CN111334453A

CN111334453A - 一种生防菌及其在农作物纹枯病防治方面的应用

Info

Publication number: CN111334453A
Application number: CN201911399068.0A
Authority: CN
Inventors: 牛冬冬; 张华梦; 郑礼煜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111334453B

Abstract

本发明涉及一种生防菌及其在农作物纹枯病防治方面的应用，属于农作物生物防治技术领域；本发明的生防菌CGMCC No.18423，可以有效防治农作物纹枯病，特别是可以有效防治水稻纹枯病，与现有技术的化学药剂相比，对人畜无毒，不污染环境，无残留，还能改良农作物种植微生态环境，有利于生态环境的可持续发展。

Description

一种生防菌及其在农作物纹枯病防治方面的应用

技术领域

本发明涉及一种生防菌及其在农作物纹枯病防治方面的应用，属于农作物生物防治技术领域。

背景技术

纹枯病是一种由真菌“立枯丝核菌”侵染引起的植物病害，又称云纹病，俗名花足秆、烂脚瘟，常见于水稻、小麦、谷子等禾本科植物，特别是“水稻”。

水稻纹枯病是水稻发生的最为普遍的主要病害之一，往往造成谷粒不饱满，空壳率增加，严重的可引起植株倒伏枯死，具有发病面积广、频率高、危害大的特点，给水稻的高产、稳产带来了巨大障碍，造成水稻减产10％～ 50％，其危害已超过水稻稻瘟病，已成为我国南方水稻主产区的第一大病害。

水稻纹枯病从秧苗期到抽穗灌浆期都有可能发生，以拔节孕穗期发病最为严重。水稻纹枯病主要危害叶鞘、叶片和茎秆，破坏传导组织，严重时叶片出现枯死，导致水稻不能正常抽穗，甚至整株死亡。随着水稻矮杆、密植等栽培技术的大力推广更加重了纹枯病的发生。

解决纹枯病的根本措施是选育抗病品种，但目前还未能筛选到高抗或免疫品种。目前主要是通过井冈霉素等化学药剂来防治纹枯病，然而，化学药剂的使用存在农药残留超标、环境污染等诸多弊端。

因此，本领域急需寻求新的安全有效的防治纹枯病的替代产品。利用环境有益微生物来控制病害的发生以及诱导提高作物抗逆能力是近些年来研究的热点，尤其这些微生物对环境无污染，引起了科学家们利用生物防治手段控制病害、以及应对不良环境的兴趣。加上各国积极推进农业绿色发展，提倡实施高效绿色防控措施，因此结合生物防治进行综合防治的方式成为当今纹枯病研究热点。

因此，本领域希望筛选出能够对纹枯病进行防治的生防菌。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种生防菌，所述生防菌为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18423。

本发明另一方面提供了一种采用如上述生防菌的菌药组合物，所述菌药组合物包含杀菌剂和上述的生防菌的菌粉；所述杀菌剂为井冈霉素、噻呋酰胺类杀菌剂、己唑醇类杀菌剂、嘧菌酯类杀菌剂中任意一种或几种的混合物。

本发明还一方面提供了一种菌药制剂，其中，所述菌药制剂包含如上述的生防菌和农药学上可接受的助剂。

本发明再一方面提供了一种菌药制剂，其中，所述菌药制剂包含如上述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂。

本发明再一方面提供了上述的生防菌在防治农作物纹枯病方面的应用。

本发明再一方面提供了上述的菌药组合物在防治农作物纹枯病方面的应用。

本发明再一方面提供了上述的菌药制剂在防治农作物纹枯病方面的应用。

优选的，所述农作物纹枯病是水稻纹枯病。

本发明提供的生防菌CGMCC No.18423，可以有效防治农作物纹枯病，特别是可以有效防治水稻纹枯病，与现有技术的化学药剂相比，对人畜无毒，不污染环境，无残留，还能改良农作物种植微生态环境，有利于生态环境的可持续发展。

