CN111349662A - 以利用pha发酵工艺废水进行发酵制备pha的方法 - Google Patents

以利用pha发酵工艺废水进行发酵制备pha的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PHA发酵领域，具体涉及一种以利用PHA发酵工艺废水进行发酵制备PHA的方法。该方法包括：在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；其中，所述发酵培养基的配液水包括PHA发酵工艺废水。该方法能够使得PHA发酵工艺废水多次循环使用，有效降低PHA的生产成本，且保证了PHA发酵的效果，同时也降低了耗水量。

Description

以利用PHA发酵工艺废水进行发酵制备PHA的方法
技术领域
本发明涉及PHA发酵领域，具体涉及一种以利用PHA发酵工艺废水进行发酵制备PHA的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是微生物合成的一种细胞内聚酯，属于天然的高分子生物材料。PHA兼具良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，目前常应用于生物医用材料和生物可降解包装材料等领域。生产PHA的主要方法为微生物发酵法，目前PHA生产工艺已十分成熟，经改良后的盐单胞菌发酵48h的PHA积累量可达70％以上，然而PHA生产过程产生废水的处理问题却难以彻底解决，这已成为限制PHA发酵生产发展的瓶颈问题。PHA的发酵废水主要包括了发酵废液、清洗废水和破壁废水等。PHA发酵后的废水呈高盐高碱性，且富含多种微量元素，如果直接排放会造成严重的水体或土壤污染。
目前国内处理高盐废水的主要方法有：碟管式反渗透(DTRO)技术+蒸发结晶技术、焚烧工艺技术、蒸发浓缩-冷却结晶工艺技术、蒸发-热结晶工艺技术，这些传统方法消耗大量人力物力，能耗巨大，且容易造成资源浪费。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种以利用PHA发酵工艺废水进行发酵制备PHA的方法，该方法能够使得PHA发酵工艺废水多次循环使用，有效降低PHA的生产成本，且保证了PHA发酵的效果，同时也降低了耗水量。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种发酵制备PHA的方法，该方法包括：在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；
其中，所述发酵培养基的配液水包括PHA发酵工艺废水。
优选的，所述发酵在搅拌的条件下进行，从发酵0h到发酵8-12h，所述搅拌的转速为400-600rpm；
从发酵8-12h到发酵16-20h，所述搅拌的转速为600-1000rpm；
从发酵16-20h到发酵结束，所述搅拌的转速为400-600rpm。
优选的，所述营养物质的补加方法包括：
(1)当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积％；
(2)当第一营养物质补充结束时，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1，第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积％；
(3)当第二营养物质补充结束时，补充第三营养物质，所述第三营养物质为葡萄糖，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积％。
通过上述技术方案，本发明在保证PHA发酵效果的情况下，能够实现PHA发酵工艺废水多次循环回用于PHA发酵工艺，降低了工艺废水的排放量和废水处理工段的成本，同时降低了耗水量，有效降低了PHA的生产成本。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种发酵制备PHA的方法，该方法包括：在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；
其中，所述发酵培养基的配液水包括PHA发酵工艺废水。
根据本发明，尽管只要将PHA发酵的工艺废水回用至发酵过程，作为培养基的配液水即可实现本发明的目的，但优选地，为了进一步提高发酵效率，所述PHA发酵工艺废水的粘度<20CPS，COD值<10000mg/L，色度<80。
其中，所述粘度可以使用粘度计进行测定。
其中，所述色度可以使用铂钴标准方法进行测定。
根据本发明，当PHA发酵工艺所产生的废水指标超过如上指标时，可以对其进行进一步处理，例如，可以经浓缩后用于生物肥料，可以净化处理至满足上述指标后进一步作为至少部分所述发酵培养基的配液水。
根据本发明，进一步优选的，所述PHA发酵工艺废水色泽澄清，无明显悬浊和沉淀，固含量在2-5重量％之间。
根据本发明一种优选的实施方式，在将PHA发酵工艺废水回用至PHA发酵工段时，还包括对其进行过滤处理，例如，进行膜过滤。
优选地，所述膜过滤为陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜的孔径为100-600nm，例如，可以为100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm，优选为200-500nm。
根据本发明，所述PHA发酵工艺废水可以为来自PHA发酵过程中产生的任意废水，例如，发酵清液、洗涤废水和破壁废水。
其中，所述发酵清液指的是将PHA发酵液分离出菌体(例如，通过离心或过滤的方式)后所得液相。
所述洗涤废水指的是在PHA提取过程中，对分离出的菌体沉淀进行洗涤所产生的液相。
