CN111349653A

CN111349653A - 一种人α-乳清蛋白基因定点整合转基因奶牛的制备方法

Info

Publication number: CN111349653A
Application number: CN202010451293.0A
Authority: CN
Inventors: 王明; 戴蕴平; 孙照霖; 丁方荣; 王海萍; 李玲
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111349653B

Abstract

本发明公开了一种人α‑乳清蛋白基因定点整合转基因奶牛的制备方法。本发明的发明人利用牛α‑酪蛋白高表达的优点，将人乳清蛋白基因替换到此基因，实现外源基因安全、持续、特异高表达，同时解决牛奶中牛α‑酪蛋白的致敏问题。本发明首次建立了快速、高效的制备人乳清蛋白人源化转基因大动物的方法。利用本发明的细胞系经体细胞克隆方法即可得到精确基因修饰的大动物，将大大提高哺乳动物的育种效率。

Description

一种人α-乳清蛋白基因定点整合转基因奶牛的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人α-乳清蛋白基因定点整合转基因奶牛的制备方法。

背景技术

牛奶含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和矿物质，是一种重要的营养来源，是一种全球消耗的食品。虽然通过传统育种策略、营养管理以及数量遗传学可以提高牛奶的产量，但是，在牛奶的组成成分上还没有明显改变。同时，牛奶与人奶相比并不完美，很多方面存在缺陷，并不适合人类，特别是婴儿。例如，牛奶和人奶的组成有很多区别，主要如下：第一、母乳中乳铁蛋白的含量是牛奶中的10倍；第二、两者的酪蛋白和乳清蛋白比例大不相同，其中母乳中乳清与酪蛋白比例为70:30，然而牛奶中比例仅为20:80，同时母乳中不含有α-酪蛋白，但是牛奶中α-酪蛋白含量高；第三，母乳中不含有乳球蛋白 (BLG)，牛奶中含有。这些区别造成了牛奶的品质远远低于母乳。

乳清蛋白是多种蛋白质组分的统称，主要包含α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和生长因子等。其中α-乳清蛋白(α-La)是乳清蛋白中很重要同时含量也很高的成分，存在于所有哺乳动物乳汁中。α-乳清蛋白是最小的、耐热性最大的乳清蛋白，富含色氨酸和支链氨基酸。天然人的α-乳清蛋白含有123个氨基酸残基，相对分子质量约14200，由α和β两个结构域组成，α结构域包含3个主要的α螺旋和2个短310 螺旋，β结构域包含3个反向平行β折叠和2个短的310螺旋，以及4个二硫键，一个高亲和力的钙离子结合位点(两个位点中一个解离常数Ka=2.7×10^-8，另一个解离常数Ka=3.1×10^-4)，属于金属蛋白。α-乳清蛋白中的半胱氨酸残基是以二硫键的形式存在，无游离的巯基，这与热变性过程中α-乳清蛋白的可逆的构象变化有关。α-乳清蛋白除了具有乳清蛋白中的一些特性以外，还是乳糖合成酶的组分，乳糖合成酶由α-乳清蛋白和β-1,4-半乳糖苷转移酶两种蛋白组成，能使一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖合成乳糖。乳腺中葡萄糖和半乳糖是不受限制的，因此α-乳清蛋白和β-1,4-半乳糖苷转移酶很可能是乳腺合成乳糖的限制性因素。

最受人关注的还是α-乳清蛋白在一定条件下具有抗癌作用，通过巨自噬、内质网应激、蛋白酶体和溶酶体途径杀伤肿瘤细胞。同时α-乳清蛋白由于其富含色氨酸，可促进神经系统发育，并有调节睡眠和食欲的作用。因此，对α-乳清蛋白的需要是非常迫切的。但是由于人奶有限，限制工业生产应用，同时其它物种的α-乳清蛋白含量不高，而且效果不如人奶的，因此寻找新的方法大量制备人α-乳清蛋白显得尤为重要。随着转基因技术的发展，使其对牛奶的品质改良成为了可能，同时利用牛乳腺生物反应器进行外源“目的”蛋白表达成为世界研究热点，给更适合人类健康的“人源化”牛奶或“设计型”牛奶提供了希望。

传统大动物的转基因技术，主要通过原核注射或者核移植技术以随机转基因的方式将外源基因整合到大动物基因组上，这样随机插入容易受到位置效应影响造成外源基因表达沉默或不能持续稳定高表达，同时拷贝数较多影响后期育种扩繁。定点转基因技术的发展有效解决了上述缺陷，但是基于传统的ES细胞基因打靶技术，只能在小鼠ES细胞中实现，大动物由于没有ES细胞，而体细胞基因打靶效率非常低，实现外源目的基因敲入的效率就更低。同时，传统的转基因技术常常引入标记基因，而标记基因的存在往往影响目的基因及其邻近基因表达，重要的是引起生物安全问题，因此乳腺生物反应器的应用必须去除标记基因。伴随着人造核酸酶技术的出现，如ZFN/TALEN/Cas9，给大动物转基因技术领域带来了前所未有的突破，但是很多重要的技术问题，例如通过基因替换的方法制备人源化牛的研究还非常少。

发明内容

本发明的目的是提供一种人α-乳清蛋白基因定点整合转基因奶牛的制备方法。

第一方面，本发明保护基因编辑牛的制备方法，包括如下步骤：将出发牛基因组中牛内源αs1-酪蛋白基因上游同源臂和下游同源臂之间的部分替换为特定片段；所述特定片段含有人乳清蛋白基因；所述上游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第675-2645位所示；所述下游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第10343-12361位所示；所述人乳清蛋白基因如SEQ IDNo.8自5’端第1-2064位所示。

所述特定片段如SEQ ID No.8所示。

第二方面，本发明保护基因编辑牛的制备方法，包括如下步骤（1）和步骤（2）：

（1）供体细胞的制备：将打靶载体、TALENs质粒甲和TALENs质粒乙导入牛成纤维细胞，通过基因编辑得到阳性供体细胞；

（2）将所述阳性供体细胞通过体细胞核移植技术克隆得到基因编辑牛；

所述打靶载体中包括如下元件：牛内源αs1-酪蛋白基因上游同源臂、人乳清蛋白基因和牛内源αs1-酪蛋白基因下游同源臂；所述上游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第675-2645位所示；所述下游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第10343-12361位所示；所述人乳清蛋白基因如SEQ ID No.7自5’端第2646-4709位所示；

所述TALENs质粒甲包括TALENs上游质粒甲和TALENs下游质粒甲；所述TALENs上游质粒甲可以识别SEQ ID No.1所示的区段；所述TALENs下游质粒甲可以识别SEQ ID No.2所示的区段；

所述TALENs质粒乙包括TALENs上游质粒乙和TALENs下游质粒乙；所述TALENs上游质粒乙可以识别SEQ ID No.4所示的区段；所述TALENs下游质粒乙可以识别SEQ ID No.5所示的区段。

所述打靶载体还包括标记基因及自删除元件；所述标记基因及自删除元件包括位于两端的loxP位点和位于loxP位点中间的Oct4 启动子基因、Cre重组酶基因和正筛选标记基因Neo。

所述打靶载体为SEQ ID No.7所示的环状质粒。

所述TALENs上游质粒甲、TALENs下游质粒甲、TALENs上游质粒乙和TALENs下游质粒乙均可由北京唯尚立德公司进行组装。TALENs上游质粒甲和TALENs上游质粒乙原始载体为pCAG-T7-GFP-epeas。TALENs下游质粒甲和TALENs下游质粒乙原始载体为pCAG-T7-mCherry-eperr。

