CN111334520B - 一种共聚体酶复合物的制备方法、共聚体酶复合物和应用 - Google Patents

一种共聚体酶复合物的制备方法、共聚体酶复合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种共聚体酶复合物的制方法备、共聚体酶复合物和应用，属于蛋白质工程技术及生物标志物诊断技术领域，包括：将SAM基因与SpT基因、SnT基因融合后，插入载体，得重组质粒；将SAHH基因与SnC基因融合后，插入载体，得重组质粒；将HMT基因与SpC基因融合后，插入载体，得重组质粒；将得到的三个重组质粒分别或共同转化到感受态细胞中，得到工程菌，将所述工程菌诱导表达后，得到共聚体酶复合物。采用本发明制备方法使共聚体酶复合物的酶活性提高，稳定性增强，并且能够提高生产效率，减少在配制Hcy检测试剂时上述关键酶的加入量，从而降低成本。

Description

一种共聚体酶复合物的制备方法、共聚体酶复合物和应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术及生物标志物诊断技术领域，尤其涉及一种共聚体酶复合物的制备方法、共聚体酶复合物和应用。
背景技术
同型半胱氨酸(Hcy)为含巯基氨基酸，是体内甲硫氨酸循环过程中的一个代谢中间产物。血液中总Hcy浓度的病理性升高会导致高同型半胱氨酸血症。近年来的研究已确认，高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切关系，是心血管疾病的一个新的独立和重要的危险因素。目前国内外已经把Hcy作为心血管疾病的一个检测指标。
王学忠首次在专利中公开了一种新的测定体液样本中Hcy的酶循环方法，该方法不受体液样本中干扰物质的干扰，具有优良的反应灵敏度。并首次采用测定Hcy方法中常用的工具酶，如：HMT和SAHH，用于酶循环增量测定。龚俊、刘希等人利用基因工程技术将SAM基因构建至原核表达载体中，并转化大肠杆菌构建重组宿主细胞；通过补料分批发酵得到高产量的菌体；之后通过亲和层析技术，对SAM纯化，所得蛋白的色谱纯度在90％以上。彭毅等人采用易错PCR、定点突变的方法筛选出一种HMT突变体，在野生型HMT的基础上在D53、D283、L252、Q219氨基酸处含有一处或两处以上氨基酸突变。该突变体的活性提高了一倍，稳定性也有所提高。邹炳德等人通过PCR技术从环境基因组文库中筛选获得一高活性的SAHH基因，插入到含有T7强启动子的PET28质粒中，化学转化导入大肠杆菌BL21中，获得高效表达SAHH的基因工程菌。
综上所述，目前基于循环酶法的Hcy试剂检测方法所涉及的相关工具酶都能够通过基因工程表达并应用，但是目前的工具酶制备方法相对效率不高，酶活性相对较低，批间差较大，使得在制备Hcy试剂时需要大量调节和加入大量的工具酶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种共聚体酶复合物的制方法备、共聚体酶复合物和应用，采用本发明制备方法使共聚体酶复合物的酶活性提高，稳定性增强，并且能够提高生产效率，减少在配制Hcy检测试剂时加入的共聚体酶复合物的量。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种共聚体酶复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将SAM基因与SpT基因、SnT基因融合后，插入至pET-28a载体中，得到pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒；
2)将SAHH基因与SnC基因融合后，插入至pJPC13载体中，得到pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒；
3)将HMT基因与SpC基因融合后，插入至pET-22b载体中，得到pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒；
4)将所述步骤1)得到的pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒、步骤2)得到的pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒、步骤3)得到的pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒分别或共同转化到感受态细胞中，得到工程菌，将所述工程菌诱导表达后，得到共聚体酶复合物；
所述步骤1)、2)和3)之间无时间顺序限定。
优选的，所述步骤4)感受态细胞包括BL21感受态细胞。
优选的，所述步骤1)SAM基因的GenBank登录号为AAA24164.1。
优选的，所述步骤3)HMT基因的GenBank登录号为CAA98009.1。
优选的，所述步骤2)SAHH基因的GenBank登录号为AAA51681.1。
优选的，所述步骤4)pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒、pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒、pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒分别转化到感受态细胞中，分别得到工程菌，将所述工程菌分别诱导表达后，得到SAM-SpT-SnT蛋白、HMT-SpC蛋白和SAHH-SnC蛋白，将所述SAM-SpT-SnT蛋白、HMT-SpC蛋白和SAHH-SnC蛋白组装后，得到共聚体酶复合物。