所述破壁废水指的是在PHA提取过程中，对菌体细胞进行破壁处理所产生的液相。
根据本发明，优选地，所述发酵培养基以PHA发酵工艺废水添加或不添加纯水作为配液水。
根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基以PHA发酵工艺废水添加纯水作为配液水，PHA发酵工艺废水与纯水的体积比为3-10:1，例如，可以为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。
根据本发明，优选地，所述发酵培养基含有葡萄糖、氮源、磷酸盐、镁盐和钠盐。
根据本发明，所述葡萄糖在发酵培养基中的含量可以在较宽的范围内选择，优选地，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为10-35g，10g、15g、20g、25g、30g、35g，进一步优选为15-30g。
根据本发明，所述氮源的种类没有特别的限制，只要能够为PHA发酵菌种提供所需的氮源即可，可以为有机氮源，例如，玉米浆粉、豆粕粉、氨基酸等，也可以为无机氮源，例如，尿素、硫酸铵、碳酸铵等。根据本发明一种优选的实施方式，所述氮源为玉米浆粉和/或尿素。
其中，所述氮源的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述氮源的含量为15-25g，例如，可以为15g、17g、19g、21g、23g、25g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述氮源包括玉米浆粉和尿素，相对于1L发酵培养基，所述玉米浆粉的含量为15-21g，例如，可以为15g、16g、17g、18g、19g、20g、21g；所述尿素的含量为1.5-2.5g，例如，可以为1.5g、1.7g、1.9g、2.1g、2.3g、2.5g。
其中，所述磷酸盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述磷酸盐的含量为5-20g，例如，可以为5g、7g、9g、11g、13g、15g、16g、17g、18g、19g、20g。
根据本发明，所述磷酸盐可以为PHA发酵过程中常规使用的磷酸盐，例如，磷酸的钠盐、磷酸的钾盐，优选的，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠；进一步优选的，相对于1L发酵培养基，磷酸氢二钾的含量为2-5g，优选为3-3.5g，例如，可以为3g、3.1g、3.2g、3.3g、3.4g、3.5g；磷酸氢二钠的含量为5-8g，优选为6-7.5g，例如，可以为6g、6.5g、7g、7.5g。
根据本发明，所述镁盐可以为常规的各种镁盐，但不包括磷酸的镁盐，优选的，所述镁盐为硫酸镁和/或氯化镁。
其中，所述镁盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述镁盐的含量为0.1-0.5g，例如，可以为0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g，优选为0.2-0.3g。
根据本发明，所述钠盐可以为常规的各种钠盐，但不包括磷酸的钠盐，优选的，钠盐为氯化钠。
其中，所述钠盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述钠盐的含量为40-70g，例如，可以40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g，更优选为45-55g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基以PHA发酵工艺废水添加纯水作为配液水，所述发酵培养基含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为15-30g、玉米浆粉的含量为15-21g、尿素的含量为1.5-2.5g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g。
需要说明的是，如上各物质的含量指的是在培养基中各物质的含量，而并非是指各物质的总投料量。
根据本发明，PHA发酵的温度可以为其常规的发酵温度，优选的，温度为30-45℃，例如，可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃。更优选的，温度为35-39℃。
根据本发明，PHA发酵的pH可以为其常规的发酵pH，优选的，pH值为7-9，例如，可以为7、7.5、8、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、9。更优选的，pH值为8.3-8.7。其中，所述pH值可以使用常规的碱进行调节，例如，8-12mol/L的氢氧化钠溶液。
根据本发明，PHA发酵的溶氧量可以为其常规的发酵溶氧量，优选的，溶氧量为1-40％，例如，可以为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％。更优选的，溶氧量为1-30％。
根据本发明，所述PHA的发酵条件还优选包括对通风量进行控制，优选的，通风量为0.5-1.5vvm，例如，可以为0.5vvm、0.6vvm、0.7vvm、0.8vvm、0.9vvm、1vvm、1.1vvm、1.2vvm、1.3vvm、1.4vvm、1.5vvm，优选为1-1.2vvm。