所述步骤（1）中，打靶载体、TALENs上游质粒甲、TALENs下游质粒甲、TALENs上游质粒乙和TALENs下游质粒乙的质量比为1：1：1：1：1。

所述步骤（1）中，所述阳性供体细胞和野生型成纤维细胞的差别在于：将野生型基因组中5’同源臂和3’同源臂对应的序列之间的片段替换为了SEQ ID No.7自5’端第2646-10342位所示的片段。

所述步骤（2）具体是将所述阳性供体细胞注入除去细胞核的牛卵母细胞，发育形成重构胚胎，然后移入母牛子宫，分娩获得基因编辑牛。

所述基因编辑牛与野生型牛的差别在于：将野生型牛基因组中牛内源αs1-酪蛋白基因上游同源臂和下游同源臂之间的部分替换为含有人乳清蛋白基因的片段；所述上游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第675-2645位所示；所述下游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第10343-12361位所示；所述人乳清蛋白基因如SEQ ID No.7自5’端第2646-4709位所示。所述含有人乳清蛋白基因的片段如SEQ ID No.8所示。

第三方面，本发明保护前文任一所述的方法在如下（a1）-（a4）任一种中的应用：

（a1）制备含有人乳清蛋白的牛奶；

（a2）培育可产出含有人乳清蛋白的牛奶的牛；

（a3）制备低敏牛奶；

（a4）培育可产出低敏牛奶的牛。

第四方面，本发明保护对牛成纤维细胞进行基因编辑的方法，包括如下步骤：将前文中任一所述的打靶载体、TALENs质粒甲和TALENs质粒乙导入牛成纤维细胞进行基因编辑。

打靶载体、TALENs上游质粒甲、TALENs下游质粒甲、TALENs上游质粒乙和TALENs下游质粒乙的质量比为1：1：1：1：1。

所述基因编辑阳性细胞和野生型成纤维细胞的差别在于：将野生型基因组中5’同源臂和3’同源臂对应的序列之间的片段替换为了SEQ ID No.7自5’端第2646-10342位所示的片段。

第五方面，本发明保护第四方面所述的方法在如下（a1）-（a4）任一种中的应用：

（a1）制备含有人乳清蛋白的牛奶；

（a2）培育可产出含有人乳清蛋白的牛奶的牛；

（a3）制备低敏牛奶；

（a4）培育可产出低敏牛奶的牛。

第六方面，本发明保护成套载体，包括前文中任一所述的打靶载体、TALENs质粒甲和TALENs质粒乙。

第七方面，本发明保护前文所述的成套载体在如下（a1）-（a4）任一种中的应用：

（a1）制备含有人乳清蛋白的牛奶；

（a2）培育可产出含有人乳清蛋白的牛奶的牛；

（a3）制备低敏牛奶；

（a4）培育可产出低敏牛奶的牛。

以上任一所述人乳清蛋白具体可为SEQ ID No.9所示的蛋白质。

以上任一所述就具体可为奶牛，更具体可为荷斯坦奶牛。

本发明的发明人利用牛α-酪蛋白高表达的优点，将人乳清蛋白基因替换到此基因，实现外源基因安全、持续、特异高表达，同时解决牛奶中牛α-酪蛋白的致敏问题。本发明首次建立了快速、高效的制备人乳清蛋白人源化转基因大动物的方法。利用本发明的细胞系经体细胞克隆方法即可得到精确基因修饰的大动物，将大大提高哺乳动物的育种效率。

附图说明

图1为本发明原理。

图2为TALENs结构示意图以及作用序列。

图3为TALENs切割结果及效率验证。

图4为打靶载体phLA-S重要元件示意图。

图5为阳性克隆细胞测序结果。

图6为阳性克隆牛测序结果。

图7为Western blot验证人源乳清蛋白的表达结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的原理图见图1。针对牛αs1-酪蛋白基因外显子2和外显子18分别设计特异性作用的TALENs，该酶能够特异性的使得目标DNA序列发生双链断裂，从而造成牛内源αs1-酪蛋白基因外显子2到外显子18大片段删除。同时，构建人α-乳清蛋白定点替换牛内源αs1-酪蛋白基因同源打靶载体。将TALENs质粒及同源打靶载体转入到奶牛胎儿成纤维细胞中，以G418药物筛选的方法得到细胞单克隆，通过PCR-测序鉴定获得目的基因定点整合的阳性转基因细胞，再利用体细胞核移植技术将转基因细胞核移植到去核的卵母细胞，构建成转基因胚胎，移植到受孕母体，妊娠分娩后获得目的基因定点整合的转基因克隆牛。

实施例1、牛成纤维细胞的制备

取荷斯坦奶牛的耳部皮肤组织，耳部下缘背侧去毛后以70%（v/v）酒精水溶液清洗干净，再用刀片从耳部下缘背侧剔取面积为1cm²左右的皮肤，置于0℃的DMEM/F12培养基中尽快运回实验室，以PBS缓冲液和70%（v/v）酒精水溶液清洗数遍后剪碎成1mm³左右的小块，DMEM培养基清洗2遍后分批植块于含1mL含10%（v/v）FBS的DMEM培养基培养瓶（规格为25cm²）中，待组织块贴壁牢固后再补加含10%（v/v）FBS的DMEM培养基至6mL，37℃、5%CO₂培养箱培养6-7天，期间每2天换液1次，待细胞生长汇合后，以0.25%胰蛋白酶消化传代2-3次，分批以含20%（v/v）FBS、10%（v/v）DMSO的DMEM培养基冻存。这样，经原代培养、传代培养、冷冻等体外培养操作，建立了荷斯坦奶牛成纤维细胞系。

实施例2、牛a-casein位点特异性TALENs的设计及效率验证

TALENs在哺乳动物细胞中介导基因敲除，主要是通过DNA双链断裂形成小片段的碱基缺失或者碱基插入，而这种小片段的基因修饰可以被T7E1酶切进行检测。其基本原理为：当作用靶点发生双链断裂后，细胞会启动DNA修复机制对其进行修复，从而产生多种类型的碱基缺失或插入突变型。经过PCR扩增目标序列后，由于部分碱基的缺失或插入，不同分子之间经过PCR再次梯度退火会产生DNA鼓泡，而T7E1会特异性识别鼓泡位置并进行切割，从而鉴定TALENs是否能在目的位点介导基因敲除。

