CN111346108A - 一种治疗covid-19的病毒灭活血浆的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗COVID‑19的病毒灭活血浆的制备方法,所述方法包括如下步骤:(1)采集COVID‑19康复者恢复期血浆或经新型冠状病毒疫苗(SARS‑CoV‑2疫苗)免疫后血浆及预处理;(2)添加亚甲蓝,并对血浆进行光照灭活;(3)检测合格后贴标包装。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体的,涉及一种治疗COVID-19的病毒灭活血浆的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的急性传染性疾病。SARS-CoV-2是具有包膜的单股正链RNA病毒,冠状病毒科β属的冠状病毒,是目前感染人类冠状病毒家族中的第七个成员,主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播,也可能通过气溶胶和消化道粪-口等途径传播。COVID-19临床以发热、干咳、乏力为主要表现,部分患者可出现呼吸困难、腹泻等症状,可进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克和出凝血功能障碍等症状,严重者可致患者死亡。
《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四版)》提及“可以考虑恢复期血浆治疗”。康复者恢复期血浆疗法在尚无特效药,疫情期间,为改善患者疾病症状,成为一种可及可选的方案。但是,因为是来源于新冠康复者,需要谨慎对待血清血浆治疗可能存在的问题,尤其是在疫情暴发之初,新冠是否会经过血液传播尚未可知。血浆安全性、输注新冠康复者恢复期血浆的有效性、是否会发生不良反应等问题,这些问题也是血浆疗法及相关血液制品的主要风险。
亚甲蓝病毒灭活的技术原理:亚甲蓝又名美蓝,为多靶点的光敏剂,吩噻嗪类染料,其最大吸收峰为670nm,表面携带正电荷,与脂膜和蛋白质、核酸有较高的亲和性,与病毒核酸结合后可以嵌入DNA/RNA中,与病毒核酸带负电荷的G-C碱基对相结合。在有光照的条件下,亚甲蓝分子吸收光能后可激发产生单态分子氧和羟自由基引起广泛损伤,单态分子氧通过修饰鸟嘌呤碱基而影响核酸,使其产生缺口,引起核酸链的断裂或导致碱基位点丢失阻止其复制,还可造包膜破损,达到灭活病毒的目的。能杀灭包括艾滋病病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)等的脂质包膜病毒和部分非脂质包膜病毒。
新冠康复者血浆治疗的原理:康复者血浆中含有对抗新冠病毒的特异性抗体,能与病毒结合,清除病毒,防止病毒入侵细胞造成机体损伤;血浆中主要蛋白质等成分,可以补充机体因疾病产生的消耗。
血浆治疗理论上存在病毒传播的风险。其风险主要在于:受于目前检测病原种类的局限,检测技术存在窗口期漏检的局限等。所以如何保证新冠康复者血浆的安全性,成为迫切需要解决问题。新冠康复者血浆的安全性,还在于新冠病毒安全性。再者如何大规模制备病毒灭活血浆,保证其有效性,并保证临床使用需求。本发明旨在通过加入一种光化学灭活剂到采集的新冠康复者血浆中,并通过光照灭活技术,灭活血浆中可能残留的新冠病毒及其他已知和未知病毒,并进行多种病原学检测,从而降低病毒风险,并且对其中的有效成分新冠抗体进行检测,以保证其有效性。优化灭活后血浆过滤速度,降低亚甲蓝残留,采取环境等控制措施,全程无菌操作,规模化制备,以保证产品安全有效质量可控。
发明内容
本发明首先涉及一种治疗COVID-19的灭活血浆的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)采集COVID-19康复者恢复期血浆或经新冠疫苗免疫后血浆及预处理;
(2)采用亚甲蓝对血浆进行光照灭活;
(3)检测合格后贴标包装。
其中,步骤(1)所述的采集COVID-19康复者恢复期血浆及预处理包含:
选择距首发症状时间不少于3周的新冠康复者,男性体重不低于50公斤或女性不低于45公斤,无经血传播疾病史;用单采浆技术,或者全血采集后分离血浆等方式进行采浆;血浆采集后常温放置于24小时内进行步骤(2)处理,或于6小时内冻结成型,并保存于-20度以下,进行步骤(2)处理前进行融化。