根据本发明，所述PHA的发酵条件还优选包括搅拌，其中，所述搅拌的转速可以在较宽的范围内选择，优选的，以2-7L发酵罐计，所述搅拌的转速为400-1000rpm，例如，可以为400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm、750rpm、800rpm、850rpm、900rpm、950rpm、1000rpm。
本发明的发明人在研究的过程中发现，通过在不同的发酵阶段控制不同的搅拌转速，能够进一步提高最终的发酵效果。优选的，所述发酵在搅拌的条件下进行，从发酵0h到发酵8-12h(例如，可以为0-8h、0-9h时、0-10h、0-11h、0-12h)，优选到发酵9-11h，所述搅拌的转速为400-600rpm；
从发酵8-12h(优选9-11h)到发酵16-20h(例如，可以为8-16h、9-17h、10-18h、11-19h、12-20h、9-20h、10-20h等等，优选17-19h，具体起始时间依据上一阶段终止时间而定)，所述搅拌的转速为600-1000rpm；
从发酵16-20h(优选17-19h)到发酵结束(例如，16h至发酵结束、17h至发酵结束、18h至发酵结束、19h至发酵结束、20h至发酵结束，具体起始时间依据上一阶段终止时间而定)，所述搅拌的转速为400-600rpm。
根据本发明，所述PHA的发酵可以在不补料情况下进行，也可以在补料的情况下进行。根据本发明一种优选的实施方式，所述PHA的发酵为补料发酵，也即，在发酵的过程中补加营养物质。
根据本发明，所述营养物质的添加时机可以根据PHA发酵菌种对糖的需求情况而定，优选的，当发酵培养基中的糖含量下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L(例如，5g/L、6g/L、7g/L、8g/L)以下时，开始补加所述营养物质。
其中，所述营养物质的补加量优选使得发酵培养基中的糖含量控制在5-20g/L，例如，5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L，优选为8-15g/L。
其中，所述糖含量是指利用SBA-90生物传感分析仪测定的发酵离心上清液中的糖含量。
其中，优选的，在发酵的过程中实时监测发酵体系中的糖含量。
优选地，当所述发酵液的OD600的增速小于5/h时即可结束发酵，根据发明人的发酵经验，当发酵36-48小时，优选39-42小时时，OD600的增速可以降低至如上的水平。
其中，OD600指的是发酵液在分光光度计中在600nm波长处的吸光值。
其中，优选的，在发酵的过程中实时监测发酵体系中的OD600。
根据本发明，所述营养物质可以为常规的发酵过程中的补料，只要能够满足如上的要求即可，例如，所述营养物质可以含有葡萄糖。
本发明的发明人进一步发现，在发酵的不同阶段补加不同的营养物质，能够进一步提高发酵效果，优选的，所述营养物质的补加方法包括：
(1)当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，优选为13-14:1；第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积％。
优选的，所述第一营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和硫酸镁。
更优选地，相对于1L的第一营养物质，葡萄糖的含量为400-500g、玉米浆粉的含量为42-50g、尿素的含量为15-25g、磷酸氢二钾的含量为2-3g、磷酸氢二钠的含量为5-10g、硫酸镁的含量为0.2-0.4g。
(2)当第一营养物质补充结束后，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1，优选为39-42:1；第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积％。
优选的，所述第二营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉和尿素。
更优选的，相对于1L的第二营养物质，葡萄糖的含量为400-500g、玉米浆粉的含量为35-40g、尿素的含量为5-10g。
其中，所述第二营养物质可以在第一营养物质补充结束马上补充，也可以间隔一定的时间，但间隔的时间要使得发酵培养基中的糖含量在5-20g/L，优选8-15g/L。
(3)当第二营养物质补充结束后，补充第三营养物质，所述第三营养物质为葡萄糖，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积％，优选为23-27体积％。
优选的，相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为600-700g。
其中，所述第三营养物质可以在第二营养物质补充结束马上补充，也可以间隔一定的时间，但间隔的时间要使得发酵培养基中的糖含量在5-20g/L，优选8-15g/L。
优选的，在第三营养物质补加结束后，继续发酵1-3小时时结束发酵。
根据本发明，所述营养物质的补加可以采用间歇式的补加方式，也可以采用流加的方式，本领域技术人员可以根据实际情况而定。
根据本发明，所述发酵制备PHA的方式可以为连续式发酵，也可以为间歇式发酵。
根据本发明，所述PHA发酵菌种可以为常规的各种能够发酵产PHA的嗜盐发酵菌种，优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)；更优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353(CN201010578858.8)。
根据本发明，所述发酵菌种的接种量可以不受特别的限制，优选的，相对于1L发酵培养基，所述发酵菌种的接种量为5-15体积％；例如，可以为5体积％、7体积％、9体积％、11体积％、13体积％、15体积％。