一、牛a-casein位点特异性TALENs的设计

针对牛a-casein基因外显子2和外显子18两个区域，分别设计3 对TALENs。

针对牛a-casein基因外显子2区域设计的第1对TALENs（TALENs 1-1）：

left：5’- TGACAACCATGAAACTTC -3’；

right：5’- GGCAAGAGCAACAGCCAC -3’；

17bp-spacer：tcatccttacctgtctt；

针对牛a-casein基因外显子2区域设计的第2对TALENs（TALENs 1-2）：

left：5’- GAAACTTCTCATCCTTAC -3’；

right：5’- CACAGGCCTGGCAAGAGC -3’；

16bp-spacer：ctgtcttgtggctgtt；

针对牛a-casein基因外显子2区域设计的第3对TALENs（TALENs 1-3）：

left：5’- CATCCTTACCTGTCTTGT -3’（SEQ ID No.1）；

right：5’- ACTGTACTCACAGGCCTG -3’（SEQ ID No.2）；

15bp-spacer：ggctgttgctcttgc（SEQ ID No.3）。

针对牛a-casein基因外显子18区域设计的第1对TALENs（TALENs 2-1）：

left：5’- CAAGTGAATTCTGAGGG -3’；

right：5’- TCCAACTTACCAAAGAC -3’；

14bp-spacer：actccacagttatg；

针对牛a-casein基因外显子18区域设计的第2对TALENs（TALENs 2-2）：

left：5’- TCTGAGGGACTCCACAGT -3’；

right：5’- AGACAAGCAGTTTCCAAC -3’；

15bp-spacer：tatggtctttggtaa；

针对牛a-casein基因外显子18区域设计的第3对TALENs（TALENs 2-3）：

left：5’- GAGGGACTCCACAGTTAT -3’（SEQ ID No.4）；

right：5’- GATTAGACAAGCAGTT -3’（SEQ ID No.5）；

18bp-spacer：ggtctttggtaagttgga（SEQ ID No.6）。

TALENs 质粒的组装构建委托北京唯尚立德公司。每对TALENs合成一个上游TALENs质粒（上游TALENs质粒识别left）和一个下游TALENs质粒（下游TALENs质粒识别right）（其中，上游TALENs质粒原始载体为pCAG-T7-GFP-epeas，下游TALENs质粒原始载体为pCAG-T7-mCherry-eperr）。共得到3对针对牛a-casein基因外显子2的TALENs质粒和3对针对牛a-casein基因外显子18的TALENs质粒。

二、牛a-casein位点特异性TALENs效率验证

实验重复两次，每次重复的步骤如下：

1、取8μg步骤一制备得到的6对TALENs质粒（每对质粒将上游质粒和下游质粒按照1:1混合），分别电转化实施例1制备的牛成纤维细胞（1 × 10⁶个细胞），72小时候收集细胞并提取细胞的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA作为模板，对TALENs识别切割区域进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

用于检测外显子2区域PCR扩增引物如下：

TALENs-TF：5’-TGCCTTTCTTTTGATTATATC-3’；

TALENs-TR：5’-CTAGAAAGGGAACATACACAT-3’；

用于检测外显子18区域PCR扩增引物如下：

TALENs-WF：5’-AGAGCAAAATTAAAAACTAAA-3’；

TALENs-WR：5’-AGGACCAAATTATTAGATCTT-3’。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行柱纯化回收，得到PCR产物并测定浓度。

4、取步骤3得到的PCR产物，梯度退火，得到退火产物。

退火程序为：95℃ 10min；95℃-85℃ 1min；85℃-75℃ 1min；75℃-65℃ 1min；65℃-55℃ 1min；55℃-45℃ 1min；45℃-35℃ 1min；35℃-25℃ 1min；4℃保持。

5、取步骤4得到的退火产物，进行T7E1酶切，得到T7E1酶切产物。

酶切程序为：37℃酶切1h。

6、取步骤5得到的T7E1酶切产物，进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（90V，1h），然后用EB对聚丙烯酰胺凝胶进行染色，通过ImageJ软件对酶切条带进行灰度分析，确定TALENs的切割效率。并将条带会收回后进行测序验证。

结果见图3。图3中，NC为野生型牛成纤维细胞的检测结果，百分数表示切割效率。

结果表明，在牛的成纤维细胞中, 针对外显子2的三对TALENs中，TALENs1-1和TALENs1-3 具有较高的切割活性, 经生物学灰度分析软件分析, 其切割效率分别为 18%和20%；针对外显子18的三对TALENs中，TALENs2-2和TALENs2-3具有较高的切割活性, 经生物学灰度分析软件分析, 其切割效率分别为 24%和26%。

由于后期实验中，TALEN的切割效率与外源基因打靶效率有直接关系，因此选择具有较高切割活性的 TALENs1-3、TALENs2-3 用于后续实验。

为了进一步确定 TALENs 介导的双链断裂是在靶区域, 将具有较高切割活性的TALENs1-3、TALENs2-3 PCR 产物回收, 进行T-A 克隆测序, 通过与野生序列比对, 证实TALENs1-3、TALENs2-3在靶位点发生了有效切割（图3）。

最终筛选的TALENs结构示意图以及作用序列见图2。

实施例3、构建人源乳清蛋白基因打靶载体phLA-S

人工合成SEQ ID No.7所示的打靶载体phLA-S。

打靶载体phLA-S重要元件示意图见图4。

SEQ ID No.7中，自5’端第675-2645位为5’同源臂序列（简称5HR），第2646-4709位为人α-乳清蛋白基因，第10343-12361位为3’同源臂序列（简称3HR）。

SEQ ID No.7中，自5’端第4769-10330位组成标记基因及自删除元件；其中，自5’端第4769-4802位和第10297-10330位为loxP位点，第4810-7362位为Oct4 启动子基因，第7363-8626位为Cre重组酶基因，第8689-10215位为正筛选标记基因Neo表达单元。Oct4 转录因子具有早期胚胎发育时期特异表达的特点，利用小鼠Oct4 启动子特异启动 Cre 重组酶的条件诱导转基因为基础，与标记基因Neo连接在一起，同时两端带上loxP位点构建成一个自剪切元件，将这个元件构建到打靶载体中，在细胞筛选过程中，Oct4 启动子不表达，Cre 重组酶不会切割两个 loxP 间的序列，可以进行标记基因的筛选。获得打靶阳性克隆后，进行核移植，克隆重构胚发育过程中小鼠Oct4 启动子启动 Cre 表达，造成整个元件的自剪切。从而实现标记基因等非必须原件的去除。

SEQ ID No.7中，自5’端第12399-13609位为负筛选标记DTA表达单元。负筛选标记基因DTA在靶基因同源区之外，位于载体的3' HR末端，在同源重组时，DTA基因将被切除而丢失，相反在随机整合时所有的序列均保留，因此可以有效排除随机整合细胞。

实施例4、人源乳清蛋白替换牛a-casein蛋白牛的体细胞的制备

1、转染前2d，用胰蛋白酶消化牛成纤维细胞系至单细胞，然后将1×10⁶个牛成纤维细胞转接至培养瓶（规格为100mL），加入4mL含10%（v/v）小牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO₂培养至对数生长期。

2、完成步骤1后，取处于对数生长期的牛成纤维细胞，用胰蛋白酶消化，然后1000g离心5min，收集沉淀。

3、完成步骤2后，取所述沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤1次，然后用100μL电击液重悬，得到细胞悬液。

4、取细胞悬液（含1×10⁵个细胞），加入4μg线性化打靶载体phLA-S和16μg特异性TALENs（TALENs1-3的上下游质粒和TALENs2-3的上下游质粒各4μg）混匀后转入电击杯，进行电击（电场强度为1.2KV/cm，脉冲时间为1ms）。

5、完成步骤4后，将电击后的细胞转入培养瓶（规格为100mL），加入4mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO₂培养1-2d（目的为恢复细胞生长状态）。

6、完成步骤5后细胞进行分盘处理，每个10cm皿中约10000-20000个细胞进行培养，培养体系为含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养液，并加入800μg/mL G418进行抗性筛选。

