介质与固体介质之间的边界面处折射率可以变化的程度小于空气到固体介质(例如玻璃)的边界面处的折射率。边界面处的折射率变化越小，边界面处的反射率可以越低。尽管在第三边界面处的反射相对较小，但该反射仍可以通过按照本发明的方法来探测。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得在检测所述部分区域的像素的强度值期间，物镜与样品区域之间的相对距离从最大距离出发首先减小，使得尤其是首先探测到由第一边界面的激光束反射导致的第一局部最大值，然后是由第二边界面的激光束反射导致的第二局部最大值，并且最后是由第三边界面的激光束反射导致的第三局部最大值。所述第一局部最大值可以是与相对移动位置相关的最大值的变化曲线的全局最大值。如果与相对移动位置相关地在最大值的变化曲线中探测到所有三个(局部)最大值，则聚焦的可靠性可以得到改进。在与相对移动位置相关的最大值的变化曲线内，例如当超过像素强度的确定的阈值时，可以确定(局部)最大值。所述阈值例如可以由先前探测到的(局部)最大值推导出。所述第一局部最大值可以大于第二局部最大值，并且第二局部最大值又可以大于或基本上等于第三局部最大值的高度。如果探测到最大值的这种顺序，则可以提高识别边界面以及因此确定焦点的可靠性。因此，参考相对移动位置基于所述第三最大值来确定。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得所述参考相对移动位置对应于如下相对移动位置，针对该相对移动位置在第三边界面上、尤其是生物芯片的表面上反射的激光束聚焦地成像到探测面的部分区域上，其中，尤其是用于拍摄图像的相对移动位置由关于样品已知的知识从参考相对移动位置出发来调节。例如样品(在生物芯片上)的厚度可以至少近似是已知的并且被预先给定作为预设值。从参考相对移动位置(在该参考相对移动位置中生物芯片的表面位于物镜的焦平面中)出发，例如物镜与样品区域之间的距离可以根据预设值例如改变或校正几微米(根据样品已知的厚度)，以便适应样品类型或基底类型。因此优选还可以在移动位置处拍摄多个图像，这些图像位于校正后的参考相对移动位置的周围。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得在所述激光束的源与物镜之间设置有二向色或非二向色分束器用于反射激光束穿过物镜，所述二向色或非二向色分束器尤其是具有在5％和20％之间的激光束的反射率。因此，激光束可以以简单的方式被耦入到物镜的光学路径中。因此，如果用于激光束的反射率相对较低，例如基本上为10％，因此也可以从通过显微镜相机的探测中排除设置用于拍摄图像的光的仅一小部分。在其它实施形式中，当样品区域的图像被拍摄时，也可以将分束器从光学路径中移除。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得所述分束器具有楔形，其中，分束器的前侧和背侧的平面以楔角相交，该楔角尤其是在0.1°和1°之间，其中，楔角和所述部分区域的大小尤其是这样选择，使得激光束的反射在由分束器的前侧或后侧反射之后和在由样品区域的反射之后被成像到所述部分区域上。具有楔形的分束器可以避免出现干扰，所述干扰可能由于在形成为平板的分束器的前侧和后侧上的反射而出现。尤其是可以使用在楔形分束器的前侧上反射的激光用于聚焦。在楔形分束器的背侧上反射的激光聚焦在物镜的物镜侧的焦平面内。通过适当地选择显微镜相机的探测面的二维的部分区域的大小和位置，可以由探测排除在射线形分束器上反射的这些激光束中的一个激光束。因此，所述方法可以进一步得到改进。优选地，所述部分区域包括探测面的所有像素。
根据本发明的一种实施形式，所述方法这样设计，使得在物镜与样品区域的相对移动期间，在每秒1000和10000次之间读取所述部分区域的像素的强度值，以便确定参考相对移动位置。
应当理解成，根据本发明的实施形式，单独地或以任何组合方式结合用于拍摄样品区的图像的方法所描述、阐述或设定的特征同样可以单独地或以任何组合方式被用于拍摄样品区域的图像的显微镜系统。
根据本发明的一种实施形式，提供一种用于拍摄样品区域的图像的显微镜系统，其包括：激光源，该激光源构造用于产生激光束；至少一个物镜，该物镜构造用于将激光束指向到样品区域上，该样品区域包括至少一个边界面，其中，物镜还实现将激光束成像到聚焦点上，该聚焦点位于聚焦平面中，该聚焦平面平行于焦平面并且优选与所述焦平面重合，并且是聚焦点尤其是位于物镜的光轴上或与该光轴平行的轴线上；此外该物镜能够沿光轴相对于样品区域移动到多个不同的相对移动位置处；还具有至少一个带有探测面的显微镜相机，其中，该显微镜相机构造用于针对相应的相对移动位置检测在边界面处反射的并且穿过物镜出现的激光束的多个强度值，其中，所述强度值由显微镜相机的探测面的二维部分区域的像素检测到；至少一个处理器，该处理器构造用于，针对相应的相对移动位置确定所述部分区域的检测到的强度值中相应最高的强度值，还构造用于通过将相应最高的强度值与相应的相对移动位置关联来确定最高强度值的变化曲线；还构造用于由最高强度值的变化曲线的至少一个最大值确定参考相对移动位置；还构造用于调节用于移动到参考相对移动位置的驱动机构，并且还构造用于借助所述显微镜相机或其他显微镜相机来检测样品区域的图像。
附图说明
现在参考附图来阐述本发明的各实施形式。本发明不限于所说明的或图解的实施形式。
图1以示意性侧视图示出根据本发明的一种实施形式的显微镜系统；
图2以示意性侧视图或侧向的剖面图示出具有样品的样品区域，在使用图1中图解的显微镜系统的情况下可以拍摄所述样品的图像；