根据本发明，接种至所述发酵培养基中的发酵菌种优选为活化后的发酵种子液，所述发酵种子液的OD600值优选为3-5。
其中，所述活化的方式可以采用本领域常规的技术手段，例如，将低温保藏菌种接种至种子培养基中进行活化培养。所述种子培养基可以含有5-10g/L的酵母粉、10-15g/L的蛋白胨以及50-60g/L的氯化钠，高温高压灭菌即得。
其中，所述活化培养的条件优选包括：温度为30-40℃，转速为150-250rpm，培养至OD600达到3-5。
其中，所述活化培养优选为多级活化培养，例如，2-3级，从而得到充分活化后的种子液。
根据本发明，所述方法还包括对从发酵得到的发酵液中进行PHA的提取。所述PHA提取的方法可以为本领域常规的方法。例如，参照文献：Chung A,Liu Q,Ouyang S P,etal.Microbial production of 3-hydroxydodecanoic acid by phaoperon and fadBAknockout mutant of Pseudomonas putida KT2442harboring tesB gene[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology,2009,83(3):513-519.。
其中，提取过程中获得的各阶段废水在满足如上指标的情况下可以回用至PHA发酵培养基的配制。当废水指标超过如上指标时，可以对其进行进一步处理，例如，可以经浓缩后用于生物肥料，可以净化处理至满足上述指标后进一步作为至少部分所述发酵培养基的配液水。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353，来自CN201010578858.8；
糖含量根据SBA-90生物传感分析仪方法测定；
发酵液中盐单胞菌生物量的测定方法为取25-45ml发酵液离心(8000rpm，10min)留沉淀，无菌水洗涤2次，使用真空冷冻干燥机对洗涤后的沉淀进行干燥48h后称重；
参照文献：Chung A,Liu Q,Ouyang S P,et al.Microbial production of3-hydroxydodecanoic acid by phaoperon and fadBA knockout mutant of Pseudomonasputida KT2442 harboring tesB gene[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2009,83(3):513-519.从发酵液中进行PHA的提取；
发酵罐体积5L。
制备例1
本制备例用于说明发酵菌种的活化
种子培养基：含有8g/L的酵母粉、12g/L的蛋白胨以及55g/L的氯化钠。
将盐单胞菌接种于种子培养基中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；
将所述一级种子液以10体积％的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液，得到发酵种子液。
制备例2
将PHA发酵液进行固液分离，得到菌体沉淀和发酵清液，其中，发酵清液的固含量在5-10重量％之间。
配液水1：PHA发酵清液经孔径为200nm的陶瓷膜生物反应器过滤，过滤后清液澄清，无明显悬浊和沉淀，粘度<20，COD值<10000mg/L，色度<80，固含量在2-5重量％之间。然后与纯水按照6.5:1混合，得到配液水1；
配液水2：PHA发酵清液经孔径为350nm的陶瓷膜生物反应器过滤，过滤后清液澄清，无明显悬浊和沉淀，粘度<20，COD值<10000mg/L，色度<80，固含量在2-5重量％之间。然后与纯水按照3:1混合，得到配液水2；
配液水3：PHA发酵清液经孔径为500nm的陶瓷膜生物反应器过滤，过滤后清液澄清，无明显悬浊和沉淀，粘度<20，COD值<10000mg/L，色度<80，固含量在2-5重量％之间。然后与纯水按照10:1混合，得到配液水3。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：配液水1用作配液水，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为30g、玉米浆粉的含量为15g、尿素的含量为2g、磷酸氢二钾的含量为3.3g、磷酸氢二钠的含量为7g、硫酸镁的含量为0.2g、氯化钠的含量为55g。调节pH至8.5。
补料一：所述第一营养物质的碳氮比为13：1；所述第一营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和硫酸镁；相对于1L的第一营养物质，葡萄糖的含量为450g、玉米浆粉的含量为46g、尿素的含量为20g、磷酸氢二钾的含量为2.5g、磷酸氢二钠的含量为7.5g、硫酸镁的含量为0.3g；补料一与发酵培养基的用量体积比为10：100。
补料二：所述第二营养物质的碳氮比为39：1；所述第二营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉和尿素；相对于1L的第二营养物质，葡萄糖的含量为450g、玉米浆粉的含量为37.5g、尿素的含量为7.5g；补料二发酵培养基的用量体积比为7：100。
补料三：所述第三营养物质为葡萄糖；相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为650g；补料三与发酵培养基的用量体积比为23:100。