7、取处理体系，37℃、5%CO₂培养7-14天，得到130个克隆细胞（分别命名为clone1-clone130）。

8、分别提取130个克隆细胞的基因组DNA并以其作为模板，采用引物对甲（由P1：5’-TGCCAGTTAATTCTAGGAGTA-3’和P2：5’-CGAGATTACACCATTGCAC-3’组成）和引物对乙（由P3：5’-CTCCTGCCGAGAAAGTATC-3’和P4：5’-TTGAAGAATCCTTGCATCCCT-3’组成）分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果某个克隆细胞采用引物对甲扩增得到的PCR扩增产物中含有2.7Kb的DNA片段，同时采用引物对乙扩增得到的PCR扩增产物中含有2.9Kb的DNA片段，则该克隆细胞为阳性克隆细胞。

将克隆细胞的基因组DNA替换为牛成纤维细胞的基因组DNA，其它步骤均不变，作为对照（WT）。将克隆细胞的基因组DNA替换为H₂O，其它步骤均不变，作为阴性对照。

部分克隆细胞的PCR扩增结果见图5（M为DNA Marker，WT为牛成纤维细胞的基因组DNA，Z为打靶载体，H₂O为阴性对照，C1-C5为5个克隆细胞）。

各细胞克隆经过鉴定后的统计结果如表1所示。

结果显示在筛选得到的102个克隆点中共54个阳性克隆细胞。挑选细胞状态较好的10/22/23号克隆点用于后续实验。

表1

细胞系	筛选方法	克隆点	阳性细胞克隆点	打靶效率 (%)	核移植供体细胞
						1003	G418	38	21	55.3 (21/38)	#10
1001	G418	64	33	51.6 (33/64)	#22、#23
							总计	102	54	52.9 (54/102)

10/22/23号阳性克隆与野生型牛成纤维细胞的基因组测序比对部分结果见图5。测序结果显示，阳性克隆细胞与野生型细胞的差别在于，将野生型基因组中5’同源臂和3’同源臂对应的序列之间的片段替换为了SEQ ID No.7自5’端第2646-10342位所示的片段（包括人α-乳清蛋白基因、标记基因及自删除元件）。

实施例5、精确修饰人源乳清蛋白替换牛a-casein蛋白牛的制备

一、卵母细胞的制备

从屠宰厂收集荷斯坦奶牛的卵巢，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10%FBS+0.01U/mL bFSH+0.01U/mL bLH+1µg/mL 雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5%CO₂培养箱中成熟培养18-20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1%透明质酸酶的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。

将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10%FBS+7.5µg/mL细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20µm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20%FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用。

二、克隆囊胚的制备

1、取实施例4筛选的阳性克隆细胞，血清饥饿2-4天后用0.25%胰蛋白酶（trypsin）消化2-4min，得到单细胞。

2、将步骤1得到的单细胞移入去核的卵母细胞透明带内，先置于Zimmerman液（100mL Zimmerman液由蔗糖0.9854g、四水合醋酸镁10.7mg、一水合醋酸钙1.8mg、磷酸氢二钾7.4mg、还原型谷胱甘肽3.1mg、牛血清蛋白1.0mg和水组成）中平衡3-5min，再置于融合槽内转动卵细胞使供体细胞与步骤一制备的卵母细胞接触而与电场垂直，同时在场强为2.5kV/cm的直流脉冲场中，在脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合（融合仪为BTX公司的产品，型号为ECM-2001），迅速移入含10%（v/v）FBS的M199液（Gibco公司的产品），37℃、5%CO₂培养30min，得到重构胚。

3、取步骤2得到的重构胚，加入浓度为5μM的钙离子载体A23178的CR1aa培养液（100mL CR1aa培养液由0.67g氯化钠、0.023g氯化钾、0.22g碳酸氢钠、2mg丙酮酸钠、100μl酚红和水组成）处理5min；弃液相，加入含有5μg/mL细胞松驰素B和10μg/mL放线菌酮的CR1aa培养液处理5h（目的为激活重组胚）；弃液相，加入含5%（v/v）FBS的CR1aa培养液，37℃、5%CO₂培养48h，观察卵裂率，7-8天观察囊胚发育率，为20%-60%。

三、精确修饰人源乳清蛋白替换牛a-casein蛋白牛的制备

将形态优良的第7天的克隆囊胚移入同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30天，对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并分别在移植后的第60天和第90天进行直肠检测以确定妊娠率，妊娠率为40%（共移植受体牛100头，怀孕母牛40头）。对妊娠母牛按常规饲养方法进行饲养，经过280天，妊娠母牛正常分娩，得到体细胞克隆牛。

四、精确修饰人源乳清蛋白替换牛a-casein蛋白牛的鉴定

1、采集转基因克隆牛耳部组织样，取基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，利用引物对甲（由P1：5’-TGCCAGTTAATTCTAGGAGTA-3’和P2：5’-CGAGATTACACCATTGCAC-3’组成）与引物对丙（由P5：5’-CCCTACAATTTTCTTGGATAT-3’和P6：5’-ATCTACAGAAAACGTGACTTT-3’组成）分别进行PCR扩增。利用引物对甲扩增得到的大小为2.7Kb的DNA片段，同时利用引物对丙扩增得到大小为2.6Kb的DNA片段的克隆点为阳性克隆。

采用野生牛牛耳部组织样提取的基因组DNA替换转基因克隆牛耳部组织样的基因组DNA，其它步骤均不变，作为对照（WT）。采用H₂O替换转基因克隆牛耳部组织样的基因组DNA，其它步骤均不变，作为阴性对照。采用打靶质粒phLA-S替换转基因克隆牛耳部组织样的基因组DNA，其它步骤均不变，作为对照。

部分鉴定结果见图6（M为DNA Marker，WT为野生牛牛耳部组织样提取的基因组DNA，Z为打靶质粒，H₂O为阴性对照，Cow1和Cow2为转基因克隆牛耳部组织样的基因组DNA）。

结果共筛选得2头阳性转基因克隆牛。

阳性转基因克隆牛与野生型牛基因组测序比对部分结果见图6。

测序结果显示，阳性克隆细胞与野生型细胞的差别在于，将野生型基因组中5’同源臂和3’同源臂对应的序列之间的片段替换为了SEQ ID No.8所示的片段（包括人α-乳清蛋白基因，且不含标记基因和自删除元件）。

实施例6、人源乳清蛋白替换牛a-casein蛋白转基因克隆牛重组蛋白的表达分析

一、Western blot实验验证人源乳清蛋白的表达

对一头实施例5制备的转基因克隆牛进行催乳，以西安草滩药厂生产的催乳针按1/4剂量对8月龄的转基因克隆牛进行药物催乳，同时以同月龄普通黑白花奶牛作为对照进行催乳，每天收集2次奶样，分别取第1天、第7天、第30天的奶样进行Western印迹分析。将奶样离心脱脂后,利用BCA蛋白检测试剂盒测定奶蛋白含量。取30μg奶蛋白，以5μg人源乳清蛋白标准品（sigma）作为阳性对照进行PAGE电泳后转膜，采用HLA单克隆抗体（Abcam）作为一抗、山羊抗体（中杉金桥公司）作为二抗检测人源乳清蛋白。

实验结果见图7。

结果表明，新生人源乳清蛋白替换牛a-casein蛋白牛正常表达人乳清白蛋白。

二、Elisa实验检测人源乳清蛋白的表达

根据 Human Lactalbumin EIA kit (Abcam) 操作说明进行测定 .