优选的，所述组装的条件包括：所述SAM-SpT-SnT蛋白、HMT-SpC蛋白和SAHH-SnC蛋白的摩尔比为1:1～1.5:1～2；
所述组装的时间为1h；
所述组装的温度为37℃。
本发明还提供了一种由上述技术方案所述的制备方法制备得到的共聚体酶复合物。
本发明还提供了上述技术方案所述的共聚体酶复合物在配制Hcy检测试剂中的应用。
优选的，所述Hcy检测试剂中共聚体酶复合物的浓度为100～500mg/L。
本发明提供了一种共聚体酶复合物的制备方法，使得酶活性增加，稳定性增强，原理是共聚体酶复合物是通过将参与总反应的各种酶在空间上形成共价结合后相互靠近，使得上一个反应的产物能够快速进入下一个反应作为底物，从而提高单位时间内的反应效率；因为共聚体酶复合物的形成，使参与总反应的各种酶相互附着靠近，进一步使其能够承受很多的外界压力，使其稳定性增强。
具体实施方式
本发明提供了一种共聚体酶复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将SAM基因与SpT基因、SnT基因融合后，插入至pET-28a载体中，得到pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒；
2)将SAHH基因与SnC基因融合后，插入至pJPC13载体中，得到pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒；
3)将HMT基因与SpC基因融合后，插入至pET-22b载体中，得到pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒；
4)将所述步骤1)得到的pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒、步骤2)得到的pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒、步骤3)得到的pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒分别或共同转化到感受态细胞中，得到工程菌，将所述工程菌诱导表达后，得到共聚体酶复合物；
所述步骤1)、2)和3)之间无时间顺序限定。
在本发明中，SpyCatcher(简写为SpC)和SpyTag(简写为SpT)以及SnoopCatcher(简写为SnC)和SnoopTag(简写为SnT)；S-腺苷甲硫氨酸合成酶(简称SAM)、同型半胱氨酸转甲基酶(简称HMT)和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(简称SAHH)。
本发明将SAM基因与SpT基因、SnT基因融合后，插入至pET-28a载体中，得到pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒。
在本发明中，所述SAM基因的GenBank登录号优选为AAA24164.1。在本发明中，所述SpT基因、SnT基因来源于细菌粘附蛋白(ACS Nano 2019,13,9895-9906)，SpT蛋白能够特异性地与SpC蛋白共价结合，SnT蛋白能够特异性地与SnC蛋白共价结合。本发明对所述SAM基因与SpT基因、SnT基因融合的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规将基因融合的方法即可。本发明对所述基因插入到pET-28a载体中的方法没有特殊限定，采用常规基因插入到载体中的方法即可。
在本发明中，所述SpT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
ggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtgcccatattgtcatggttgatgcatacaagccgacgaag；
所述SnT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
ggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtgctagcaaactgggcgatattgaatttattaaagtgaacaaa。
本发明将SAHH基因与SnC基因融合后，插入至pJPC13载体中，得到pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒。
在本发明中，所述SAHH基因的GenBank登录号优选为AAA51681.1，所述SnC基因来源于细菌粘附蛋白(ACS Nano 2019,13,9895-9906)。本发明对所述SAHH基因与SnC基因融合的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规将基因融合的方法即可。本发明对所述基因插入到pJPC13载体中的方法没有特殊限定，采用常规基因插入到载体中的方法即可。
在本发明中，所述SnC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
ggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtgctagcaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccgctggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgcaggatattccggctacatatgaatttaccaacggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaa。