将制备例制得到的种子液以10体积％的接种量接种于发酵培养基中，在37℃以及1.1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.5左右，溶氧量控制在10-30％。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-10h，所述搅拌的转速为500rpm；发酵10-18h，所述搅拌的转速为900rpm；发酵18h至发酵结束，所述搅拌的转速为500rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至6g/L以下时，流加补料一，(2)当补料一完全流加进入发酵罐后，流加补料二，当补料二完全流加进入发酵罐后，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在10g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及水处理成本变化如表1所示。
所得的发酵清液和洗涤水经循环回用于配液水10次，最后得到的发酵清液经浓缩后用于生物肥料。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：配液水2用作配液水，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为20g、玉米浆粉的含量为18g、尿素的含量为1.5g、磷酸氢二钾的含量为3g、磷酸氢二钠的含量为6g、硫酸镁的含量为0.3g、氯化钠的含量为50g。调节pH至8.3。
补料一：所述第一营养物质的碳氮比为14：1；所述第一营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和硫酸镁；相对于1L的第一营养物质，葡萄糖的含量为400g、玉米浆粉的含量为42g、尿素的含量为25g、磷酸氢二钾的含量为3g、磷酸氢二钠的含量为5g、硫酸镁的含量为0.4g；补料与发酵培养基的用量体积比为8：100。
补料二：所述第二营养物质的碳氮比为42：1；所述第二营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉和尿素；相对于1L的第二营养物质，葡萄糖的含量为500g、玉米浆粉的含量为40g、尿素的含量为5g；补料与发酵培养基的用量体积比为10：100。
补料三：所述第三营养物质为葡萄糖；相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为600g；补料三与发酵培养基的用量体积比为25:100。
将制备例制得到的种子液以12体积％的接种量接种于发酵培养基中，在35℃以及1.0vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.3左右，溶氧量控制在10-30％。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-9h，所述搅拌的转速为400rpm；发酵9-17h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵17h至发酵结束，所述搅拌的转速为400rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至5g/L以下时，流加补料一，(2)当补料一全部流加进入发酵罐后，流加补料二，当补料二全部流加进入发酵罐后，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在8g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及水处理成本变化如表1所示。
所得的发酵清液和洗涤水经循环回用于配液水13次，最后得到的发酵清液经浓缩后用于生物肥料。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：配液水3用作配液水，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为15g、玉米浆粉的含量为21g、尿素的含量为2.5g、磷酸氢二钾的含量为3.5g、磷酸氢二钠的含量为7.5g、硫酸镁的含量为0.25g、氯化钠的含量为45g。调节pH至8.7。
补料一：所述第一营养物质的碳氮比为12：1；所述第一营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和硫酸镁；相对于1L的第一营养物质，葡萄糖的含量为500g、玉米浆粉的含量为50g、尿素的含量为15g、磷酸氢二钾的含量为2g、磷酸氢二钠的含量为10g、硫酸镁的含量为0.2g；补料与发酵培养基的用量体积比为12：100。
补料二：所述第二营养物质的碳氮比为41：1；所述第二营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉和尿素；相对于1L的第二营养物质，葡萄糖的含量为400g、玉米浆粉的含量为35g、尿素的含量为10g；补料与发酵培养基的用量体积比为5：100。
补料三：所述第三营养物质为葡萄糖；相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为700g；补料三与发酵培养基的用量体积比为27:100。