步骤(2)所述的采用亚甲蓝对血浆进行光照灭活的步骤为:
1)血浆流过亚甲蓝添加元件流入光照袋中,血浆中添加的亚甲蓝含量为0.9-2.6μmol/L,优选0.9-1.3μmol/L;光照袋在可见光照射下的透光率不小于80%;优选的,光照袋由在600-700nm波长下透光率85%的PVC材质制备;
2)亚甲蓝添加完毕后进行光照灭活,光照强度30000-40000lx(30W可见光荧光灯,波长600-700nm),摆动幅度为50mm±10mm,摆动频率60次/分±5次/分,有效光照时间不少于30min;
3)亚甲蓝灭活后,使用一次性血液过滤器过滤,过滤速度30~60ml/min,优选的,一次性血液过滤器为去白细胞滤器,最优选的,过滤器为亲水性聚酯无纺布材料制成的过滤器,滤过孔径小于8μm;
步骤(3)的检测包括:亚甲蓝残留量及血浆特定蛋白,亚甲蓝残留量≤0.3μmol/L,主要血浆特异性蛋白的含量不发生显著降低。
本发明还涉及以所述治疗COVID-19的灭活血浆的制备方法制备获得的抗COVID-19的产品。
本发明还涉及所述治疗COVID-19的灭活血浆的制备方法在制备抗COVID-19病毒的产品中的应用。
本发明的有益效果在于,康复血浆经过病毒灭活制备后,抗SARS-CoV-2抗体滴度并未发生明显变化。灭活后血浆亚甲蓝残留均低于0.3μmol/L。进过多种病原学检测,尤其是新冠病毒核酸检测,均为阴性。在尚无特效药物,尤其是在疫情暴发初期,该方法制备的灭活血浆,能够快速制备获取,并用于临床救治。对重症危重症患者治疗,提高治愈率,降低死亡率等发挥作用。对于疾病进展较快的患者,避免病情向更严重程度发展,导致使用介入式呼吸机、ECOM等,以及介入式治疗产生的副作用和后遗症。
附图说明
图1、本发明的方法流程图。
具体实施方式
实施例1、COVID-19康复者恢复期血浆采集
1.血浆采集标准,
捐献血浆的新冠康复者应当同时符合以下条件:
①新冠康复者距首发症状时间不少于3周;
②康复者符合国家卫健委发布的最新版新冠肺炎诊疗方案中解除隔离和出院标准;
③年龄应当满18岁,且不超过55岁;
④男性体重不低于50公斤、女性不低于45公斤;
⑤无经血传播疾病史;
⑥经临床医师综合患者治疗等有关情况评估可以捐献血浆者。
2.采集步骤:
签署知情同意书后,进行血浆采集,血浆采集可以用单采浆技术,或者全血采集后,分离血浆等方式进行,优选单采浆技术。采集后的血浆置于血浆袋中,血浆袋应明确标识。采集后的血浆经检测后进行病毒灭活。
血浆应于采集后冻结成型,优选于6小时内冻结成型,并保存于-20度以下,于24小时内按本申请所述的方法进行亚甲蓝光照灭活。
3.原料血浆检测:
进行病原学检测和理化性质检测:
①外观:血浆应为黄色或淡绿色,无溶血、无乳糜、无可见异物;血袋完好。
②血型:正定法。
③人免疫缺陷病毒(HIV-1/HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)采用酶联免疫试剂盒+核酸检测法,结果应呈阴性。梅毒螺旋体(TP)采用酶联免疫试剂盒检测,应为阴性。
④SARS-CoV-2病毒,采用核酸检测,结果应呈阴性。
⑤丙氨酸氨基转移酶(ALT),应≤25U/ml。
⑥蛋白质含量,应不低于50g/L。
实施例2、亚甲蓝灭活血浆的操作流程
本方法全程需无菌操作,
1.原料血浆添加亚甲蓝:血浆流过亚甲蓝(MB)添加元件,流入光照袋,流入光照袋中的血浆中亚甲蓝含量为0.9-2.6μmol/L,优选为0.9-1.3μmol/L。
2.亚甲蓝添加完毕后,热合密封(以加热的方式密封)进浆管,将含血浆的光照袋及与其相连接的吸附过滤部件放入医用血浆病毒灭活柜内,光照灭活。光照强度30000-40000lx(30W荧光灯,波长600-700nm),摆动幅度为50mm±10mm,摆动频率60次/分±5次/分,有效光照时间不少于30min。
3.光照灭活结束,将光照袋置于高处,过滤除去亚甲蓝,使含亚甲蓝的血浆经吸附过滤部件自然流入血液储存袋,过滤速度30~60ml/min,过滤部件的核心为亲水性聚酯无纺布材料,滤过孔径小于8μm,过滤结束后,打开旁路排气夹,排除血液储存袋内气体,然后关闭排气夹并使光照袋内剩余血浆经过滤部件尽可能注入血浆袋。