本发明将HMT基因与SpC基因融合后，插入至pET-22b载体中，得到pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒。
在本发明中，所述HMT基因的GenBank登录号优选为CAA98009.1。在本发明中，所述SpC基因来源于细菌粘附蛋白(ACS Nano 2019,13,9895-9906)。本发明对所述HMT基因与SpC基因融合的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规将基因融合的方法即可。本发明对所述基因插入到pET-22b载体中的方法没有特殊限定，采用常规基因插入到载体中的方法即可。
在本发明中，所述SpC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
ggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtgccatggttgataccttatcaggtttatcaagtgagcaaggtcagtccggtgatatgacaattgaagaagatagtgctacccatattaaattctcaaaacgtgatgaggacggcaaagagttagctggtgcaactatggagttgcgtgattcatctggtaaaactattagtacatggatttcagatggacaagtgaaagatttctacctgtatccaggaaaatatacatttgtcgaaaccgcagcaccagacggttatgaggtagcaactgctattacctttacagttaatgagcaaggtcaggttactgtaaatggcaaagcaactaaaggtgacgctcatatt。
本发明将得到的pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒、pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒、pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒分别或共同转化到感受态细胞中，得到工程菌，将所述工程菌诱导表达后，得到共聚体酶复合物。
在本发明中，所述感受态细胞优选包括BL21感受态细胞，更优选包括BL21(DE3)感受态细胞。本发明对所述工程菌诱导表达的方法没有特殊限定，采用常规工程菌诱导基因表达的方法即可。本发明优选使用Ni亲和层析纯化得到共聚体酶复合物。
在本发明中，所述pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒、pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒、pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒分别转化到感受态细胞中，分别得到工程菌，将所述工程菌分别诱导表达后，得到SAM-SpT-SnT蛋白、HMT-SpC蛋白和SAHH-SnC蛋白，优选将所述SAM-SpT-SnT蛋白、HMT-SpC蛋白和SAHH-SnC蛋白组装后，得到共聚体酶复合物。
在本发明中，所述组装的条件优选包括：所述SAM-SpT-SnT蛋白、HMT-SpC蛋白和SAHH-SnC蛋白的摩尔比优选为1:1～1.5:1～2；所述组装的时间优选为1h；所述组装的温度优选为37℃。
本发明还提供了一种由上述技术方案并所述的制备方法制备得到的共聚体酶复合物。
本发明还提供了上述技术方案所述的共聚体酶复合物在配制Hcy检测试剂中的应用。
在本发明中，所述Hcy检测试剂中共聚体酶复合物的浓度优选为100～500mg/L。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、共聚体酶复合物的重组质粒构建
1.1 SAM-SpT-SnT重组质粒构建
将SAM基因(GenBank:AAA24164.1)与SpT基因和SnT基因进行融合，并插入至pET-28a载体中，得到pET-28a-SAM-SpT-SnT重组质粒，携带卡那霉素抗性并在N端融合组氨酸标签。
1.2 HMT-SpC重组质粒构建
将HMT基因(GenBank:CAA98009.1)与SpC基因进行融合，并插入至pCDFDuetTM-1载体中，得到pCDFDuetTM-HMT-SpC重组质粒，携带链霉素抗性并在N端融合组氨酸标签。
1.3 SAHH-SnC重组质粒构建
将SAHH基因(GenBank:AAA51681.1)与SnC基因进行融合，并插入至pACYCDuet-1载体中，得到pACYCDuet-SAHH-SnC重组质粒，携带氯霉素抗性并在N端融合组氨酸标签。
二、共聚体酶复合物基因工程菌构建
2.1首先将pET-28a-SAM-SpT-SnT、pCDFDuetTM-HMT-SpC和pACYCDuet-SAHH-SnC分别转化至BL21(DE3)感受态细胞中，经不同抗生素筛选培养后得到三种不同的基因工程菌，分别为BL21(DE3)/pET-28a-SAM-SpT-SnT、BL21(DE3)/pCDFDuetTM-HMT-SpC、BL21(DE3)/pACYCDuet-SAHH-SnC。
三、对基因工程菌进行表达、纯化及组装
3.1使用IPTG分别对三种含有不同单体酶重组质粒的基因工程菌BL21(DE3)/pET-28a-SAM-SpT-SnT、BL21(DE3)/pCDFDuetTM-HMT-SpC、BL21(DE3)/pACYCDuet-SAHH-SnC进行诱导表达，分别经过Ni亲和层析纯化得到重组蛋白SAM-SpT-SnT、HMT-SpC、SAHH-SnC，并且按照摩尔比1:1:1进行混合后，在37℃条件下静置1小时完成组装得到共聚体酶复合物SAM-HMT-SAHH。