附图说明

图1为对水稻纹枯病菌的平板拮抗试验的照片；

图2为本发明的生防菌剂ND11对水稻诱导型防御反应基因OsPR1b的诱导结果；

图3为本发明的生防菌剂ND11对水稻广谱抗性相关基因OsNPR1的诱导结果；

图4为本发明的生防菌剂ND11对PR蛋白相关基因ZB8的诱导结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的生防菌 ND11(短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus))CGMCC No.18423的操作过程。

(1)初筛：分离潜在的生防菌

从发生水稻纹枯病较轻的田间选取水稻植株，取其叶片(采自吉林市拉溪镇西)。将采集的水稻叶片用清水洗净并剪成2-3cm的小段,用无菌水漂洗 3次后，放入含有10ml无菌水(含0.1％蛋白胨)的三角瓶中，置摇床上振荡10min，将稀释10⁴和10⁵倍的悬浮液1mL分别加入已备好的LB培养基表面，均匀涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用。

(2)复筛：平板对峙培养法筛选拮抗细菌

用直径为0.8cm的打孔器将水稻纹枯病菌菌丝块接种于PDA培养基中心，同时将初筛中筛选到的菌株接种到PDA平板上，每皿点接4个菌株，4 点位置成十字。以只接水稻纹枯病菌菌丝块的平板作为对照。28℃下培养，对照长满全皿时，记录抑菌圈大小。选取有抑菌作用的菌株进行进一步筛选，同上述方法将水稻纹枯病菌菌丝块接种在PDA培养基的中心，然后在距离该中心等距离相对的两处接种上具有抑菌作用的菌株，另外两个相对的角接上无菌水作为对照。28℃培养，每天观察真菌的生长情况。

通过平板拮抗实验，筛选出了具有潜在可防治水稻纹枯病的生防菌株 ND11。

二、关于本发明的生防菌ND11(短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)) CGMCCNo.18423的鉴定过程如下：

分子生物学鉴定

根据细菌16S rRNA序列，采用系统发育分析对筛选获得的生防菌ND11 进行分子生物学的鉴定。

将筛选获得的生防菌ND11在LB培养基中，28℃环境下培养至对数期，以12000转/分钟离心5分钟收集菌体。

采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA。

再采用天根生化科技有限公司的PCR扩增试剂盒扩增该生防菌ND11的 16S rRNA序列及gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板，具体操作按照试剂盒说明书进行。

扩增16S rRNA序列所采用的正向引物序列为： 5’-AGAGTTTGATCACTGGCTCAG-3’，扩增采用的反向引物序列为： 5’-CTACGGAGTACCTTGTTACGAC-3’。

扩增gyrB基因片段采用的正向引物序列为： 5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’，扩增采用的反向引物序列为： 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。

扩增条带使用天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收。回收的样品送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

将测序结果通过NCBI BLAST软件进行同源性比较(与已知细菌的16S rRNA序列以及gyrB基因片段进行相似性比对)，根据对比结果，鉴定本发明的生防菌ND11为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

三、关于菌株的保藏

本发明的防治农作物纹枯病的生防菌ND11，属于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为 2019年08月26日，其保藏编号为CGMCC No.18423。

四、本发明生防菌的培养方法以及应用

将本发明的生防菌ND11接种到LB平板(LB配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)上；具体的，在LB平板上划线，生化培养箱中28℃培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5ml LB培养液的试管中，置于28℃、200rpm的摇床培养12h，作种子液。

以1％的接种量将种子液接种于装有150mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，220r/min的摇床中培养48h，将用灭菌水稀释制成活菌浓度为 5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml的菌剂。

当然，本发明的生防菌ND11的培养并不限于以上方法。凡是能够大量培养生防菌ND11，且保持其抗纹枯病活性的方法均可用于制备本发明的生防菌剂。

关于本发明生防菌ND11的应用，

一般来说，在农作物发病之前，即水稻生长30天(分叶期前)，将上述培养获得的菌液稀释5倍进行叶面喷施，可同时在农作物移栽入土后，立刻将上述培养获得的菌液稀释5倍后对移栽的农作物进行灌根。