图3图解由显微镜相机拍摄的图像的一种示例；
图4a、4b和4c图解显微镜相机的探测面的部分区域的示例，这些示例具有在不同的相对移动位置中拍摄的局部图像，并且图4d示出在所述部分区域内预先确定的面的示例；
图5图解与相对移动位置相关的最高强度值的变化曲线，如该变化曲线根据本方法的一种实施形式确定的那样；
图6示出在与相对移动位置相关的最大值的变化曲线中局部最大值的另一种示例，如根据本方法的一种实施形式确定的那样；
图7图解根据本发明的一种实施形式的显微镜系统在板形分束器的区域中的示意性侧面剖视图；
图8以示意性侧面剖视图示出根据本发明的一种实施形式的显微镜系统在楔形分束器的区域中的一部分；以及
图9图解按照本发明的显微镜系统的一种实施形式，其中，激光束在聚焦平面中聚焦，所述聚焦平面不与物镜的焦平面重合；
图10a和10b图解激光束在不同光学平面中的边界面处的反射，以及
图11a至11d图解在实施按照本发明的方法的一种实施形式时样品区域的不同位置，在该实施形式中激光束的聚焦平面相对于物镜的焦平面偏移。
具体实施方式
在图1中以示意性侧面剖视图图解的显微镜系统100包括物镜3，该物镜3可沿该物镜的光轴13相对于样品区域2移动。通常物镜3和样品区域2可以相对于彼此沿光轴13移动。为此设置有驱动机构15，该驱动机构构造成，在物镜3是固定的同时，使显微镜载物台1(或物镜3)沿箭头方向17(即沿Z方向或沿垂直方向)移动，或在所述载物台是固定的同时，使物镜移动。显微镜系统100还包括激光器10，该激光器构造用于产生激光束19，该激光束通过物镜3指向到样品区域2上。所述激光光源或者说激光器10包括准直光学器件10a，激光束借助所述准直光学器件可被成形为平行准直的射线束。优选地，准直光学器件10a是可调节的，以便使激光束成形为会聚的射线束。所述样品区域包括至少一个边界面，下面参照图2进一步阐述。为了使激光束19转向穿过物镜3，还设置有分束器11。物镜3实现将激光束成像到聚焦点上，该聚焦点位于物镜的光轴上或位于与该光轴平行的轴线上并且该聚焦点还位于聚焦平面中，该聚焦平面与物镜的焦平面平行并且优选与焦平面重合。所述聚焦平面垂直于物镜3的光轴延伸。
在一种实施形式中，激光束19的聚焦平面与物镜的焦平面重合，其中，优选尤其是聚焦点与物镜的焦点重合。因此，聚焦点优选位于焦平面中。优选地，激光束19在此具有准直平行的射线束，如在图1中示出的那样。优选地，在此激光束19的横截面直径d基本上等于物镜3在激光束19进入到物镜3中的位置处的孔径；换句话说：激光束19的直径d这样确定尺寸，使得在激光束19进入到物镜3中的位置处照亮物镜3的整个孔径。
在另一种实施形式中，激光束具有朝向物镜会聚的射线束，如随后还参照图9描述的那样。优选地，在此激光束的聚焦平面不与物镜的焦平面重合，使得尤其是聚焦点不与物镜的焦点重合。优选地，激光束的聚焦平面在此具有比物镜的焦平面小的到物镜的距离。然而，在此聚焦平面也垂直于物镜3的光轴延伸。在此，聚焦平面也平行于焦平面延伸。
图1中的显微镜系统100还包括至少一个具有探测面29的显微镜相机8，该显微镜相机构造成检测由样品区域2反射的并且穿过物镜3的激光束19的由探测面的二维的部分区域的像素探测到强度值。在此在图1中图解的显微镜系统的实施形式100中，为了使穿过物镜3和镜筒透镜6的红光转向，设置有滤光镜组7，以便将具有红色部分的光反射到显微镜相机8上。为此，所述滤光器组7设置用于红绿通道分离。尤其是，滤光器组7包括半透明的反光镜21和红色滤光器23，该红色滤光器滤除红色波长带以外的波长，使得仅希望的红色带的波长入射到显微镜相机8的探测面29上。
所述滤光器组7还优选包括绿色滤光器25，以便仅希望的绿色带通过到优选现有的第二显微镜相机9上。第二显微镜相机9是可选的，在其它实施形式中可以仅需要设置唯一的显微镜相机。滤光器组7也是可选的并且在其它实施形式中可以不用。在这些实施形式中，显微镜相机8可以替代第二显微镜相机9地沿光轴13设置。然而对于确定的荧光研究可以有利的是，分别通过两个不同的显微镜相机或探测通道拍摄多个荧光团的荧光。
所述显微镜系统还包括(在图1中示意性示出的)透镜6、尤其是镜筒透镜或透镜系统6，所述透镜或透镜系统沿光学路径设置在物镜3与显微镜相机8之间并且与物镜3一起将物镜3的焦平面27成像到显微镜相机8的探测面29上。尤其是，物镜和透镜6一起构成一种光学系统，该光学系统实现将物镜的焦平面的焦点成像到探测面29所处的图像平面的像点上。显微镜相机8的探测面29位于透镜6的焦平面31中。
所述系统100可以针对相应的相对移动位置检测在边界面处反射的并且穿过物镜的激光束的多个强度值，其中，所述强度值由显微镜相机8的探测面29的二维的部分区域的像素探测到。
所述显微镜系统100还包括处理器33，该处理器构造成，针对相应的相对移动位置确定所述部分区域65的所检测的强度值中相应最高的强度值。以这种方式确定的最高强度值与对应的相对移动位置相关联，使得由对于相应的相对移动位置的这些相应的最高强度值确定最高强度值的变化曲线。然后由最高强度值的变化曲线的至少一个尤其是局部最大值确定参考相对移动位置。因此，所述处理器在使用控制单元37的情况下操控驱动机构15用于移动到所述参考相对移动位置。此外，处理器33借助显微镜相机8或其他显微镜相机9检测样品区域的图像。在此，处理器33将请求信号38传输给控制器37，用于请求沿z方向调节确定的位置。
为此，处理器33(其可以例如包括在计算机中)与显微镜相机8通信连接，以便尤其是在红光通道中检测或读取探测面29的部分区域的像素的强度的强度信号35。通过所述相机8，处理器33也可以优选检测或读取探测面29的像素的强度的强度信号35，以便尤其是在红光通道中检测样品区域的图像。