实施例2
将pET-28a-SAM-SpT-SnT、pCDFDuetTM-HMT-SpC和pACYCDuet-SAHH-SnC三种重组质粒同时转化至BL21(DE3)感受态细胞中，经三种抗生素筛选培养后得到基因工程菌，为BL21(DE3)/pET-28a-SAM-SpT-SnT+pCDFDuetTM-HMT-SpC+pACYCDuet-SAHH-SnC。
使用IPTG对同时含有三种单体酶重组质粒的基因工程菌BL21(DE3)/pET-28a-SAM-SpT-SnT+pCDFDuetTM-HMT-SpC+pACYCDuet-SAHH-SnC进行诱导表达，完成体内组装，经过Ni亲和层析纯化得到共聚体酶复合物重组蛋白SAM-HMT-SAHH。
其余条件同实施例1。
实施例3
使用共聚体酶复合物进行同型半胱氨酸试剂配制
使用单独的SAM、HMT、SAHH进行同型半胱氨酸试剂配制，作为对照试剂，按以下配方进行试剂配制，见表1和表2。
表1试剂配制组分
试剂1成分，pH8.5 浓度
Tris 50mM
TCEP 2mM
ATP 1mM
L-methionine 0.5mM
NADH 0.3mM
表2试剂组分
试剂2成分，pH8.0 浓度
Tris 50mM
Sucrose 5g/L
SAM 500mg/L
HMT 500mg/L
SAHH 500mg/L
ADA 50kU/L
GLDH 200kU/L
使用实施例1和2制备的体外组装获得的共聚体酶复合物和体内组装获得的共聚体酶复合物按下述配方进行同型半胱氨酸试剂配制，分别为测试组1和测试组2，见表3和4。
表3试剂组分
试剂1成分，pH8.5 浓度
Tris 50mM
TCEP 2mM
ATP 1mM
L-methionine 0.5mM
NADH 0.3mM
表4试剂组分
试剂2成分，pH8.0 浓度
Tris 50mM
Sucrose 5g/L
共聚体酶复合物SAM-HMT-SAHH 300mg/L
ADA 50kU/L
GLDH 200kU/L
对对照组和测试组试剂同时进行检测评价
试剂性能评价
Hitachi-7080检测参数，见表5。
表5 Hitachi-7080检测参数
Figure BDA0002437040040000101
1.定标反应度评价
用对照组、测试组1和测试组2试剂分别按上述参数测试已知浓度的校准品，记录校准品的吸光度变化率。
定标反应度评价结果，见表6。
表6定标反应度评价
Figure BDA0002437040040000111
结果显示，当共聚体酶复合物加至300mg/L时，测试组1和测试组2定标反应度明显高于对照组，但测试组1和测试组2之间并无明显区别。这是由于共聚体酶复合物将参与催化反应的酶在空间结构上结合更加紧密，使上一个反应的产物能够迅速进入下一个反应，导致在同一浓度条件下，其反应效率更高。
2.精密度评价
用对照组、测试组1和测试组2试剂分别按上述参数对参考范围上限的样本重复测试至少10次(n≥10)，分别计算测量值的平均值(X)和标准差(S)。按公式：CV＝S/X×100％计算变异系数(CV)。
精密度评价结果，见表7。
表7精密度评价测试
Figure BDA0002437040040000112
Figure BDA0002437040040000121
结果显示，测试组1、测试组2与对照组无明显差别，但从CV值来看，由于测试组1和测试组2的反应度较对照组更高，所以精密度会更好。
3.线性范围评价
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品(蒸馏水或去离子水)，混合成至少5个稀释浓度(xi)。分别用于对照组、测试组1和测试组2试剂测试，每个稀释浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r)。
Figure BDA0002437040040000123
Figure BDA0002437040040000122
绝对偏差＝|yi-yi估计值|…………………………(3)
式中：
xi─测定管溶液的理论浓度；
yi─与测定管溶液浓度相对应的实际测量值；
i─1，2，3，……，n。
将稀释浓度(xi)代入上述线性回归方程，计算yi的估计值，按公式(2)或(3)计算yi与估计值的相对偏差或绝对偏差。
线性范围评价结果，见表8。
表8线性范围评价
Figure BDA0002437040040000131
结果显示，对照组在线性范围上限出现偏低现象，测试组1和测试组2优于对照组。
4.热破坏稳定性评价
将对照组、测试组1和测试组2试剂同时置于37℃恒温恒湿孵箱中放置7天，取出后按照上述参数测试校准品，观察校准品反应吸光度变化率的变化。
定标反应稳定性结果，见表9。
表9定标反应稳定性
Figure BDA0002437040040000141
结果显示，与未进行热破坏的定标反应度相比，经过热破坏后，对照组反应度下降近50％，测试组1下降近5％，测试组2下降近3％。测试组1与测试组2明显优于对照组。这是由于共聚体酶复合物将三种关键酶进行聚合后，提高了每个酶的稳定性，使其在高温条件下不易丧失活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南博奥瑞康生物科技有限公司
<120> 一种共聚体酶复合物的制备方法、共聚体酶复合物和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttgtggtgc ccatattgtc 60
atggttgatg catacaagcc gacgaag 87
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttgtggtgc tagcaaactg 60