1) 按操作说明配制试剂和标准品，适当稀释检测的样品；

2) 将 Wash buffer (空白对照)、标准品、对照（以上试剂均来自试剂盒）和待检测样品（第1天、第7天、第30天）加入到试剂盒提供的 96 孔板中，密封后室温孵育 1 h；

3) 将孔中的液体排净，注意不要交叉污染，Wash buffer 洗涤 3 次，之后加入 100μL乳清蛋白抗血清（试剂盒提供），密封后室温孵育 1 h；

4) 将孔中的液体排净，Wash buffer 洗涤 3 次，之后每孔加入 100μL 抗 IgG 结合物，密封后室温孵育 1 h；

5) 在洗涤 96 孔板之前 10 min 将显色底物（试剂盒提供）等体积混合，备用；将孔中的液体排净， Wash buffer 洗涤 3 次，每孔加入 100 μL显色底物混合液，密封后暗室孵育 15 min；

6) 加入 100 μL终止液（试剂盒提供），在 450 nm 波长下测定吸光值；

7) 根据标准曲线计算出所测样品中人乳清蛋白的含量。

经Elisa实验检测，显示新生转基因克隆牛产的牛奶中表达人乳清蛋白含量约为5克/升。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种人α-乳清蛋白基因定点整合转基因奶牛的制备方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catccttacc tgtcttgt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actgtactca caggcctg 18

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgttgct cttgc 15

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagggactcc acagttat 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gattagacaa gcagtt 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtctttggt aagttgga 18