优选地，处理器33还与另一个显微镜相机9通信连接，以便优选读取探测面29a的像素的强度的强度信号35a，以便尤其是在绿光通道中检测样品区域的图像。
所述显微镜系统100还包括控制单元或控制器37，所述控制单元或控制器也与处理器33连接(或包括处理器)并且构造成通过控制信号39操控驱动机构15以便使显微镜载物台1(或物镜3)移动。此外，可以设置有测量系统MS，该测量系统独立地测量Z位置(即相对移动位置)并且将其传送给控制器37。
为了拍摄样品区域2的图像，然后基于参考相对移动位置来确定和调整用于拍摄图像的相对移动位置并且最后借助显微镜相机8或显微镜相机9来拍摄图像。
样品区域2包括具有嵌入式生物芯片的载玻片，如在图2中以示意性侧面剖视图更详细地图解的那样。样品区域2包括载玻片41，该载玻片具有带有空隙部43的板形结构。生物芯片45设置在载玻片41的空隙部43中并且借助粘合剂47安装在载玻片41上。围绕生物芯片45，在空隙部43内注入甘油49。在生物芯片45上施加有(生物)样品51。因此，所述样品51被嵌入到甘油49中。盖玻片53利用甘油49包围地覆盖空隙部43以及设置在其中的样品51。盖玻片53具有形成第一边界面的上表面55和形成第二边界面的下表面57。生物芯片45的表面59形成第三边界面。尤其是，所述第三边界面59利用根据本发明的一种实施形式的用于聚焦的方法来确定。
当激光束19被物镜3聚焦到生物芯片45的表面59(即第三边界面)上时，占据参考相对移动位置(物镜3与样品区域2之间的相对垂直距离)。一旦找到所述参考相对移动位置，则当样品51例如用可见光照射或用适当的荧光激发的光照射时，可以通过读取显微镜相机8的优选整个探测面29来拍摄一个或多个图像。替代地，在此使用相机9的探测面29a。
在图1中图解的实施形式中，为了改变相对移动位置(物镜3与样品区域2之间的距离)显微镜载物台1竖直地被移动，而物镜3是固定的。在其它实施形式中，显微镜载物台1可以是固定的，而物镜3可以竖直地被移动。
为了激发样品51(该样品例如可以被掺入荧光团)中的荧光而使用光源4(例如LED)，该光源产生合适的例如蓝色的发射光谱的激发光201。通过荧光滤光器组5将激发光和荧光进行光谱分离。借助物镜3和镜筒透镜6，在物镜平面27中发射的荧光放大地成像到所述两个显微镜相机8、9上。荧光的光束在物镜3与镜筒透镜6之间平行地延伸；因此，透镜3与镜筒透镜6之间的空间也被称为“无限空间”。为此，荧光滤光器组5可以包括二向色反光镜61，该反光镜反射荧光激发光201，而荧光可以基本上未被反射地穿透。
为了在拍摄图像之前快速地聚焦，在通过显微镜拍摄之前借助基于激光和相机的系统对样品进行光学测量。在此，为了确定生物芯片表面的清晰度位置，使用激光器10的例如具有可见的红色发射光谱的光并且借助分束器板11将其耦入到物镜3的光轴13上。在此，这种耦入可以在显微镜的所述无限空间(即射线在其中彼此平行延伸的区段)中进行。在此，激光束19通过未图解的光学器件成形为平行的射线束19。在所述实施形式中，激光束具有准直平行的射线束。在一种实施形式中，激光束的聚焦平面与物镜的焦距平面重合。优选地，激光束的横截面直径基本上等于物镜的孔径。
激光束19通过荧光滤光器组5并且由物镜3聚焦到显微镜系统100的物镜平面27中。如果光学的边界面位于物镜3的焦平面27中，则产生激光束19的点状反射，所述点状反射通过物镜3和镜筒透镜6成像到显微镜相机8上、尤其是成像到显微镜相机8的探测面29上。在此，激光束19的反射作为点状的信号出现在相机的图像中，其强度取决于在载玻片材料处的边界面过渡。
图3示出点状激光反射的整体图像，如其由显微镜相机8的整个探测面29拍摄的那样。如由显微镜相机8记录的整个图像63包括例如1024×1024像素。
在用于确定参考相对移动位置(即生物芯片45的表面59在物镜3的焦平面27中所设置的位置)的方法中，仅读取显微镜相机8的整个探测面29的像素的部分区域，而物镜3与样品区域2之间的距离或者相对移动位置发生变化。
图4a、4b和4c为此示例性地图解探测面29的部分区域65a、65b、65c和由其中包含的像素探测到的强度作为对于不同相对移动位置的激光反射的图像的灰度值。所述部分区域65a、65b、65c例如可以由16×16个像素构成。图4a、4b和4c在此示出局部图像，这些局部图像在相对于物镜3与样品区域2之间的相对距离z＝-0.5μm、z＝0μm和z＝+0.5μm时产生，其中，生物芯片45的表面59设置在物镜的焦平面27中，使得待确定的参考相对移动位置假设z＝0μm。同样图解相应的最高强度值Gmax。如果物镜的焦平面运动离开载玻片中对应的边界面(参见图4a、4c)，则激光信号削弱地或加宽地成像。从图4a、4b和4c中可见，在大约+/-500nm的偏移的情况下对各个像素的调节已经明显降低，也就是说当恰好占据参考相对移动位置时，即在图4b的情况下，在部分区域上的最高像素强度是最大的。通过使用在此描述的具有使激光束聚焦到物镜焦平面中的焦点上的系统，可以实现z位置的特别精确的局部分辨率。如果平面延伸的以及整个的图案被投影到所述部分区域的多个像素上，则该图案在理想的聚焦位置中也具有比在此使用的激光束较大的空间延伸尺寸，从而在z方向上的局部分辨率也会较粗略或较不精确。此外，在这样的图案投影中不足以仅仅将所述部分区域的单个最高像素强度视为用于聚焦的尺度(如在按照本发明的方法中可能的那样)，而是必须将多个像素组合在一起并且通过对多个像素的共同分析将关于平面图案的聚焦确定为用于聚焦的尺度，该尺度与按照本发明观察所述部分区域的单个像素的最高强度相比明显更耗时。