将制备例制得到的种子液以15体积％的接种量接种于发酵培养基中，在39℃以及1.2vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.7左右，溶氧量控制在10-30％。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-11h，所述搅拌的转速为600rpm；发酵11-19h，所述搅拌的转速为1000rpm；发酵19h至发酵结束，所述搅拌的转速为600rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至8g/L以下时，流加补料一，(2)当补料一全部流加进入发酵罐后，流加补料二，当补料二全部流加进入发酵罐后，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在15g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及水处理成本变化如表1所示。
所得的发酵清液和洗涤水经循环回用于配液水6次，最后得到的发酵清液经浓缩后用于生物肥料。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：配液水2用作配液水，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为20g、玉米浆粉的含量为14g、尿素的含量为2.5g、磷酸氢二钾的含量为3g、磷酸氢二钠的含量为6g、硫酸镁的含量为0.4g、氯化钠的含量为60g。调节pH至7。
补料一至补料三同实施例1。
将制备例制得到的种子液以10体积％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃以及1.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在7左右，溶氧量控制在10-30％。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速为800rpm左右。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至10g/L以下时，流加补料一，(2)当补料一全部流加进入发酵罐后，流加补料二，当补料一全部流加进入发酵罐后，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在5g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及水处理成本变化如表1所示。
所得的发酵清液和洗涤水经循环回用于配液水11次，最后得到的发酵清液经浓缩后用于生物肥料。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：配液水3用作配液水，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为30g、玉米浆粉的含量为16g、尿素的含量为1.5g、磷酸氢二钾的含量为3.5g、磷酸氢二钠的含量为7.5g、硫酸镁的含量为0.5g、氯化钠的含量为40g。调节pH至9。
补料：同实施例补料一，补料与发酵培养基的用量体积比为40:100。
将制备例制得到的种子液以10体积％的接种量接种于发酵培养基中，在45℃以及0.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在9左右，溶氧量控制在10-30％。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-12h，所述搅拌的转速为400rpm；发酵12-20h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵20h至发酵结束，所述搅拌的转速为400rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至12g/L以下时，仅流加补料一。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在20g/L左右，补料流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及水处理成本变化如表1所示。
所得的发酵清液和洗涤水经循环回用于配液水5次，最后得到的发酵清液经浓缩后用于生物肥料。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照实施例1的方法进行发酵制备PHA，不同的是，发酵清液不经过陶瓷膜过滤。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及水处理成本变化如表1所示。
所得的发酵清液和洗涤水经循环回用于配液水2次，最后得到的发酵清液经浓缩后用于生物肥料。
对比例1
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例2的方法进行PHA的制备，不同的是，将实施例2中的配液水替换为等量的纯水，但培养基中各组分的含量保持一致。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品原料成本变化如表1所示。
表1
编号 生物量(g/L) PHA产量(g/L) 水处理成本变化(％)
实施例1 86.7 70.3 -16
实施例2 88.5 71.1 -18
实施例3 87.1 70.5 -17
实施例4 85.9 69.3 -20
实施例5 85.3 69.5 -9
实施例6 85.6 69.2 -50
对比例1 88.7 70.6 0
通过表1的结果可以看出，将实施例2与对比例1相比，采用本发明技术方案能够有效降低PHA的生产成本，同时对发酵效率没有显著的影响，将实施例1-3与实施例4-6相比可以看出，在本发明的优选方式下，能够进一步提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种发酵制备PHA的方法，其特征在于，该方法包括：在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；