经多次对照实验验证,灭活后血浆过滤速度对亚甲蓝残留量影响较大,本发明方法优化前使用的过滤速度70~80ml/分钟,此时亚甲蓝残留约为0.32μmol/L;经优化后,调整过滤速度30~60ml/分钟,残留量均低于0.3μmol/L。
4.热合血液储存袋与吸附过滤部件的连接管,废弃光照袋及吸附过滤部件。
5.取样检测,检测合格后血浆进行贴标包装和保存。
实施例3、灭活血浆制备例1
1.融化3袋新冠康复者血浆,每一袋血浆,均按照下列步骤操作;
2.添加亚甲蓝(MB):将少量血浆流过“MB添加元件”,然后关闭止流夹,当血浆在MB添加元件中停留约1-2分钟后,流入光照袋中的血浆中亚甲蓝含量为0.9-1.3μmol/L,再打开止流夹,使血浆完全流入光照袋;
2.亚甲蓝添加完毕后,热合封闭进浆管,将含血浆的光照袋及吸附过滤部件放入医用血浆病毒灭活柜内,光照灭活血浆病毒。光照强度30000-40000lx,摆动幅度为50mm±10mm,摆动频率60次/分±5次/分有效光照时间30min;
3.光照灭活结束,将光照袋高置,打开止流夹,轻轻挤压光照袋,开始过滤,使含亚甲蓝的血浆经吸附过滤部件自然流入血液储存袋,过滤速度30~60ml/min,过滤结束后,打开旁路排气夹,排除血液储存袋内气体,然后关闭排气夹并使光照袋内剩余血浆经吸附过滤部件尽可能注入血浆袋。
4.热合血液储存袋与吸附过滤部件的连接管,废弃光照袋及吸附过滤部件。
5.取样检测,检测合格后血浆进行贴标包装和保存。
检测结果:
结果显示:亚甲蓝光照灭活前后新冠抗体滴度并未发生明显变化。灭活前后新冠抗体滴度均大于1:160,符合要求。
实施例4、灭活血浆制备例2
1.融化血浆,使少量血浆流过“MB(亚甲蓝)添加元件”,然后关闭止流夹,当血浆在MB添加元件中停留约1分钟后,再打开止流夹,使血浆完全流入光照袋。
2.亚甲蓝添加完毕后,热合进浆管,将含血浆的光照袋及吸附过滤部件放入医用血浆病毒灭活柜内,光照灭活血浆病毒。光照强度30000-40000lx,摆动幅度为50mm±10mm,摆动频率60次/分±5次/分,有效光照时间30min
3.光照灭活结束,将光照袋高置,打开止流夹,轻轻挤压光照袋,开始过滤,使含亚甲蓝的血浆经吸附过滤部件自然流入血液储存袋,过滤速度30-60ml/min,过滤结束后,打开旁路排气夹,排除血液储存袋内气体,然后关闭排气夹并使光照袋内剩余血浆经吸附过滤部件尽可能注入血浆袋。
4.热合血液储存袋与吸附过滤部件的连接管,废弃光照袋及吸附过滤部件。
5.取样检测,检测合格后血浆进行贴标包装和保存。
新冠病毒灭活血浆检测结果:
检验项目 | ABO/Rh血型 | ALT | 亚甲蓝残留量 | 新冠抗体效价 |
标准 | / | 应≤25单位 | 应≤0.3μmol/L | 应≥1:160 |
2020020505 | O型/RhD阳性 | ≤25单位 | ≤0.3μmol/L | ≥1:1280 |
2020020506 | B型/RhD阳性 | ≤25单位 | ≤0.3μmol/L | ≥1:2560 |
2020020507 | O型/RhD阳性 | ≤25单位 | ≤0.3μmol/L | ≥1:2560 |
结果显示:亚甲蓝残留均低于≤0.3μmol/L,新冠抗体均远大于1:160。
实施例5、灭活血浆制备例3
1.融化血浆,使少量血浆流过“MB(亚甲蓝)添加元件”,然后关闭止流夹,当血浆在MB添加元件中停留约1~2分钟后,再打开止流夹,使血浆完全流入光照袋。
2.亚甲蓝添加完毕后,热合封闭进浆管,将含血浆的光照袋及吸附过滤部件放入医用血浆病毒灭活柜内,光照灭活血浆病毒。光照强度30000-40000lx,摆动幅度为50mm±10mm,摆动频率60次/分±5次/分,有效光照时间30min
3.光照灭活结束,将光照袋高置,打开止流夹,轻轻挤压光照袋,开始过滤,使含亚甲蓝的血浆经吸附过滤部件自然流入血液储存袋,过滤速度30-60ml/min,过滤结束后,打开旁路排气夹,排除血液储存袋内气体,然后关闭排气夹并使光照袋内剩余血浆经吸附过滤部件尽可能注入血浆袋。