为了确定生物芯片表面的焦点位置(即物镜3与样品区域2之间的相对距离，其中生物芯片45的表面59在物镜3的焦平面27中)，使物镜1沿Z方向17优选以第一距离分辨率或局部分辨率移动通过显微镜系统100的焦点平面27。这可以借助沿Z方向机动化的物镜拍摄部或者通过使载玻片1移动来实现。为了确定焦点，利用显微镜相机8的对应于距离分辨率或局部分辨率的图像检测速率来记录激光反射的强度变化曲线。为了能够实现尽可能高的图像速率，仅读取小的部分区域(例如在图4a、4b、4c中示出的部分区域65)并且将其传输给处理器33。例如局部区域可以包括16×16个像素，由此每秒可以实现数千个图像(例如大约3000个图像)的图像检测速率。
图4d示例性地图解优选使用的预先确定的面66，在该面中检测和评估一个或多个像素的强度值，以便确定在所述部分区域(例如65a、65b、65c)上的最大值。所述预先确定的面66可以恰好对应于单个像素的面，或可以考虑多个像素覆盖预先确定的面66。
对于每个针对确定的相对距离(相对移动位置)记录的局部图像，可以确定最高的像素灰度值或最高的强度值。通过获知向控制器37的请求信号28，处理器33可以将相机数据或强度值与相关的相对移动位置关联并且还可以确定参考相对移动位置。
图5图解(对于每个相对移动位置)确定的最高强度值与相对移动位置相关的变化曲线67的一种示例作为坐标系中的曲线67，其中，在横坐标69上标绘出相对移动位置(Z位置)并且在纵坐标71上标绘出在相关的相对移动位置中所述部分区域中的相应最高的强度值(ADC值)。在此，最低的Z值指示如下位置，在该位置中样品区域离物镜最远，最高的Z值指示如下位置，在该位置中样品区域离物镜最近。首先物镜和样品区域彼此的相对移动通过使物镜与样品区域之间的相对距离从最大距离到最小距离以第一距离分辨率减小来实现，其中，确定最高强度值的变化曲线，所述变化曲线具有多个最大值。所述变化曲线尤其是具有变化曲线的第一局部最大值73、然后第二局部最大值75并且最后第三局部最大值77。
所述曲线67示出表示特征的信号图案(“自动聚焦信号”)，如在图2中图解的样品区域的几何形状基于该信号图案。由于已知样品区域2的构造，因此可以由信号变化曲线67确定生物芯片45、尤其是生物芯片45的表面59的Z位置。
曲线67(自动聚焦信号)具有第一最大值73，第一最大值由激光束19在第一边界面55(盖玻片53的上表面)处的反射造成。曲线67还具有第二最大值75，第二最大值由激光束19从盖玻片53的下表面57(第二边界面)的反射造成。最后，曲线67具有第三最大值77，第三最大值由激光束19从生物芯片45的表面59(第三边界面)的反射造成。在此，生物芯片表面59的焦点位置或参考相对移动位置由确定第三信号最大值77的Z位置79得出。
随后借助微控制器或控制器37和用于使物镜3移动的驱动机构，物镜3随后可以在物镜与样品区域之间的距离增大的情况下再次朝向所确定的焦点位置或参考相对移动位置移动返回。这尤其是在使用比第一距离分辨率更高或更精细的第二距离分辨率的情况下进行。在此，通过自动聚焦信号控制移动的长度，该自动聚焦信号与沿Z的运动同时被监控和评估。在此，分别确定在相应其它相对移动位置处其它的最高强度值以及基于其它强度值探测图6中最大值82的存在。优选地，如果激光束具有朝向物镜准直平行的射线束并且此外激光束的聚焦平面与物镜的焦平面重合，则将相对移动位置调节到这样最终的参考相对移动位置处，在该参考相对移动位置处存在或存在过基于其它最高强度值探测到的局部最大值。
为此，图6图解自动聚焦信号，该自动聚焦信号由激光束19从生物芯片45的表面59的反射造成，即在位置85处在变化曲线中的第三最大值82。在使用具有数值孔径为0.5的20倍放大率的物镜的情况下确定根据横坐标83上的Z位置的部分区域中其它最高强度值的变化曲线81，其中，使用发射波长λ0＝635nm的激光。所述信号81的轴向分辨率例如可以由约2.1μm的半值宽度Δ来确定。参考相对移动位置85例如可以被确定作为Z位置，在该Z位置中出现最大值82或作为曲线81的重心或最大值82的重心。因此物镜可以相对于样品区域移动到相对移动位置85，在该相对移动位置处存在过其它最高强度值的最大值82。因此，这必要时决定图1中驱动机构15的进一步换向，因为例如当识别出随后存在在位置85a处的值82a时才可实现将在位置85处的值82识别为最大值82，从而必须从位置85a移动返回到位置85。
作为最终的参考相对移动位置的焦点位置优选被看作已到达，并且如果满足以下条件，则优选停止移动：
·超过自动聚焦信号的之前定义的阈值。该阈值由之前确定的自动聚焦信号的信号高度来确定。
·自动聚焦信号达到局部最大值82。
然而，生物芯片的表面不必须代表用于荧光显微镜的最佳成像平面，因为样品51的层厚度可以部分地大于显微镜系统100的景深。因此，可以在所确定的焦点位置或所确定的最终参考相对移动位置周围生成多个荧光记录。因此，然后可以优选从最终的参考相对移动位置出发借助图1中的相机8或另一个相机9检测样品区域的多个图像。相机8优选检测红光通道中的图像。相机9优选检测绿光通道中的图像。在此，物镜和样品区域沿光轴彼此相对移动到最终的参考相对移动位置上方和/或下方的相应最终的相对移动位置上。在此，还借助第一显微镜相机8或另一个显微镜相机9在相应最终的相对移动位置处检测相应的图像。处理器33然后存储相应的图像并且确定相应图像的相应聚焦度量。处理器33然后选择具有最佳聚焦度量的图像。优选地，处理器33不采纳不具有最佳聚焦度量的其它图像。
