CN111349151A - 一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用 - Google Patents

一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用，采用戊二醛将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽共价偶联，形成重组磷酸化蛋白。本发明采用所述偶联方法制备重组pTau‑181、pTau‑231、pTau‑396磷酸化蛋白，并以此为磷酸化蛋白作为标准品定量检测样本中该磷酸化蛋白的含量。本发明提供的重组pTau‑181、pTau‑231、pTau‑396磷酸化蛋白，能够用于血液及脑脊液中pTau‑181、pTau‑231、pTau‑396磷酸化蛋白含量的检测，特异性强、灵敏度高，可用于阿尔茨海默症患者的辅助诊断、疗效评估及病程监控。

Description

一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用。
背景技术
Tau蛋白是神经元细胞中众多微管相关蛋白（MAPs）之一，是一种低分子量含磷糖蛋白，它可以与神经轴突内的微管结合，并且具有诱导与促进微管蛋白聚合成微管、防止微管解聚和维持微管功能的稳定的作用。当Tau蛋白发生高度磷酸化、异常糖基化、异常糖化以及泛素蛋白化时，Tau蛋白失去对微管的稳定作用，导致神经纤维退化，从而引起神经功能失调。AD早期神经元纤维缠结（NFT）病理改变较轻，以Tau蛋白糖基化为主，而p-Tau蛋白含量较低，随着AD加重，以Tau蛋白的过度磷酸化为主，且由于血脑屏障被破坏，因此，AD患者血清中Tau磷酸化蛋白的含量会显著升高。
目前磷酸化蛋白含量的检测主要通过质谱方法，其原因是现有的技术手段因缺少校准品即我们常说的抗原而不能满足我们采用免疫学方法进行定量检测蛋白磷酸化水平，常规合成的磷酸化多肽只有一个结合位点，无法满足我们对于两个结合位点蛋白的合成，本发明将磷酸化多肽和截短蛋白通过特定的偶联物进行偶联，最终实现了磷酸化蛋白的定量检测。
传统蛋白偶联方法由蛋白或多肽上的活性基团决定，一般分为以下四种：1、分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联，则采用混合酸酐法、碳化二亚胺法、N-羟琥珀酰亚胺酯法；2、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联，则采用戊二醛法、重氮化法；3、含羟基半抗原的偶联，则采用琥珀酸酐法、羟基二咪唑法；4、含巯基半抗原的偶联，则采用马来酰亚胺法或过氧化氢法进行偶联。不论哪种偶联方法，都存在缺陷，如操作复杂、偶联物不均一、蛋白需求量高等。
磷酸化蛋白是生物体内一类重要的蛋白，在各项生命活动中占有极其重要的地位。如何获得纯度较高的磷酸化蛋白标准品或者获得针对该磷酸化蛋白的抗体，是检测磷酸化蛋白的关键环节。因此，亟需一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用，可以制备出纯度较高的特定位点磷酸化蛋白，既消除了蛋白直接磷酸化的随机性，也提高了蛋白-磷酸化多肽偶联物的含量，能够用于磷酸化蛋白的定量检测及单克隆抗体的制备。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明的第一目的提供一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，包括以下步骤：
S1、将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀，编码Tau截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， Tau截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽、231磷酸化多肽或396磷酸化多肽；
S2、在上述混合液中，加入戊二醛进行偶联反应；
S3、偶联反应结束后，将上述反应液放入磷酸盐缓冲液中透析，再换用Tris-Hcl缓冲液透析，然后获得蛋白-磷酸化多肽偶联物，即形成重组磷酸化蛋白；
S4、对上述偶联物进行浓度测定，最终用Tris-Hcl缓冲液进行保存。
作为优选，所述步骤S1中Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽的摩尔比为1︰5~10，所述步骤S2中选用20μl 2.5%戊二醛，所述步骤S1和步骤S3中选用0.01M pH=7.2的磷酸盐缓冲液，所述步骤S3中选用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液，所述步骤S4中选用含1%BSATris-Hcl缓冲液。
作为优选，在将Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀之前还包括制备Tau截短蛋白，具体包括以下步骤：将Tau截短蛋白的核苷酸序列连接至表达载体，并装入表达菌株中；在培养基中过夜诱导Tau截短重组蛋白可溶性表达并纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。
作为优选，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽，多肽序列如下所示：AKTPPAPKT（p）PPSSGEPPK，其序列如SEQ ID NO:2所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-181磷酸化蛋白，用于作为pTau-181磷酸化蛋白检测标品。
作为优选，所述Tau磷酸化多肽为231磷酸化多肽，多肽序列如下所示：PKKVAVVRT(p)PPKSPSSAK，其序列如SEQ ID NO:3所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-231磷酸化蛋白，用于作为pTau-231磷酸化蛋白检测标品。
作为优选，所述Tau磷酸化多肽为396磷酸化多肽，多肽序列如下所示：HGAEIVYKS(p)PVVSGDTSP，其序列如SEQ ID NO:4所示，其中丝氨酸S位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-396磷酸化蛋白，用于作为pTau-396磷酸化蛋白检测标品。
本发明的第二目的提供一种采用重组pTau-181、pTau-231或pTau-231磷酸化蛋白在构建制备检测体系中的应用，所述检测体系构建包括以下步骤：
Q1、首先在固相载体上包被捕获抗体，浓度为5μg/mL；
Q2、将重组pTau-181、pTau-231或pTau-396磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释，再加入碱性磷酸酶标记的抗体，浓度50ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min；
Q3、用PBST清洗，化学发光底物加入后，检测发光值；
Q4、绘制校准曲线。