五、平板拮抗实验方法

具体的试验方法为：将保存于4℃中的水稻纹枯病菌接种到PDA平板上活化，在28℃培养箱中已培养2天左右，待真菌长满平板后，用灭菌的打孔器从菌落外边缘(取菌落中靠近边缘的部分)均匀地打取直径为8mm的圆形菌块(菌碟)，接种于PDA平板的中央；然后在距离接种位置等距离的相对两处用无菌牙签点接种本发明的生防菌ND11的菌液(菌液活菌浓度为 5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml)，另外两个相对的角不接种(作为对照)，再将平板倒置，放置于28℃培养箱中培养，每隔两天观察真菌生长情况，记录抑菌圈的大小。上述处理同时做3组平行实验。

参见图1，为对水稻纹枯病菌的平板拮抗试验的照片，其中标注“ND11” 的位置为接种了生防菌ND11的菌斑，标注“CK”的位置为对照。

经测量，左右两侧的生防菌ND11的菌斑的半径为1.1cm(以生防菌接种点为圆心的半径)，生防菌ND11的菌斑的边缘到水稻纹枯病菌的边缘的距离为4.25cm，上下两侧(对照处)的水稻纹枯病菌的菌斑半径为4.25cm(以上述圆形菌碟的中心点为圆心的半径)，生防菌ND11与水稻纹枯病菌交界处形成明显透明圈，而对照处滤纸片周围并无透明圈形成。

因此，从上述平板拮抗试验结果可知：本发明的生防菌ND11对水稻纹枯病菌具有明显的拮抗活性(经计算，本发明的生防菌ND11对水稻纹枯病菌的抑制率为74.12％)。

六、本发明生防菌ND11对水稻纹枯病的温室防病试验结果

取参试水稻种子(日本晴，由南京农业大学-植物与微生物互作实验室保存)，按常规方法浸种、催芽后播种于塑料盆(85cm 70cm60cm)中，置于温室(25～28℃、12L:12D)中培养，待水稻生长至分蘖期(30天左右)时，分别用空白LB培养液和本发明的生防菌ND11的菌液(菌液活菌浓度为 5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml)对其进行喷叶及灌根处理。

具体的喷叶及灌根处理操作为：处理组的每盆灌根40ml生防菌ND11 的悬浮菌液(活菌浓度为活菌浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml)同时每株水稻喷10ml生防菌ND11的悬浮菌液(活菌浓度为活菌浓度为5×10⁹～1× 10¹⁰CFU/ml且含有0.01％wt的表面活性剂Tween-20)，对照组采用40ml灭菌水对每盆水稻进行灌根，同时每株苗喷10ml无菌水(含有0.01％wt的表面活性剂Tween-20)。处理组和对照组均设4个重复，每个重复10株水稻。

在处理组和对照组喷叶和灌根处理4天后，将病原菌接种体接种至上述实验组和对照组的水稻叶鞘上，并喷雾保湿。

28℃保湿，每天观察各组防病情况，待对照组发病率达95％以上后(大约7天左右)开始统计病害情况，并计算生防效果。

关于发病情况的统计，下面介绍水稻纹枯病的病害分级标准：

0级：无病；

1级：病斑面积占叶片面积的12.50％以下；

2级：病斑面积占叶片面积的12.50％-25.00％；

3级：病斑面积占叶片面积的25.00％-50.00％；

4级：病斑面积占叶片面积的50.00％-75.00％；

5级：病斑面积占叶片面积的75.00％以上；

6级：病斑面积占叶片面积的100.00％。

关于“病害严重程度”和“生防效果”的计算公式：

病害严重度＝{∑(病级数×该病级植株数)}/(总植株数×最高病级)；

生防效果＝(对照组病害严重度-处理组病害严重度)/对照组病害严重度；

水稻纹枯病的防病试验结果参见下表1。

表1

	病害严重度(％)	生防效果(％)
			处理组	27.89±3.64	70.69
对照组	95.14±1.20	-

其中，病害严重度的结果为平均值±标准误差(以下皆同)。

从上述表1的温室防病试验结果显示，本发明的生防菌ND11对水稻纹枯病具有显著的防治效果。

七、本发明的生防菌ND11对水稻的防卫相关基因表达水平的影响

为了验证本发明的生防菌ND11防治水稻纹枯病与防卫基因表达的相关性，我们检测了基因OsPR1b、OsNPR1、和ZB8的表达情况。

采用如下实验方法：对水稻植株进行喷叶和灌根处理(处理组采用生防菌ND11的菌悬液，对照组采用灭菌水；具体的喷叶及灌根处理操作参见上述第六部分，具体不再赘述)，4天后，接种水稻纹枯病菌AG-1A，并在接种后第0、12、24、36、48、60h分别取处理组和对照组的叶片样品。