如由图5得出，所述最大值具有确定的图案的信号高度。如果局部最大值77的信号高度大于之前确定的或预先给定的阈值并且此外实际上存在局部最大值，也就是说参考相对移动位置79右边和左边的强度值小于恰好在参考相对移动位置79中的强度，那么由变化曲线可以优选例如识别为可靠地探测到第三最大值77。因此，优选以可靠的方式可以确定参考相对移动位置，在所述参考相对移动位置中激光束19聚焦到生物芯片45的表面59上。为了能够使最大值73、75和77可靠地分开，根据本发明的一种实施形式，自动聚焦系统的分辨率大约等于显微镜系统的景深。平行的激光束19的直径d(参见图1)优选这样确定尺寸，使得显微镜物镜3的整个孔径被照亮。例如可以使用具有红色发射波长(例如λ0＝635nm)的激光器，为此在数值孔径为0.5的情况下得出约tw＝2.54μm的景深。
为了防止从焦平面27之外反射的光与所述测量叠加并且因此防止该方法的轴向分辨率降低，有利地使用激光器和探测器的物理特性，而不需要通常使用的孔板。激光器10的有效发射面可有利地为几μm，从而存在点光源。由此可以省去光源孔板。
也可以省去探测器孔板，因为根据本发明的一种实施形式，在每个Z测量点处(在每个相对移动位置处)信号强度分别单独通过在探测面29的部分区域中具有最高强度值的像素来限定。以这种方式，可以模拟几平方微米的虚拟孔板，虚拟孔板的面对应于像素面。根据像素的尺寸，预先确定的面可以由一个或多个像素给出。通过在此评估的16×16个像素的较大的相机图像区域，该方法同时可以相对于激光位置与图像区域中心的偏差是稳固的。在短的曝光时间的情况下，可以明显强地减小从焦平面外部未清晰成像的反射的影响，使得所获得的信号几乎仅由来自焦平面27的激光反射来限定。例如可以使用3.45μm×3.45μm作为像素尺寸并且曝光时间可以在例如20μs至1000μs之间。
图7以示意性侧面剖视图图解根据本发明的一种实施形式的分束器11a，该分束器可以例如在图1中图解的显微镜系统100中使用。所述分束器11a是具有前表面87和后表面89的平行板状分束器，激光束19可以分别反射到这些表面上，以便造成两个不同反射的子光束I1和I2。所述两个子光束I1和I2通过物镜3在焦平面27中叠加，由此可能产生功率波动。为了减少所述功率波动，可以使用低聚合光源，由此可以减少干扰。
替代地，为了减少所述功率波动，可以使用具有轻微楔角的分束器板11b(“楔形板”)，如在图8中的剖面图中示意性图解的那样。该楔形板11b具有前表面91和后表面93，它们彼此不是平行的，但是相对于彼此倾斜角度α。通过将该楔形板用作分束器11(例如在图1中图解的显微镜系统100中)，激光19在前侧91和背侧93上的激光反射沿不同的方向被转向，以产生子光束I1和I2，这些子光束因此以不同的角度进入到物镜3中并且因此被聚焦到物镜的焦平面27中的两个不同位置95和97上。所述位置95和97因此在物镜平面27中横向偏移。所述两个子光束I1和I2在观察位置上的叠加现在不再发生并且因此也不发生干扰性干涉。
两个子光束I1和I2可以在物镜的入射光瞳中继续叠加。然而，在叠加位置处形成干涉调制，其空间频率与分束器的楔角有关。为了避免由于调制图案的最小值和最大值在入射光瞳中的不利位置引起的功率损耗，楔角应当至少选择得这样大，使得干涉图案在物镜的整个孔径上具有至少10个最大值或最小值。
具有楔角的分束器11b也可以对显微镜系统100的成像产生影响。因此，例如可能产生显微镜图像的横向的、与波长有关的位移以及在一维方向上的失真。因此，分束器的最大楔角与相应的显微镜应用有关。例如可以将楔角示例性地选择为α＝0.5°。
原则上，可以通过图像评估中合适的附加光学元件或方法来校正可能出现的成像误差。例如可以设置第二楔形分束器板，其与第一分束器板相同并且这样设置在显微镜的无限空间中，使得由于两个分束器的楔形而导致角度变化相互抵消。
根据本发明的方法和系统可以提供各种优点：
通过在红光通道中双重使用显微镜相机来聚焦和检测红光通道中样品区域的一个或多个图像，因此不需要额外的探测器。由此节省了构件成本和调整耗费。附加所需的构件数量可以因此限制于射线扩展的准直的激光模块和分束器。
通过评估相机数据中的各个像素，可以获得Z方向上的高分辨率，这可以与光电探测器-孔板组合(共焦技术)进行比较。同时可以取消在孔板应用中通常高的调整耗费，因为对于每个测量深度检测具有多个像素(典型地16×16个)的探测器区域。在此，在所述区域内的、也就是在所述部分区域内的哪个像素探测或具有最大灰度值是不重要的。
因为探测器区域的选择也可以动态地进行(例如在显微镜的初始化阶段中)，激光信号可以几乎任意地位于相机的探测器面上。因此，相比于基于孔板的自动对焦应用，该方法非常稳固。
可以使用发射波长处于近红外线(NIR)(例如大约830nm)的激光模块作为光源。在这种情况下，二向色分束器11可被用于将激光耦入到物镜的光学路径中。在这种情况下不需要楔形分束器板。
为了避免干涉造成的信号波动，原则上也可以使用低相干光源、例如超发光二极管或具有减小的相干长度的激光光源。在这种情况下，楔形分束器板可以用简单的分束器(平行板)来替换。在此，所述发射波长可以位于可见范围内或处于近红外线中。
微控制器控制的沿Z方向的移动(相对移动位置的改变)可以利用机动化物镜拍摄部或机动化显微镜载物台来实现。
根据本发明的实施形式，(在探测面的前面)不使用固定的孔板，而是评估相机的探测器区域的各个像素的亮度。考虑用于评估的预先确定的面66的尺寸(参见图4D)可以在传统使用的物理孔板孔径的数量级中。