<210> 7

<211> 16103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660

ccgcggtggc ggccaataat tatattttct ttttgcagga aaaagattag accacatata 720

atgtaactta tttcacaagg taaataatta taataaataa tatggattaa ctgagtttta 780

aaaggtgaaa taaataatga attcttctca tggtcttgta tgttaataaa aattgaaaaa 840

ttttgaagac cccattttgt cccaagaatt tcatttacag gtattgaatt tttcaaaggt 900

tacaaaggaa attttattga tataataaat gcatgttctc ataataacca taaatctagg 960

gttttgttgg ggtttttttt gtttgttaat ttagaacaat gccattccat ttcctgtata 1020

atgagtcact tctttgttgt aaactctcct tagaatttct tgggagagga actgaacaga 1080

acattgattt cctatgtgag agaattctta gaatttaaat aaacctgttg gttaaactga 1140

aaccacaaaa ttagcatttt actaatcagt aggtttaaat agcttggaag caaaagtctg 1200

ccatcacctt gatcatcaac ccagcttgct gcttcttccc agtcttgggt tcaaggtatt 1260

atgtatacat ataacaaaat ttctatgatt ttcctctgtc tcatctttca ttcttcacta 1320

atacgcagtt gtaacttttc tatgtgattg caagtattgg tactttccta tgatatactg 1380

ttagcttaaa aatatatttg caaatgttga tactatctat ctcagagcta taggtgaaaa 1440

attaaatact tttataaaga ccaaattgat catttttaaa cgaaattctt atatactgaa 1500

aatgtagata cataacttca gtatagattt atggtaaaat aatttgaatc atttttgtca 1560

aattctgtaa aaagttgtca tacagaataa tttataatat ttttgttttc atagaaataa 1620

catttctggt agaatatttc aaggccattt ttattttgtg taattaggtt aataaaatta 1680

attttataaa ggaaatgtca atgatagaca attagatata aatgactact tttataaaga 1740

tgattaaatt tggatatttg taaggataca aatatatgaa aacagtagac tcatttgggg 1800

cctataaata tgtctttttt aacaaatgca ggtagattct acagtttgta aactgaagca 1860

gcctatataa aataatctgt cattagtttg ctgactaagg tataaacaaa tttcatgtat 1920

aatctaattt ttcttatgta tctgaaacgc atttttccag cacatataaa tgtatgtatt 1980

tttgggtctt gcaatttaat ggaactctag gagtcaaacg tgatatgttt gacttatgat 2040

tctgtttaat catcttcatt cagtcatgtc atggatatat caacccagca aaattaagta 2100

atagctagat ccttttaaaa atttaatgaa ggttaatagt ttctacataa tgcacaatgt 2160

ttttcatgaa gactctgaaa gagcaggcta aaggataaag acattttaaa aaattacaga 2220

tattaaatgt aatttaccag tgggttttag tttatcaatt ttaacaaatc caatgatcta 2280

agaggaaatt tctttttaat tttttttgta gtattttaaa atttgtaata tttaaatatt 2340

gatgcttctc tattcctctg acaaaaccct actattactt tcaggatcaa atgctttact 2400

ttaaagtgta gtaagatatt ggtatttctt atcttatata agcactaagc aaaataattt 2460

gaatggtaaa tatttatatt gaagagcaaa attaaaaact aaatgaataa aaatattact 2520

ttcaagtgca acaactttta tcataatata ctcctttgtt ggaaaaatta agaatttttt 2580

tttcatgaat caaattttat tataagacct aactatttta ttttcttaca tagatcttga 2640

caaccatgag gttcttcgtc cctttgttcc ttgtgggtat cttgttccca gcaatccttg 2700

ctaagcagtt cacgaaatgc gagctttcac agttgctgaa agacatcgac ggatacggag 2760

gcattgctct gcccgagtga gttccctgcc tctgtgtttc atccattcct catacgcttc 2820

tctcctccat cccctctttc ttccacttcg cccctccact tttacttaat tatctaatca 2880

tcctcttttc tgctcatttg catactcttt tatttcatgt atgtatatat gtatgtattt 2940

atttattttt gaggtggagt ttcgctcttg ttgcccagac tggagtgcaa tggtgtaatc 3000

tcggctcact gcaacctccg cctcctcggt tcaagtgatt ctcctgcctc agcctcccaa 3060

gtagctggaa ttacaggcac ccaccaccat gcctggctaa ttttgtattt tttgtagaga 3120

cagggtttca ccatgttggc caggctggtc tcaaacttct gacctcaggt gatccgccct 3180

cctcagcctc ccaaagtgtt gggattacaa gcgtgagcca tcatgcctgg ccccatttat 3240

tttcctatcc tttctttctc ttattgtctg attttttttt ggaattctcc atctcatcaa 3300

gaaactctga gctttgccat ctttggagat tggctggaaa gcatttttgt ctgagaatta 3360

cagttcctcc tttatgcaga tcctgtacat ctctgtggta tctctttctc atctttccct 3420

cagactgatc tgtactatgt ttcacacaag tgggtatgat acacaggcca tagttgagaa 3480

caacgagtct accgaatacg gcctctttca aatctctaat aagctgtggt gcaagagcag 3540

ccaggtaccg caatcccgga atatctgtga tatctcctgt gacagagtag cccctataac 3600

cctctttctc tgtttttctg aggcctgccc ttgggataat ctccttttta gtgccaagca 3660

gacctcaggc ttcattgcct tggctgggct ctataaaaat tgtgggactt gaattggcag 3720

tactgagtaa gaagctgttt ggatttttca tggtcatcaa atccccagac agttccttga 3780

ggttcagtgg tagacaatcg gagctgtctg agagtcttgg aatctgattg tctgcatttt 3840

cagggtaagt cagttgatga agctgatgat tcctccagag atatcccagg gaaatgaagg 3900

aagtccctac ccagggttag acattaccac attggtcctt tcatatagaa agacaacagg 3960

cacaagcctt gagtttagag aacccactgg atccaggggt taggggaact cagtgccttt 4020

ctgggtaata cttgtcagct gtctcaatcc tttccctgta actcctgcca gcaagtttct 4080

ggacgatgac ataaccgacg acattatgtg cgccaagaag attctggata ttaaggggat 4140

tgattatgtg aatccttatt ctattttcta tttccccatc ctccttctcc ttaccccatt 4200

agcccagcac ccctttcctc ttaccctatc tcttggtcat ttaatctaga atacagtgtc 4260

tgaaacaaag cttacctaga gactcaggtt tctgttatta agcctctctc gctccgctcc 4320

ttggtagcaa ttttcctaat aaggggttgc ctaatggagg gctcagaccc aggcctcctt 4380

tcacttagac ttggacatct aattccactt gtttagttct atgccctaaa gcaagctgtt 4440

ggtaacattg catctctttt ttaaccctac aattttcttg gatatttttt atggactgta 4500

ttccacttga tggcttgtgt cgcttgacat caggccagga atgtctttct gtaattctcg 4560

tccacgctct tccacttcag ccctcctggg aatgaatgta aagattcagt cagctaactc 4620

accttgtccc ccttctccat tatcagtggc tggcgcataa agccctctgc accgagaagc 4680

tcgaacagtg gctgtgcgag aaactctgat aagcggccgc accgggctcg acggtatcga 4740

tatctagatc tcgagctcgc gaaagcttat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt 4800