本发明的第三目的提供一种含有重组pTau-181、pTau-231或pTau-396磷酸化蛋白的试剂盒，所述试剂盒中还包含有固相载体如磁微粒、碱性磷酸酶标记的检测抗体、发光底物。
本发明的有益效果是：本发明采用戊二醛将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽共价偶联，形成重组磷酸化蛋白。并采用所述偶联方法制备重组pTau-181、pTau-231、pTau-396磷酸化蛋白，作为磷酸化蛋白检测标品。本发明提供的重组pTau-181、pTau-231、pTau-396磷酸化蛋白，能够用于血液及脑脊液中pTau-181、pTau-231、pTau-396磷酸化蛋白含量的检测，特异性强、灵敏度高，可用于阿尔茨海默症患者的辅助诊断、疗效评估及病程监控。
附图说明
图1是本发明中截短蛋白的SDS-PAGE电泳结果示意图。
图2是本发明中采用重组pTau-181磷酸化蛋白制备的pTau-181标准曲线。
图3是本发明实施例四中脑脊液检测结果的ROC曲线统计示意图。
图4是本发明实施例四中血清检测结果的ROC曲线统计示意图。
图5是本发明中采用重组pTau-231磷酸化蛋白制备的pTau-231标准曲线。
图6是本发明实施例五中脑脊液检测结果的ROC曲线统计示意图。
图7是本发明实施例五中血清检测结果的ROC曲线统计示意图。
图8是本发明中采用重组pTau-396磷酸化蛋白制备的pTau-396标准曲线。
图9是本发明实施例六中脑脊液检测结果的ROC曲线统计示意图。
图10是本发明实施例六中血清检测结果的ROC曲线统计示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
首先，制备Tau截短蛋白：Tau截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将Tau截短蛋白的核苷酸序列连接至表达载体pET28a，并装入表达菌株BL21(DE3)中。在LB培养基中，IPTG 1mmol/L 37度条件下过夜诱导Tau截短重组蛋白可溶性表达。重组表达蛋白经6×His标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，大小约23KD，纯度均在90%以上，如图1所示。
实施例一：重组pTau-181磷酸化蛋白制备。
181磷酸化多肽合成：从杭州中肽生物公司订购181磷酸化多肽，多肽序列：AKTPPAPKT（p）PPSSGEPPK，其序列如SEQ ID NO:2所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团，质谱检测纯度到95%以上。
重组pTau-181磷酸化蛋白制备：将一定量的Tau截短蛋白和181磷酸化多肽溶解到100μl 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl 2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1L 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。对偶联物进行浓度测定，最终用含1%BSA Tris-Hcl缓冲液进行保存。
实施例二：重组pTau-231磷酸化蛋白制备。
231磷酸化多肽合成：从杭州中肽生物公司订购231磷酸化多肽，多肽序列：PKKVAVVRT(p)PPKSPSSAK，其序列如SEQ ID NO:3所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团，经质谱检测纯度到95%以上。
重组pTau-231磷酸化蛋白制备：将一定量的Tau截短蛋白和231磷酸化多肽溶解到100μl 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl 2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1L 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。对偶联物进行浓度测定，最终用含1%BSA Tris-Hcl缓冲液进行保存。
实施例三：重组pTau-396磷酸化蛋白制备。
396磷酸化多肽合成：从杭州中肽生物公司订购396磷酸化多肽，多肽序列：HGAEIVYKS(p)PVVSGDTSP，其序列如SEQ ID NO:4所示，其中丝氨酸S位点添加有磷酸基团，经质检检测，纯度到95%以上。
重组pTau-396磷酸化蛋白制备：将一定量的Tau截短蛋白和396磷酸化多肽溶解到100μl 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2），保证蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl 2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1L磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05M pH=8.0Tris-Hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。对偶联物进行浓度测定，最终用含1%BSA Tris-Hcl缓冲液进行保存。
实施例四：pTau-181磷酸化蛋白的检测体系构建。
校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3B6，浓度为5μg/mL，将重组pTau-181磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释为0pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL、160pg/mL，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的2A7抗体，浓度100ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的pTau-181磷酸化蛋白含量。校准曲线线性范围 0～160pg/mL，图2为采用重组pTau-181磷酸化蛋白制备的pTau-181标准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表重组pTau-181磷酸化蛋白的浓度。
采用重组pTau-181磷酸化蛋白制备的检测试剂用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非AD患者脑脊液和血清。使用采用重组pTau-181磷酸化蛋白制备的检测试剂检测阿尔兹海默症、非AD患者脑脊液中pTau-181浓度，ROC曲线统计结果显示（图3），曲线下面积为0.94，以45pg/mL作为检测参考值，采用重组pTau-181磷酸化蛋白制备的检测试剂的特异性为 93.33％（28/30），灵敏度为86.67％（26/30）。检测阿尔兹海默症、非AD患者血清中pTau-181浓度，ROC曲线统计结果显示（图4），曲线下面积为0.89，以35pg/mL作为检测参考值，采用重组pTau-181磷酸化蛋白制备的检测试剂的特异性为 86.67％（26/30），灵敏度为83.33％（25/30）。