根据之前参考附图1、5和6描述的本方法的实施形式，激光束具有朝向物镜准直平行的射线束，并且此外激光束的聚焦平面与物镜的焦平面重合。根据该实施形式，在借助图5中的最大值77确定第一参考相对移动位置79之后随后朝向第一参考相对移动位置的相对距离以第二距离分辨率增大，所述第二距离分辨率高于第一距离分辨率。在此，同时在相应其它的相对移动位置处检测其它最高强度值，使得在基于其它最高强度值探测局部最大值的存在时，将如下的相对移动位置设定为最终的参考相对移动位置，在该相对移动位置处存在或存在过基于其它最高强度值探测的局部最大值。如之前描述的，这可能引起进一步的换向。如果进行这种换向，则图1中驱动机构15的机械装置的所谓的逆转间隙可能导致物镜与样品区域之间的错误定向，使得因此可能降低聚焦的质量。
现在将参考图9描述该方法的另一种实施形式，在该实施形式中可以避免这种换向，以避免由于逆转间隙而导致的物镜与样品区域之间的错误定向。激光光源10借助准直光学器件10a这样调节，使得激光束具有朝向物镜会聚的射线束19a。这实现通过物镜3激光束19a的聚焦平面27b不与物镜的焦平面27重合。由此尤其是实现聚焦点不位于焦平面27中。在此，焦点通过激光器的准直光学器件从显微镜的焦点尤其是朝向物镜移动，优选移动了物镜景深的3至10倍的数值。在这种情况下，聚焦的激光束的会聚角度(半张角)可以优选地在-1arcmin到-15arcmin的范围内，但是不限于这些值。
因为物镜3和透镜6以及相机8以及尤其是反光镜7以其各自的光学距离这样相互定位，使得射线从物镜3的焦平面27、尤其是焦平面27的焦点的一个共同点成像到探测器面29的一个点上，所以在生物芯片45的边界面或表面59位于聚焦平面27中的情况下，激光束点的反射不会精确地成像到探测器面的一个精确的点上。然而，在焦平面27与聚焦平面27b之间存在另一个反射平面27c，在该反射平面上生物芯片45的边界面或表面59实现激光束的这种反射，使得所述反射同样点状地成像到在探测器平面29上的一个点上。
图10a和图10b为此详细示出物镜3的光学开口、具有物镜的焦点271的焦平面27以及具有焦点272的激光束的聚焦平面27b。所述另一个反射平面27c位于焦平面27与聚焦平面27b之间。假设生物芯片的边界面或表面59位于所述另一个反射平面27c上。进入的激光束19a实际上在所述另一个反射平面27c上反射并且作为反射的激光束19b被引导回到物镜。这些激光束19b以与它们不在所述另一个反射平面27c而是在正确焦平面27中被反射时所发生的角度相同的角度进入到物镜3中；换句话说：激光束19a在样品边界面处在另一个反射平面27c中反射，使得返回的激光束19b看起来像射线19c一样来自物镜3的焦平面27的一个共同的点271、尤其是焦平面27的焦点271。因此，对于在所述另一个反射平面27c中反射的激光束19b也实现图9中正确地点状成像到探测器平面27的一个点上。
所述另一个反射平面27c与实际焦平面27之间的距离或位移V可以借助安装在显微镜中的用于校准目的的参考样品被事先确定，使得预设值可以存储在处理器33中，所述预设值随后可以在本方法的实施形式中详细讨论。
图10b图解再次对于其它光学路径19a、19b、19c所述另一个反射平面的效果。现在接下来描述，借助图10a和10b阐述的焦点移动的效果如何被用于避免逆转间隙。
假设首先如之前阐述的那样物镜和样品区域彼此的相对移动在使用第一距离分辨率的情况下通过使相对距离从最大距离减小到最小距离而实现，使得如在图5中图解的那样，最大强度值的所述变化曲线具有多个最大值。然后进一步假设，将基于多个最大值的参考相对移动位置确定作为第一参考相对移动位置。进一步假设，生物芯片的表面59作为边界面位于激光束的焦平面27b与物镜3之间，如在图11a中图解的那样。如果现在物镜3与样品区域之间的或者物镜3与生物芯片的表面59之间的相对距离朝着第一参考相对移动位置沿移动方向R以高于第一距离分辨率的第二距离分辨率增大，并且同时在相应其它的相对移动位置处检测其它最高强度值，则可以假设，在图6中图解的曲线81从其它强度值从右边朝向最大值82的方向移动。
因此如果如在图11b中图解的那样生物芯片的表面59恰好位于所述另一个反射平面27c中，则在曲线的变化曲线81中得出在位置85处的最大值82。然后物镜相对于样品区域(或反之亦然)以另一个第二分辨率精度或第二分辨率精度步幅这样移动，使得物镜3与样品区域之间的距离进一步增大。所述移动方向被标绘为方向R。
如果生物芯片的表面59位于在图11b中图解的位置中、即在所述另一个反射平面27c中，则得出位置85的最大值82。如果生物芯片的表面59位于在图11c中图解的位置中、即在所述另一个反射平面27c的下方，则得出在位置85a处相对于最大值82较小的值82a。因此，然后可以借助变化曲线81的其它最高强度值探测，在前一位置85中存在过的局部最大值82。现在优选地仅还必须从对应于图11c的位置85a将样品区域或生物芯片的表面59与物镜之间的相对距离以预先确定的预设值增大到最终的参考相对移动位置85f，该参考相对移动位置对应于图11d，在图11d中样品区域或生物芯片的表面59在焦平面中。所述增大或所述预设值对应于焦平面27与所述另一个反射平面27c之间的偏移V减去第二分辨率精度步幅来选择，将样品区域或生物芯片的表面59已经从图11b的位置以所述第二分辨率精度步幅被移动到图11c的位置。这种进一步增大沿相同的方向R进行，而没有换向。由此这避免了在探测到最大值82(图6)之后必须借助将样品区域或生物芯片的表面59从位置85a移动到位置85f的方法来进行换向，使得也同样避免了由于驱动机构15(图1)的机械装置的逆转间隙而导致的不精确性。在焦平面与聚焦平面之间没有偏移V的情况下必须进行从位置85a到位置85的换向，使得逆转间隙对样品区域的定位以及因此也对聚焦结果具有不利影响。