使用

试剂(Invitrogen)提取不同时间点的水稻叶片总RNA。实时定量PCR分析水稻防卫相关基因OsPR1b、OsNPR1、和ZB8的表达量，结果参见图1-图3。

图1为本发明的生防菌剂ND11对水稻诱导型防御反应基因OsPR1b的诱导结果(ND11表示处理组，CK表示对照组)；从图1可以看出，经本发明的生防菌剂ND11预处理后再接种水稻纹枯病菌，可诱导OsPR1b表达水平提高，从而提高了水稻对纹枯病的抗性。

图2为本发明的生防菌剂ND11对水稻广谱抗性相关基因OsNPR1的诱导结果；从图2可以看出，经本发明的生防菌剂ND11预处理后再接种水稻纹枯病菌，可诱导OsNPR1表达水平提高，从而提高了水稻对纹枯病的抗性。

图3为本发明的生防菌剂ND11对PR蛋白相关基因ZB8的诱导结果；从图3可以看出，经本发明的生防菌剂ND11预处理后再接种水稻纹枯病菌，可诱导ZB8表达水平提高，从而提高了水稻对纹枯病的抗性。

综上所述，本发明提供的生防菌ND11(CGMCC No.18423)，可以有效防治水稻纹枯病。

参见上述内容，尤其是第五和第六部分内容，本发明的生防菌ND11能够拮抗水稻纹枯病菌的生长，能够防治水稻纹枯病；而水稻纹枯病与其他农作物的纹枯病其实都是由一类名称为“立枯丝核菌”的真菌感染导致的；因此，本发明的生防菌ND11也能够防治小麦和高粱等其他农作物的纹枯病，这是本领域技术人员可以推测出来的。

另外，在获知本发明的生防菌ND11具有农作物纹枯病的防治效果后，可以将常规的防治纹枯病的杀菌剂(化学药剂)与本发明的生防菌ND11的菌粉进行复配获得菌药组合物。

常规的防治纹枯病的杀菌剂有井冈霉素、噻呋酰胺杀菌剂、己唑醇类杀菌剂、嘧菌酯类杀菌剂等。

因此，可以将上述常规的杀菌剂中的任意一种或几种的组合物与本发明的生防菌ND11的菌粉进行复配获得菌药组合物，本领域技术人员可以根据具体的需求和药效来进行比例的调配，经过有限次试验就可以验证。

此外，在获知本发明的生防菌ND11具有农作物纹枯病的防治效果后，可以将本发明的生防菌ND11与农药上可接受的助剂组合获得防治农作物纹枯病的菌药制剂。

同样的，可以将上述的菌药组合物(杀菌剂与本发明生防菌ND11的菌粉的组合物)与农药上可接受的助剂组合获得防治农作物纹枯病的菌药制剂。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种生防菌，其特征在于：所述生防菌为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18423。

2.一种采用如上述权利要求1的生防菌的菌药组合物，其特征在于：所述菌药组合物包含杀菌剂和权利要求1所述的生防菌的菌粉；所述杀菌剂为井冈霉素、噻呋酰胺类杀菌剂、己唑醇类杀菌剂和嘧菌酯类杀菌剂中任意一种或几种的混合物。

3.一种菌药制剂，其特征在于：所述菌药制剂包含如权利要求1所述的生防菌和农药学上可接受的助剂。

4.一种菌药制剂，其特征在于：所述菌药制剂包含如权利要求2所述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂。

5.如权利要求1所述的生防菌在防治农作物纹枯病方面的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述农作物纹枯病是水稻纹枯病。

7.如权利要求2所述的菌药组合物在防治农作物纹枯病方面的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述农作物纹枯病是水稻纹枯病。

9.如权利要求3所述的菌药制剂在防治农作物纹枯病方面的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述农作物纹枯病是水稻纹枯病。