4.热合血液储存袋与吸附过滤部件的连接管,断开吸附部件与存储袋的连接,废弃光照袋及吸附过滤部件。
5.取样检测,检测合格后血浆进行贴标包装和保存。
实施例6、灭活后血浆的质量检测
1、亚甲蓝添加量对残留的影响:分别经过亚甲蓝添加元件将血浆分装至100ml光照袋中,分装量分别为50ml、75ml、100ml(亚甲蓝释放量分别为1.8~2.6μmol/L、1.35~1.95μmol/L、0.9~1.3μmol/L)按照实施例,进行亚甲蓝光照法病毒灭活,留取病毒灭活后血浆样本,进行亚甲蓝残留量检测。
结果显示:灭活过滤后血浆中亚甲蓝残留量均≤0.3μmol/L,符合要求。
2、血浆特定蛋白检测:按照实施例进行病毒灭活,留取病毒灭活前后血浆样本,进行血浆特定蛋白检测。
结果显示:病毒灭活前后,血浆中主要蛋白含量并未发生明显变化。
3、病毒灭活效果检测:在灭活前血浆样本中加入指示病毒伪狂犬病毒(PRV),按照本发明病毒灭活步骤进行灭活,留取灭活前后样本,进行病毒滴度检测
结果显示:按照本发明方法,可以有效灭活加入血浆中的指示病毒。
本发明通过加入一种光化学灭活剂到采集的新冠康复者恢复期血浆或经过新冠疫苗免疫后血浆中,并通过光照灭活技术,灭活血浆中可能残留的新冠病毒及其他已知和未知病毒,并进行多种病原学检测,从而降低病毒传播风险。此外,灭活后对康复血浆中的抗COVID-19抗体进行检测,结果显示,灭活前后抗COVID-19抗体并未发生显著变化。
最后需要说明的是,以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质,不用做限定本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种治疗COVID-19的灭活血浆的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)采集COVID-19康复者恢复期血浆或经新冠疫苗免疫后血浆及预处理;
(2)采用亚甲蓝对血浆进行光照灭活;
(3)检测合格后贴标包装。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的采集COVID-19康复者恢复期血浆及预处理包含:
(1)选择距首发症状时间不少于3周的新冠康复者,男性体重不低于50公斤或女性不低于45公斤,无经血传播疾病史;
(2)用单采浆技术,或者全血采集后分离血浆等方式进行采浆;
(3)血浆常温放置于24小时内进行灭活处理。或采集后于6小时内冻结成型,并保存于-20度以下。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的采用亚甲蓝对血浆进行光照灭活的步骤为:
1)血浆流过亚甲蓝添加元件流入光照袋中,血浆中添加的亚甲蓝含量为0.9-2.6μmol/L,优选0.9-1.3μmol/L;光照袋在可见光照射下的透光率不小于80%;优选的,光照袋由在600-700nm波长下透光率85%的PVC材质制备;
2)亚甲蓝添加完毕后进行光照灭活,光照强度30000-40000lx(30W可见光荧光灯,波长600-700nm),,摆动幅度为50mm±10mm,摆动频率60次/分±5次/分,有效光照时间不少于30min;
3)亚甲蓝灭活后,使用一次性血液过滤器过滤,过滤速度约30-60ml/min,优选的,一次性血液过滤器为去白细胞滤器,最优选的,过滤器为亲水性聚酯无纺布材料制成的过滤器,滤过孔径小于8μm。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(3)的检测包括:亚甲蓝残留量及血浆特定蛋白,亚甲蓝残留量≤0.3μmol/L,主要血浆特异性蛋白的含量不发生显著降低。
5.由权利要求1-4任一所述的治疗COVID-19的灭活血浆的制备方法制备获得的抗COVID-19的灭活血浆。
6.权利要求1-4任一所述的治疗COVID-19的灭活血浆的制备方法在制备抗COVID-19病毒的产品中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200630 |
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