因为曲线81的测量值或其它最高强度值也可能与波动和噪声叠加，所以为了找到最大值82和最终的参考相对移动位置优选如进一步描述的那样移动。首先在使用第二距离分辨率的情况下将曲线81从右向左移动。如果随后从位置85c之前的值82c或当前的最大值85c朝向位置85d当前的值82d确定相继的值减少，则在随后的位置窗口内向左检查是否能够找到大于至今探测到的当前最大值82c的其他值。假设是这种情况，因为图解的窗口FE的应用从位置85c向左导致发现大于值82c的值。如果随后在位置85处发现最大值82，则虽然在位置85a处发现较小的值82a，但在窗口FE内向左没有大于当前最大值82的值。因此存在样品区域或生物芯片的表面59以及位置85e。然后相应地可以考虑聚焦平面与焦平面之间的偏移V，使得从位置85e起样品区域或生物芯片的表面59以预设值或者进给V2进一步被移动到位置85f作为最终的参考相对移动位置。所述预设值V2优选根据V2＝V-FE来确定。
本发明的实施形式能够实现可靠地聚焦到光学边界面上，这些边界面位于三维样品区域内，并且尤其是具有不与空气邻接的边界面。位于样品区域内的边界面处的激光反射原则上弱于在表面处到空气的激光反射。例如甘油生物芯片的边界面(即第三边界面)的反射率可以仅为0.029％。而空气到盖玻片上侧的边界面的反射率可以为约4.3％。因此，与聚焦相关的边界面提供一个信号，该信号比样品表面到空气的信号小了约150的因数。由于根据相对移动位置看出典型的反射图案，仍然可以实现可靠地聚焦到生物芯片表面上。
根据规定的执行要求，本发明的实施例能够在硬件和/或软件中实现处理器和/或控制单元。这里所述处理器和/或这里所述控制单元的实现在此可以作为至少一个单元进行或者通过复合体中的多个单元进行。所述执行可以在使用数字存储介质、例如软盘、DVD、蓝光光盘、CD、ROM、PROM、EPROM、EEPROM或闪存、硬盘或其它磁性或光存储器的情况下被实施，在这些存储介质上存储有电子可读的控制信号，这些控制信号与可编程的硬件构件能够这样配合作用或配合作用，使得相应的方法被实施。可编程的硬件构件可以由计算机处理器(CPU＝Central Processing Unit)、计算机、计算机系统、专用集成开关电路(ASIC＝Application-Specific Integrated Circuit)、集成开关电路(IC＝IntegratedCircuit)、片上系统(SOC＝System on Chip)、可编程逻辑元件或者有微处理器的现场可编程门阵列(FPGA＝Field Programmable Gate Array)构成为控制单元。因此，数字存储介质可以是机器可读的或计算机可读的。因此，一些实施例包括数据载体，所述数据载体具有电子可读的控制信号，这些控制信号能够与可编程的计算机系统或可编程的硬件构件配合作用，从而实施这里描述的方法之一。一般地，本发明的实施例或实施例的部分可以作为具有程序代码的程序、固件、计算机程序或计算机程序产品或者作为数据来执行，其中，如果程序在处理器或可编程的硬件构件上执行时，所述程序代码或数据有效地实施所述方法之一或所述方法的一部分。

Claims (19)

1.用于拍摄样品区域(2)的图像的方法，所述方法包括：
将激光束(19)借助至少一个物镜(3)指向到样品区域(2)上，该样品区域包括至少一个边界面，其中，所述物镜实现将激光束成像到聚焦点上，该聚焦点位于聚焦平面(27b)中；
使物镜(3)和样品区域(2)彼此沿所述物镜(3)的光轴(13)相对移动到多个不同的相对移动位置处；
针对相应的相对移动位置(Z)，检测在边界面处反射的并且穿过所述物镜(3)的激光束的多个强度值，所述强度值由显微镜相机(8)的探测面(29)的二维的部分区域(65)的像素探测到；
针对相应的相对移动位置(Z)，将所述部分区域(65)的相应多个检测到的强度值中的恰好一个像素的相应最高的强度值确定为用于聚焦的尺度的单个最高像素强度；
通过将相应最高的强度值与相应的相对移动位置(Z)关联来确定最高强度值的变化曲线(67)；
由最高强度值的变化曲线(67)的至少一个最大值确定参考相对移动位置(79)；
检测在所述参考相对移动位置处样品区域的至少一个图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，该聚焦点位于所述物镜的光轴上或与所述物镜的光轴平行的轴线上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述激光束(19)具有准直平行的射线束，并且所述激光束(19)的聚焦平面与所述物镜(3)的焦平面(27)重合。
4.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
在使用第一距离分辨率的情况下通过使相对距离从最大距离开始减小到最小距离而使所述物镜(3)和所述样品区域彼此相对移动，使得所述变化曲线具有多个最大值；
基于所述多个最大值确定所述参考相对移动位置(79)作为第一参考相对移动位置；
以第二距离分辨率增大朝向第一参考相对移动位置的相对距离，所述第二距离分辨率高于所述第一距离分辨率，同时检测在相应其它的相对移动位置处的其它最高强度值(81)；
基于所述其它最高强度值(81)探测局部最大值(82)的存在。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述激光束具有朝向所述物镜准直平行的射线束，并且此外所述激光束(19)的聚焦平面与所述物镜(3)的焦平面(27)重合，