其中，所述发酵培养基的配液水包括PHA发酵工艺废水。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，PHA发酵工艺废水的COD值<10000mg/L，色度<80，粘度<20CPS；
优选的，所述PHA发酵工艺废水为膜过滤的PHA发酵工艺废水；
优选的，所述膜过滤为陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜的孔径为100-600nm；
优选的，所述PHA发酵工艺废水选自发酵清液、洗涤废水和破壁废水。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述发酵培养基以PHA发酵工艺废水添加或不添加纯水作为配液水，所述发酵培养基含有葡萄糖、氮源、磷酸盐、镁盐和钠盐；
优选的，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为10-35g、氮源的含量为15-25g、磷酸盐的含量为5-20g、镁盐的含量为0.1-0.5g、钠盐的含量为40-70g；
优选的，所述氮源为有机氮源和/或无机氮源；优选为玉米浆粉和/或尿素；
优选的，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠；
优选的，所述镁盐为硫酸镁和/或氯化镁；
优选的，所述钠盐为氯化钠。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵培养基以PHA发酵工艺废水添加纯水作为配液水，所述发酵培养基含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为15-30g、玉米浆粉的含量为15-21g、尿素的含量为1.5-2.5g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g；
优选的，PHA发酵工艺废水与纯水的体积比为3-10:1。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为30-45℃，pH值为7-9，溶氧量为1-40％；
优选的，温度为35-39℃，pH值为8.3-8.7，溶氧量为1-30％。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述发酵在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速为400-1000rpm；
优选的，从发酵0h到发酵8-12h，所述搅拌的转速为400-600rpm；
从发酵8-12h到发酵16-20h，所述搅拌的转速为600-1000rpm；
从发酵16-20h到发酵结束，所述搅拌的转速为400-600rpm。
7.根据权利要求1、5或6所述的方法，其中，所述发酵在通风的条件下进行，通风量为0.5-1.5vvm，优选为1-1.2vvm。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括在发酵的过程中补加营养物质，所述营养物质的补加量使得发酵培养基中的糖含量控制在5-20g/L；
优选的，在发酵的过程中，当发酵培养基中的糖含量下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，开始补加所述营养物质；
优选的，所述营养物质含有葡萄糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述营养物质的补加方法包括：
(1)当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积％；
优选的，所述第一营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和硫酸镁；
优选的，相对于1L的第一营养物质，葡萄糖的含量为400-500g、玉米浆粉的含量为42-50g、尿素的含量为15-25g、磷酸氢二钾的含量为2-3g、磷酸氢二钠的含量为5-10g、硫酸镁的含量为0.2-0.4g；
(2)当第一营养物质补充结束后，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1，第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积％；
优选的，所述第二营养物质含有葡萄糖、玉米浆粉和尿素；
优选的，相对于1L的第二营养物质，葡萄糖的含量为400-500g、玉米浆粉的含量为35-40g、尿素的含量为5-10g；
(3)当第二营养物质补充结束后，补充第三营养物质，所述第三营养物质为葡萄糖，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积％；
优选的，相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为600-700g。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)；
优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCCNO.4353；
优选的，相对于1L发酵培养基，所述发酵菌种的接种量为5-15体积％；
优选的，所述发酵菌种的OD600值为3-5；
优选的，所述发酵为连续式发酵或间歇式发酵。
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