ggcgatattg aatttattaa agtgaacaaa 90
<210> 3
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttgtggtgc tagcaagccg 60
ctgcgtggtg ccgtgtttag cctgcagaaa cagcatcccg actatcccga tatctatggc 120
gcgattgatc agaatgggac ctatcaaaat gtgcgtaccg gcgaagatgg taaactgacc 180
tttaagaatc tgagcgatgg caaatatcgc ctgtttgaaa atagcgaacc cgctggctat 240
aaaccggtgc agaataagcc gattgtggcg tttcagattg tgaatggcga agtgcgtgat 300
gtgaccagca ttgtgccgca ggatattccg gctacatatg aatttaccaa cggtaaacat 360
tatatcacca atgaaccgat accgccgaaa 390
<210> 4
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttgtggtgc catggttgat 60
accttatcag gtttatcaag tgagcaaggt cagtccggtg atatgacaat tgaagaagat 120
agtgctaccc atattaaatt ctcaaaacgt gatgaggacg gcaaagagtt agctggtgca 180
actatggagt tgcgtgattc atctggtaaa actattagta catggatttc agatggacaa 240
gtgaaagatt tctacctgta tccaggaaaa tatacatttg tcgaaaccgc agcaccagac 300
ggttatgagg tagcaactgc tattaccttt acagttaatg agcaaggtca ggttactgta 360
aatggcaaag caactaaagg tgacgctcat att 393

Claims (6)

1.一种共聚体酶复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将MAT基因与SpyTag基因、SnoopTag基因融合后，插入至pET-28a载体中， 得到pET-28a-MAT-SpyTag-SnoopTag重组质粒；所述MAT为S-腺苷甲硫氨酸合成酶的缩写，基因的GenBank 登录号为 AAA24164.1；所述SpyTag基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SnoopTag基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
2）将SAHH基因与SnoopCatcher基因融合后，插入至pACYCDuet-1载体中，得到pACYCDuet-SAHH-SnoopCatcher重组质粒；所述SAHH为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的缩写，基因的GenBank登录号为AAA51681.1；所述SnoopCatcher基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
3）将HMT基因与SpyCatcher基因融合后，插入至pCDFDuetTM-1载体中，得到pCDFDuetTM-HMT-SpyCatcher重组质粒；所述HMT为同型半胱氨酸转甲基酶的缩写，基因的 GenBank 登录号为 CAA98009.1；所述SpyCatcher基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
4）将所述步骤 1）得到的pET-28a-MAT-SpyTag-SnoopTag重组质粒、步骤 2）得 到 的pACYCDuet-SAHH-SnoopCatcher 重 组 质 粒 、 步 骤 3 ） 得 到的 pCDFDuetTM-HMT-SpyCatcher 重组质粒分别或共同转化到感受态细胞中，得到工程菌，将所述工程菌诱导表达后，得到 MAT-SpyTag-SnoopTag 蛋白、HMT-SpyCatcher 蛋白和SAHH-SnoopCatcher 蛋白，将所述MAT-SpyTag-SnoopTag蛋白、HMT-SpyCatcher蛋白和 SAHH-SnoopCatcher 蛋白组装后，得到共聚体酶复合物；
所述步骤 1）、2）和 3）之间无时间顺序限定。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4）感受态细胞包括BL21感受态细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组装的条件包括：所述MAT-SpyTag-SnoopTag蛋白、HMT-SpyCatcher蛋白和SAHH-SnoopCatcher蛋白的摩尔比为1:1~1.5:1~2；
所述组装的时间为1h；
所述组装的温度为37℃。
4.一种由权利要求1~3任一项所述的制备方法制备得到的共聚体酶复合物。
5.权利要求4所述的共聚体酶复合物在配制Hcy检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Hcy检测试剂中共聚体酶复合物的浓度为100~500 mg/L。
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