该方法还包括：将如下相对移动位置设定为最终的参考相对移动位置，在所述相对移动位置处存在或存在过基于所述其它最高强度值(81)探测到的局部最大值(82)。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述激光束具有朝向所述物镜会聚的射线束(19a)，并且此外所述激光束的聚焦平面(27b)不与所述物镜的焦平面(27)重合，
该方法还包括：又将所述相对距离以预先确定的预设值增大到最终的参考相对移动位置(85f)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，还包括：
使所述物镜(3)和所述样品区域(2)彼此沿所述光轴(13)相对移动到在所述参考相对移动位置上方和/或下方的相应最后的相对移动位置处；
检测在相应最后的相对移动位置处的相应的图像，以及存储所述相应的图像；
确定用于相应图像的相应聚焦度量以及选择具有最佳聚焦度量的图像。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述激光束(19)的直径确定尺寸，使得所述物镜(3)的整个孔径被照射。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述部分区域小于探测面的1/10。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述部分区域小于探测面的1/100。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在所述物镜(3)与所述探测面(29)之间的探测光束路径中设置有透镜或透镜系统(6)，所述透镜或透镜系统将所述物镜(3)的焦平面(27)成像到探测面(29)上。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，至少一个边界面不邻接于空气，其中，所述样品区域(2)包括有机的样品(51)，该有机的样品放置在基底载体(45)上、嵌入在液态物质(49)中并且由盖玻片(53)覆盖，其中，此外所述盖玻片的上侧(55)形成第一边界面，所述盖玻片的下侧形成第二边界面，并且所述基底载体(45)的表面形成第三边界面。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在检测所述部分区域的像素的强度值期间，在所述物镜(3)与所述样品区域(2)之间的相对距离从最大距离出发首先减小，并且使得所述变化曲线首先具有所述变化曲线的第一局部最大值(73)、然后第二局部最大值(75)和最后第三局部最大值(77)，其中，所述参考相对移动位置(79)基于所述第三局部最大值(77)来确定。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述参考相对移动位置(79)对应于如下相对移动位置，针对所述相对移动位置在所述第三边界面上反射的激光束聚焦地成像到所述探测面(29)的部分区域(65)上，其中，所述参考相对移动位置(79)基于预设值发生改变或校正，以便拍摄图像。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在所述激光束(19)的源(10)与物镜(3)之间设置有二向色或非二向色分束器(11、11a、11b)用于反射所述激光束(19)穿过所述物镜。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述分束器具有楔形，其中，分束器的前侧(91)和背侧(93)的平面以楔角(α)相交，其中，所述楔角(α)选择成使得由在分束器的前侧和背侧上的反射的叠加所产生的干涉图案在物镜的整个孔径上具有至少10个最大值或最小值，或者通过至少一个附加的光学元件来校正由具有楔形的分束器引起的成像误差。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，该楔角(α)在0.1°至1°之间。
18.用于拍摄样品区域(2)的图像的显微镜系统(100)，所述显微镜系统包括：
激光源(10)，该激光源构造用于产生激光束(19)；
至少一个物镜(3)，所述物镜构造用于将激光束(19)指向到样品区域(2)上，该样品区域包括至少一个边界面，其中，物镜(3)实现将激光束(19)成像到聚焦点上，该聚焦点位于聚焦平面(27b)中，并且所述物镜能够沿光轴相对于样品区域(2)移动到多个不同的相对移动位置处；
至少一个具有探测面(29)的显微镜相机(8)，其中，该显微镜相机构造用于针对相应的相对移动位置(Z)检测在边界面处反射的并且穿过物镜的激光束的多个强度值，其中，所述强度值由显微镜相机(8)的探测面(29)的二维的部分区域(65)的像素检测到；
至少一个处理器(33)，所述处理器构造用于：针对相应的相对移动位置，将所述部分区域(65)的检测到的强度值中的恰好一个像素的相应最高的强度值确定为用于聚焦的尺度的单个最高像素强度；通过将相应最高的强度值与相应的相对移动位置(Z)关联来确定最高强度值的变化曲线(81)；由最高强度值的变化曲线(67)的至少一个最大值确定参考相对移动位置(79)；调节用于移动到参考相对移动位置(79)的驱动机构(15)，以及还借助所述显微镜相机来检测样品区域的图像。
19.根据权利要求18所述的显微镜系统(100)，其中，所述聚焦点位于物镜(3)的光轴上或与该光轴平行的轴线上。
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