atggatctct taattaaccc aaaagttagt ctgatgattt tctaagaccc aggaggcaag 4860

aaactggatc agatgagcca acaggtctgc tgtcccatct ccagggccac caggctcaca 4920

gctcgggacc aggctagggc acatctgttt caagctagtt ctaagaagac ttgggacttc 4980

agacaaagtt gctgttaagg actgtattat actctaggca cgcttagggc taacctggtt 5040

gcaaagccag tcactaggca gttaaaggac tcagaatatg tctcttgtcc tggccagtga 5100

gtcaccaaaa gagaaatcac aatccataag acaaggttgg tattgaatac agacaggact 5160

gctgggctgc aggcatactt gaactgtggt ggagagtgct gtctaggcct tagaggctgg 5220

ccctgggagg aactgggtgt ggggaggttg tagcccgacc ctgcccctcc ccccagggag 5280

gttgagagtt ctgggcagac ggcagatgca taacaaaggt gcatgatagc tctgccctgg 5340

gggcagagaa gatggttggg gaggggtccc tctcgtccta gcccttcctt aatctgctat 5400

tgaggaagct ttgtgaactt ggcggcttcc aagtcgctgc ctttatttag gtcttccaac 5460

taacctatgg cactgttcca caatgaatgt atagaaattg ggaggtgagc atgacagagt 5520

ggaggaaacg gaagattcat ggagagggcc agagagatgg cccctcagcc accctggggg 5580

atgacttgga cccatgtggt agaaggaggg gacttccaca catgtgctat gtgtagctgt 5640

gtgtaggtac atacacaccc ttaaaataaa acgcaatttt tttttcaaag tctcagggtg 5700

aatttggtga agtcgatgaa gctgaggcag gagaattatc aggagttcaa gggcagcttg 5760

ttttatagag aaaggttcca tctctacctg atgaagacta ccatcaagag acacccccgc 5820

cccccagggc acctagagcc actgacccta gccaacagct caggcgggct gggcccaggc 5880

tcagaactct gtcctggcta tgtacactgt ggggtgctct gggctttttg aggctgtgtg 5940

attcaccctg gggccttcgt tcagagcatg gtgtaggagc agacagacaa acaccatccc 6000

ttgcagacag gcactctgag ggctattctc ttgcaaagat aactaagcac caggccagta 6060

atgggatcct cagactgggc ccagaaaacc actctaggga agttcagggt aggctctctg 6120

caccccctcc tcctaatccc gtctccttag tgtctttccg ccagcacagg aatgggggag 6180

gggtgggtga cgaggatgaa caccggagtc cctggaggaa gggaagcagg gtatctccat 6240

ctgaggctct gtctttgagg agaggtggag agctggggaa gtcttgtgtg aggggattgg 6300

ggctcaggag ggggttgggg agcaggaagt tgtccccagg ggagccatcc tggcccattc 6360

aagggttgag tacttgttta gggttagagc tgccccctct ggggaccagg attgtccagc 6420

caaggccatt gtcctgcccc cttcccccag tccctcccag gcccctttga acctgaagtc 6480

agatatttct tctctctacc cacctcccac ccgttgggtt tctccaccca ggaactaggc 6540

tggaagcctg ggatgaggag gtggggggag ggagaactga gaatcttgag gaaagaggcc 6600

ccggccttaa ctgtgagggg atggagcctg ggtgcaggtc ttatgggggt tggggggtgg 6660

ttagtgtcta atctaccaac ctggacaaca caagatggaa tactgtgctc tgaaaacgca 6720

gagccagcac ttctctgggg tctctgggga catatctggt tggggctcgg ggtcccatgg 6780

tgtagagcct ctaaactctg gaggactgga ggtgcaatgg ctgtcttgtc ctggccttgg 6840

acatgggctg aaatactggg ttcacccata tctaggactc tagacgggtg ggtaagcaag 6900

aactgaggag tggccccaga aataattggc acacgaacat tcaatggatg ttttaggctc 6960

tccagaggat ggctgagtgg gctgtaagga caggccgaga gggtgcagtg ccaacaggct 7020

ttgtggtgcg atggggcatc cgagcaactg gtttgtgagg tgtccggtga cccaaggcag 7080

gggtgagagg accttgaagg ttgaaaatga aggcctcctg gggtcccgtc ctaagggttg 7140

tcctgtccag acgtccccaa cctccgtctg gaagacacag gcagatagcg ctcgcctcag 7200

tttctcccac ccccacagct ctgctcctcc acccacccag ggggcggggc cagaggtcaa 7260

ggctagaggg tgggattggg gagggagagg tgaaaccgtc cctaggtgag ccgtctttcc 7320

accaggcccc cggctcgggg tgcccacctt ccccggccgg ccatgcccaa gaagaagagg 7380

aaggtgtcca atttactgac cgtacaccaa aatttgcctg cattaccggt ccgatgcaac 7440

gagtgatgag gttcgcaaga acctgatgga catgttcagg gatcgccagg cgttttctga 7500

gcatacctgg aaaatgcttc tgtccgtttg ccggtcgtgg gcggcatggt gcaagttgaa 7560

taaccggaaa tggtttcccg cagaacctga agatgttcgc gattatcttc tatatcttca 7620

ggcgcgcggt ctggcagtaa aaactatcca gcaacatttg ggccagctaa acatgcttca 7680

tcgtcggtcc gggctgccac gaccaagtga cagcaatgct gtttcactgg ttatgcggcg 7740

gatccgaaaa gaaaacgttg atgccggtga acgtgcaaaa caggctctag cgttcgaacg 7800

cactgatttc gaccaggttc gttcactcat ggaaaatagc gatcgctgcc aggatatacg 7860

taatctggca tttctgggga ttgcttataa caccctgtta cgtatagccg aaattgccag 7920

gatcagggtt aaagatatct cacgtactga cggtgggaga atgttaatcc atattggcag 7980

aacgaaaacg ctggttagca ccgcaggtgt agagaaggca cttagcctgg gggtaactaa 8040

actggtcgag cgatggattt ccgtctctgg tgtagctgat gatccgaata actacctgtt 8100

ttgccgggtc agaaaaaatg gtgttgccgc gccatctgcc accagccagc tatcaactcg 8160

cgccctggaa gggatttttg aagcaactca tcgattgatt tacggcgcta aggtaaatat 8220

aaaattttta agtgtataat gtgttaaact actgattcta attgtttgtg tattttagga 8280

tgactctggt cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg 8340

agatatggcc cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa 8400

tgtaaatatt gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg 8460

cctgctggaa gatggcgatt agccattaac gcgtaaatga ttgctataat tatttgatat 8520

ttatggtgac atatgagaaa ggatttcaac atcgacggaa aatatgtagt gctgtctgta 8580

agcactaata ttcagtcgcc agccgtcatt gtcactgtaa agctgagggc aataaaaaga 8640

cagaataaaa cgcacgggtg ttgggtcgtt tgttctcgag ctcgcgaaag cttgggcttg 8700

aacatcgagc gccagggctc cgtaaagcta ctagagcaca ggcggtgccc caacgtcctg 8760

gggcctctcc actaataacg gctacttcca attgattgga cgcgccatct tgcctgcctt 8820

atgcatattc agcggtgaac tgaatattca tgaacgaggc ccgtcccgtc cctccctcct 8880

tccccccacc cccggaaccc gctccggagg acccgaaggg ccccgccttc attaccgatg 8940

cgtaggacaa accattttcc cgatgtgtgt ggggggatac taatgagaga ctttagctga 9000

aaaatgagcc tgaactccga agctgagtaa aaatggccta actttatcct ccgttctgta 9060

agtcctcggt ttgagtgcac gggaaacccg aaaggaggac gacaggacca ggacattctc 9120

ctcctcctgt cgcgtcagaa agaacaccca accagggagc cggagcccta gcgtcaacaa 9180

ctccgccgcg cgcgctccgt gtaggccggt gcgggcggcc ccgtagcgca agggagggcg 9240

ggaaaggaag gggcgggaca caagggcgaa tctataaagg gcgtcactca gccagttctc 9300

tcctcagaag cgccgagagc gcgaccggga cggttggaga agaaggtggc tcccggaagg 9360

gggagagaca aactgccgta acctctgccg ttcaggatcc gtgcagccaa tatgggatcg 9420

gccattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 9480

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 9540

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 9600

caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 9660

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 9720

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 9780

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 9840

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 9900

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 9960

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 10020

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 10080

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 10140

ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 10200

gacgagttct tctgagggga tcggcaataa aaagacagaa taaaacgcac gggtgttggg 10260

tcgtttgttc ggatcgatcc gtcgatcgac agatccataa cttcgtatag catacattat 10320

acgaagttat gaattcgcta gcgtaagttg gaaactgctt gtctaatcat tgatcctctt 10380

ttcatatgag agctcagtac aaaagtacaa cgtgtagact ataaagttgt tttgctggtc 10440

ctctagtcta gctatattta aacacattac acttagataa tatcaataat taaattggct 10500

tcaacatttt ttgtattata gtaatatcaa atttaagtag caataaaact agctaatttt 10560

aattaatata atttattata ttgaaatttt tatacaagta taggagtgtg ggtgttacta 10620

attctggtga ccccaacagt ggaatcctat tctttatgat cactgaaata gaaatactta 10680

atacgtcaca tagttaaatc aagtgtttgt ctattaagaa gaaaacagat ttaaatgtcc 10740

atagatgtgt tttgagtact tcaatttact atataggagc ttgtagttgt gtgtgtatgt 10800

gtatgttccc tttctagtgg tggaaacttc ccttataaca gatcaaaaga tggaaaataa 10860

aagtctgacg tacttggaag tttttacttt gaattatttt gccatatttt ctgttactgc 10920

aaaagaaagt gcaacctagt cataaattgc ctgtaaaact taaaaatcag gagcagtggg 10980

tatgtgttag taacaggaga cacatataac tttgtgaact tcatcttaag atgaagagaa 11040

aatgactatt aaagtgtatc ttatcataac agtaccttct cccttcaaaa catgcagcat 11100

aactaaccac atatttcttt tttggtttac agatggttct gaaaattcca tgctctacat 11160

gtcttttcat ctatcatgtc aaaccattct atccaaaggc ttcaactgct gttttagaat 11220

agggcaatct caaattgaag gcactctttc ttcttgagtt ctctactgta ttttagatag 11280

tgtaacatcc ttaagtgaaa ttgtcctaac agcttgttac ctaaattcca gtagtatcat 11340

gctggtataa aggccactga gtcaaaggga attaaagtct tcattaaatt tctgtatgga 11400

aaatgtttta aaagcctttg aatcacttct cctgtaagtg ccatcatatc aaataattgt 11460

gtgcattaac tgagattttg tctttcttct tttcaataaa ttacatttta aggcactatt 11520

cctatttttt gtcattattc cattggaagg aatttacaca accttgtgag tttgtgtgta 11580

tataacattt tgttttcact aaatttttat gacattttca accacatttt aatgaaaaaa 11640

ttcaaatgtt cacttctagc tgatcctggt agattataaa ctgagtctaa gatctttcat 11700

ttgaagtcaa ctgtttatag aatattttcc atgtgaacat ggacgtggct gcagagagaa 11760

cagcagtgta gtagttgtgg gtgcactggc aatttgaaca acctggttat actgtttaat 11820

ttggcaggac ttgttggagc tcaatccatt tgattatact tgagtttata actaggtaga 11880

ttacaaagta aagattgtaa aggttaacac aggacacaca gtaacagagc attcatagtg 11940

agctgttcag tgtcctccaa aactctaatg agtaattact tctcaaaatg acaacagctg 12000

cttactctga tatctttaaa gccccaggtg aaatttattt tcccggcttt attctaggat 12060

tcccaaccaa cccaatctgt catgactctt taagaacctt gtatgaccca ggtcacaaaa 12120

cacaggtaat aaggtctctt gtacaacagt ttagaccatc tatatcagtt gttctgttta 12180

ctgattatgt agatatgtat acataacatt gaaacatgta atttttgcct tgaaaatttt 12240

tttttaaaaa tccacttagt attaggtctt ctgcctcctc tatgttaagt acaaggtaca 12300

acaacttgtt attcaatcta gagaaggttt gtcaacatac tcagaatact ggacctggca 12360

ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 12420

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 12480

cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg 12540

tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca 12600

gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat 12660

ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct 12720

ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag 12780

gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac 12840

gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac 12900

ctgcaggtcc tcgccatgga tcctgatgat gttgttgatt cttctaaatc ttttgtgatg 12960

gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat tcaaaaaggt 13020

atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa agggttttat 13080

agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa cccgctctct 13140

ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt tctcgcacta 13200

aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac tgaaccgttg 13260

atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc ttcgcgtgta 13320

gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa taactgggaa 13380

caggcgaaag cgttaagcaa tcgtgtcagg cgatctcttt gtgaaggaac cttacttctg 13440

tggtgtgaca taattggaca aactacctac agagatttaa agctctaagg taaatataaa 13500

atttttaagt gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttagattcc 13560

aacctatgga actgatgaat gggagcagtg gtggaatgca gatcctagag ctcgctgatc 13620

agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 13680

cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 13740

gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg 13800

ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga 13860

ggcggaaaga accagctggg gctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccttta 13920

gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 13980

ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 14040

tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 14100

gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 14160

gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 14220

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 14280

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 14340

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 14400

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 14460

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 14520

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 14580

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 14640

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 14700

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 14760

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 14820

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 14880

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 14940

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 15000

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 15060

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 15120

atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 15180

ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 15240

tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 15300

agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 15360

taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 15420

tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 15480

cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 15540

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 15600

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 15660

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 15720

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 15780

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 15840

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 15900

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 15960

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 16020

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 16080

cacatttccc cgaaaagtgc cac 16103

<210> 8

<211> 2169

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaggttct tcgtcccttt gttccttgtg ggtatcttgt tcccagcaat ccttgctaag 60

cagttcacga aatgcgagct ttcacagttg ctgaaagaca tcgacggata cggaggcatt 120

gctctgcccg agtgagttcc ctgcctctgt gtttcatcca ttcctcatac gcttctctcc 180

tccatcccct ctttcttcca cttcgcccct ccacttttac ttaattatct aatcatcctc 240

ttttctgctc atttgcatac tcttttattt catgtatgta tatatgtatg tatttattta 300

tttttgaggt ggagtttcgc tcttgttgcc cagactggag tgcaatggtg taatctcggc 360

tcactgcaac ctccgcctcc tcggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccaagtagc 420

tggaattaca ggcacccacc accatgcctg gctaattttg tattttttgt agagacaggg 480

tttcaccatg ttggccaggc tggtctcaaa cttctgacct caggtgatcc gccctcctca 540

gcctcccaaa gtgttgggat tacaagcgtg agccatcatg cctggcccca tttattttcc 600

tatcctttct ttctcttatt gtctgatttt tttttggaat tctccatctc atcaagaaac 660

tctgagcttt gccatctttg gagattggct ggaaagcatt tttgtctgag aattacagtt 720

cctcctttat gcagatcctg tacatctctg tggtatctct ttctcatctt tccctcagac 780

tgatctgtac tatgtttcac acaagtgggt atgatacaca ggccatagtt gagaacaacg 840

agtctaccga atacggcctc tttcaaatct ctaataagct gtggtgcaag agcagccagg 900

taccgcaatc ccggaatatc tgtgatatct cctgtgacag agtagcccct ataaccctct 960

ttctctgttt ttctgaggcc tgcccttggg ataatctcct ttttagtgcc aagcagacct 1020

caggcttcat tgccttggct gggctctata aaaattgtgg gacttgaatt ggcagtactg 1080

agtaagaagc tgtttggatt tttcatggtc atcaaatccc cagacagttc cttgaggttc 1140

agtggtagac aatcggagct gtctgagagt cttggaatct gattgtctgc attttcaggg 1200

taagtcagtt gatgaagctg atgattcctc cagagatatc ccagggaaat gaaggaagtc 1260

cctacccagg gttagacatt accacattgg tcctttcata tagaaagaca acaggcacaa 1320

gccttgagtt tagagaaccc actggatcca ggggttaggg gaactcagtg cctttctggg 1380

taatacttgt cagctgtctc aatcctttcc ctgtaactcc tgccagcaag tttctggacg 1440

atgacataac cgacgacatt atgtgcgcca agaagattct ggatattaag gggattgatt 1500

atgtgaatcc ttattctatt ttctatttcc ccatcctcct tctccttacc ccattagccc 1560

agcacccctt tcctcttacc ctatctcttg gtcatttaat ctagaataca gtgtctgaaa 1620

caaagcttac ctagagactc aggtttctgt tattaagcct ctctcgctcc gctccttggt 1680

agcaattttc ctaataaggg gttgcctaat ggagggctca gacccaggcc tcctttcact 1740

tagacttgga catctaattc cacttgttta gttctatgcc ctaaagcaag ctgttggtaa 1800

cattgcatct cttttttaac cctacaattt tcttggatat tttttatgga ctgtattcca 1860

cttgatggct tgtgtcgctt gacatcaggc caggaatgtc tttctgtaat tctcgtccac 1920

gctcttccac ttcagccctc ctgggaatga atgtaaagat tcagtcagct aactcacctt 1980

gtcccccttc tccattatca gtggctggcg cataaagccc tctgcaccga gaagctcgaa 2040

cagtggctgt gcgagaaact ctgataagcg gccgcaccgg gctcgacggt atcgatatct 2100

agatctcgag ctcgcgaaag cttataactt cgtatagcat acattatacg aagttatgaa 2160

ttcgctagc 2169

<210> 9

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Arg Phe Phe Val Pro Leu Phe Leu Val Gly Ile Leu Phe Pro Ala

1 5 10 15

Ile Leu Ala Lys Gln Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys

20 25 30

Asp Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Pro Glu Leu Ile Cys Thr

35 40 45

Met Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn

50 55 60

Glu Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Leu Trp Cys

65 70 75 80

Lys Ser Ser Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys

85 90 95

Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Ile Thr Asp Asp Ile Met Cys Ala Lys

100 105 110

Lys Ile Leu Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Val Leu Ala His Lys Ala

115 120 125

Leu Cys Thr Glu Lys Leu Glu Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu

130 135 140

Claims

1.基因编辑牛的制备方法，包括如下步骤：将出发牛基因组中牛内源αs1-酪蛋白基因上游同源臂和下游同源臂之间的部分替换为特定片段；所述特定片段含有人乳清蛋白基因；所述上游同源臂如SEQ ID No.7自5’端第675-2645位所示；所述下游同源臂如SEQ IDNo.7自5’端第10343-12361所示；所述人乳清蛋白基因如SEQ ID No.8自5’端第1-2064位所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特定片段如SEQ ID No.8所示。

3.基因编辑牛的制备方法，包括如下步骤（1）和步骤（2）：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述打靶载体还包括标记基因及自删除元件；所述标记基因及自删除元件包括位于两端的loxP位点和位于loxP位点中间的Oct4 启动子基因、Cre重组酶基因和正筛选标记基因Neo。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述打靶载体为SEQ ID No.7所示的环状质粒。

6.权利要求1至5任一所述的方法在如下（a1）-（a4）任一种中的应用：

（a1）制备含有人乳清蛋白的牛奶；

（a2）培育可产出含有人乳清蛋白的牛奶的牛；

（a3）制备低敏牛奶；

（a4）培育可产出低敏牛奶的牛。

7.对牛成纤维细胞进行基因编辑的方法，包括如下步骤：将权利要求3至5中任一所述的打靶载体、TALENs质粒甲和TALENs质粒乙导入牛成纤维细胞进行基因编辑。

8.权利要求7所述的方法在如下（a1）-（a4）任一种中的应用：

（a1）制备含有人乳清蛋白的牛奶；

（a2）培育可产出含有人乳清蛋白的牛奶的牛；

（a3）制备低敏牛奶；

（a4）培育可产出低敏牛奶的牛。

9.成套载体，包括权利要求3至5中任一所述的打靶载体、TALENs质粒甲和TALENs质粒乙。

10.权利要求9所述的成套载体在如下（a1）-（a4）任一种中的应用：

（a1）制备含有人乳清蛋白的牛奶；

（a2）培育可产出含有人乳清蛋白的牛奶的牛；

（a3）制备低敏牛奶；

（a4）培育可产出低敏牛奶的牛。