实施例五： pTau-231磷酸化蛋白的检测体系构建。
校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3B6，浓度为5μg/mL，将重组pTau-231磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释为0pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的3G8抗体，浓度50ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的pTau-231磷酸化蛋白含量。校准曲线线性范围 0～200pg/mL，图5为采用重组pTau-231磷酸化蛋白制备的pTau-231标准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表重组pTau-231磷酸化蛋白的浓度。
采用重组pTau-231磷酸化蛋白制备的检测试剂用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非AD患者脑脊液和血清。使用采用重组pTau-231磷酸化蛋白制备的检测试剂检测阿尔兹海默症、非AD患者脑脊液中pTau-231磷酸化蛋白浓度，ROC曲线统计结果显示（图6），曲线下面积为0.91，以51pg/mL作为检测参考值，采用重组pTau-231磷酸化蛋白制备的检测试剂的特异性为 96.67％（29/30），灵敏度为90％（27/30）。检测阿尔兹海默症、非AD患者血清中pTau-231浓度，ROC曲线统计结果显示（图7），曲线下面积为0.85，以42pg/mL作为检测参考值，采用重组pTau-231磷酸化蛋白制备的检测试剂的特异性为 90％（27/30），灵敏度为80％（24/30）。
实施例六： pTau-396磷酸化蛋白的检测体系构建。
校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3B6，浓度为5μg/mL，将重组pTau-396磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释为0pg/mL、15pg/mL、30pg/mL、60pg/mL、120pg/mL、240pg/mL，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的1F4抗体，浓度400ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的pTau-396磷酸化蛋白含量。校准曲线线性范围 0～240pg/mL，图8为采用重组pTau-396制备的pTau-396标准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表重组pTau-396磷酸化蛋白的浓度。
采用重组pTau-396磷酸化蛋白制备的检测试剂用于阿尔兹海默症诊断：检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非AD患者脑脊液和血清。使用采用重组pTau-396磷酸化蛋白制备的试剂检测阿尔兹海默症、非AD患者脑脊液中pTau-396磷酸化蛋白浓度，ROC曲线统计结果显示（图9），曲线下面积为0.89，以64pg/mL作为检测参考值，采用重组pTau-396磷酸化蛋白制备的检测试剂的特异性为 93.33％（28/30），灵敏度为83.33％（25/30）。检测阿尔兹海默症、非AD患者血清中pTau-396浓度，ROC曲线统计结果显示（图10），曲线下面积为0.83，以42pg/mL作为检测参考值，采用重组pTau-396磷酸化蛋白制备的检测试剂的特异性为 80％（24/30），灵敏度为83.33％（25/30）。
综上所述，本发明提供的重组pTau-181、pTau-231、pTau-396磷酸化蛋白，能够用于血液及脑脊液中pTau-181、pTau-231、pTau-396磷酸化蛋白含量的检测，特异性强、灵敏度高，可用于阿尔茨海默症患者的辅助诊断、疗效评估及病程监控。
具体的，实施例中捕获抗体3B6是杂交瘤细胞株3B6所分泌，杂交瘤细胞株3B6是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202056，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
具体的，实施例中2A7抗体是杂交瘤细胞株2A7所分泌，杂交瘤细胞株2A7是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202057，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
具体的，实施例中3G8抗体是杂交瘤细胞株所分泌，杂交瘤细胞株3G8是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202058，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
具体的，实施例中1F4抗体是杂交瘤细胞株所分泌，杂交瘤细胞株1F4是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202059，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州仁端生物医药科技有限公司
<120> 一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgacaaaa aagccaaggg ggctgatggt aaaacgaaga tcgccacacc gcggggagca 60
gcccctccag gccagaaggg ccaggccaac gccaccagga ttccagcaaa aaccccgccc 120
gctccaaaga caccacccag ctctggtgaa cctccaaaat caggggatcg cagcggctac 180
agcagccccg gctccccagg cactcccggc agccgctccc gcaccccgtc ccttccaacc 240
ccacccaccc gggagcccaa gaaggtggca gtggtccgta ctccacccaa gtcgccgtct 300
tccgccaaga gccgcctgca gacagccccc gtgcccatgc cagacctgaa gaatgtcaag 360
tccaagatcg gctccactga gaacctgaag caccagccgg gaggcgggaa ggtgcagata 420
attaataaga agctggatct tagcaacgtc cagtccaagt gtggctcaaa ggataatatc 480
aaacacgtcc cgggaggcgg cagtgtgcaa atagtctaca aaccagttga cctgagcaag 540
gtgacctcca agtgtggctc attaggcaac atccatcata aaccaggagg tggccaggtg 600
gaagtaaaat ctgagaagct tgacttcaag gac 633
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu
1 5 10 15
Pro Pro Lys
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Lys Ser Pro Ser
1 5 10 15
Ser Ala Lys
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Pro Val Val Ser Gly Asp
1 5 10 15
Thr Ser Pro
<210> 5
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr
20 25 30
Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser
35 40 45
Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly
50 55 60
Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
65 70 75 80
Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro
85 90 95
Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro
100 105 110
Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn
115 120 125
Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys
130 135 140
Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile
145 150 155 160
Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
165 170 175
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
180 185 190
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
195 200 205
Phe Lys Asp
210

Claims (8)

1.一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀，所述Tau截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽、231磷酸化多肽或396磷酸化多肽；
S2、在上述混合液中，加入戊二醛进行偶联反应；
S3、偶联反应结束后，将上述反应液放入磷酸盐缓冲液中透析，再换用Tris-Hcl缓冲液透析，然后获得蛋白-磷酸化多肽偶联物，即形成重组磷酸化蛋白；
S4、对上述偶联物进行浓度测定，最终用Tris-Hcl缓冲液进行保存。
2.根据权利要求1所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述步骤S1中Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽的摩尔比为1︰5~10，所述步骤S2中选用20μl2.5%戊二醛，所述步骤S1和步骤S3中选用0.01M pH=7.2的磷酸盐缓冲液，所述步骤S3中选用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液，所述步骤S4中选用含1%BSA Tris-Hcl缓冲液。
3.根据权利要求2所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，在将Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀之前还包括制备Tau截短蛋白，具体包括以下步骤：将Tau截短蛋白的核苷酸序列连接至表达载体，并装入表达菌株中；在培养基中过夜诱导Tau截短重组蛋白可溶性表达并纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。
4.根据权利要求1-3所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽，多肽序列如下所示：AKTPPAPKT（p）PPSSGEPPK，其序列如SEQ ID NO:2所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-181磷酸化蛋白，用于作为pTau-181磷酸化蛋白检测标品。
5.根据权利要求1-3所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述Tau磷酸化多肽为231磷酸化多肽，多肽序列如下所示：PKKVAVVRT(p)PPKSPSSAK，其序列如SEQ ID NO:3所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-231磷酸化蛋白，用于作为pTau-231磷酸化蛋白检测标品。
6.根据权利要求1-3所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述Tau磷酸化多肽为396磷酸化多肽，多肽序列如下所示：HGAEIVYKS(p)PVVSGDTSP，其序列如SEQ ID NO:4所示，其中丝氨酸S位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-396磷酸化蛋白，用于作为pTau-396磷酸化蛋白检测标品。
7.一种采用重组pTau-181、pTau-231或pTau-396磷酸化蛋白在构建制备检测体系中的应用，其特征在于，所述检测体系构建包括以下步骤：
Q1、首先在固相载体上包被捕获抗体，浓度为5μg/mL；
Q2、将重组pTau-181、pTau-231或pTau-396磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释，再加入碱性磷酸酶标记的抗体，浓度50ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min；
Q3、用PBST清洗，化学发光底物加入后，检测发光值；
Q4、绘制校准曲线。
8.一种含有重组pTau-181、pTau-231或pTau-396磷酸化蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含有固相载体、碱性磷酸酶标记的检测抗体、发光底物。
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