CN111333667B

CN111333667B - 一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物及其制备方法和抗病毒应用

Info

Publication number: CN111333667B
Application number: CN202010290793.0A
Authority: CN
Inventors: 张文; 吴艳玲; 喻凯; 申立文
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111333667A

Abstract

本发明公开了一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物及其制备方法和抗病毒应用，所述萘酰亚胺类衍生物为1H,3H‑硒呫吨并[2,1,9‑def]异喹啉‑1,3（2H）‑二酮衍生物盐酸盐，其结构式如式（1‑7）中的任意一种所示：

。本发明的化合物1‑7用于与人类宿主细胞II型丝氨酸蛋白酶TMPRSS2启动子区富含鸟嘌呤DNA序列作用，诱导形成G‑四链体；从而抑制流感病毒和冠状病毒的增殖，达到抗病毒目的。通过计算机分子模拟实验显示，化合物1‑7中的共轭母环结构能够与研究靶点中所形成的G‑四分体以π‑π堆积模式进行相互作用，侧链能够很好地与G‑四链体的沟槽结构结合。这项发明对促进含硒杂环的萘酰亚胺衍生物的临床药物研发起到重要作用，尤其对发现新的抗病毒小分子药物具有重要价值。

Description

一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物及其制备方法和抗病毒应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物及其制备方法和抗病毒应用。

背景技术

本发明中的最终分子主体骨架包含重要的萘酰亚胺分子结构，萘酰亚胺是一类发色基团，其衍生物广泛用于分子探针和抗肿瘤药物方面的研究。萘酰亚胺类化合物作为抗肿瘤试剂的研究至今已有四十多年的历史，并取得了许多实质性成果。良好的肿瘤抑制作用、明确的作用靶点以及良好的药物耐受性，使其成为一类很有前途的新型抗肿瘤药物。这类化合物在结构上具有平面刚性的特点，可作为核酸的切断剂、嵌入剂，因而具有抗肿瘤活性。研究证明萘酰亚胺类衍生物能够抑制人类宫颈癌细胞和人口腔上皮癌细胞的生长，同时，DNA和RNA的合成具有一定的抑制作用。但截止目前，还没有以萘酰亚胺为母体结构的临床药物报导。

流感是一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道感染疾病。全世界范围内每年流感重症患者多达300-500万人，每年因流感感染而死亡的人数高达29-65万人。尤其1918年的H1N1世界范围流感，死亡人数高达近5千万人。引发流感的病原体是正粘病毒科的代表种流感病毒。而当下正在世界流行的新型冠状病毒感染性疾病，截止2020年4月10日为止，已经导致5万多人死亡，100余万人感染。研究发现，宿主细胞中有一种丝氨酸蛋白酶TMPRSS2，即一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)，在SARS-CoV、MERS-CoV、塞卡、埃博拉(CoV)冠状病毒以及H7N9甲型流感病毒与某些H1N1亚型甲型流感病毒的感染中起着至关重要的作用，这表明靶向TMPRSS2可能是治疗冠状病毒和一些流感病毒感染病的新型抗病毒策略，是一个极佳的抗病毒药物靶点。TMPRSS2基因位于人体的21号染色体：41464551-41531116，其转录起始位点上游含多个雄激素受体作用元件。TMPRSS2基因编码一个49kDa的蛋白。TMPRSS2主要表达于前列腺，在肺、肝、肾、结肠和胰腺等器官也有一定的表达。

某些亚型的流感病毒(HA连接肽含单个碱性氨基酸)血凝素前体合成完毕后，从内质网、高尔基体向细胞膜转运的过程中，TMPRSS2可在血凝素HA1和HA2亚基之间连接肽上的碱性氨基酸处裂解血凝素，裂解后的血凝素HA1、HA2亚基以二硫键相连。血凝素的裂解、活化是流感病毒获得感染力的必要条件。而在某些冠状病毒，比如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，进入宿主细胞，首先和受体结合，然后，在宿主细胞TMPRSS2帮助下，降解病毒刺突蛋白(Spike protein，S-蛋白)，加速病毒与宿主细胞的融合，进入宿主细胞，复制(增殖)，在新病毒在宿主细胞包装和脱离宿主细胞过程中，这种酶TMPRSS2都起着关键作用。

抗流感病毒感染的TMPRSS2抑制剂：抑肽酶是一种从牛肺部分离得到的多肽，抑肽酶能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶活性，临床上主要用于预防和治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血等疾病。抑肽酶具有TMPRSS2活性，因此可以抑制部分流感病毒感染。抑肽酶喷雾剂作为抗流感药在俄罗斯已用于临床流感感染治疗。

盐酸溴己新是一个用于治疗急性及慢性支气管炎、哮喘、支气管扩张、肺气肿等多种呼吸道疾病的药物。有研究显示盐酸溴己新能够强烈抑制TMPRSS2活性(IC₅₀＝0.75μM)，并且在小鼠体内表现出良好的抗前列腺癌效果。作为已上市的药物，盐酸溴己新无明显毒副作用，因此具备发展为抗流感药物的潜力。

丝氨酸酶抑制剂卡莫司他和萘莫司他在临床上主要用于治疗胰腺炎、术后逆流性食管炎及肝纤维症。研究发现卡莫司他在细胞水平能抑制流感病毒增殖，在小鼠实验中，卡莫司他也表现出良好的抗流感效果。

丝氨酸酶抑制剂AEBSF不仅能在细胞水平有效降低流感病毒滴度，在小鼠模型中，AEBSF预处理也能降低H1N1(A/PR8/34)感染引起的体重下降。此外，3-脒基苯丙氨酰衍生物和苯甲脒衍生物在体外能有效抑制TMPRSS2活性及流感病毒H1N1(A/Hamburg/5/2009)复制。另有一些蛋白类TMRPSS2抑制剂如PAI-1、HAI-2在细胞水平和动物水平都对H1N1(A/PR8/34)感染表现出良好的抑制作用。但以上化合物或蛋白均为广谱的丝氨酸酶抑制剂，因此在体内可能会引起严重的毒副作用，比如使用抑肽酶有肾衰竭、心脏病、中风的风险，目前一些国家和地区已禁售或限制销售抑肽酶。

等人曾针对TMPRSS2设计了一个肽偶联吗啉低聚物(PPMO)，该化合物可靶向识别TMPRSS2 pre-mRNA并导致其错误剪切，该化合物是第一个针对TMPRSS2设计的化合物，其在细胞水平能将流感病毒(H1N1A/Memphis/14/96)滴度降低100-1000倍。

靶向G-四链体的小分子化合物：自G-四链体被发现以来，科学家们一直致力于寻找靶向G-四链体的化合物。目前已发现的能作用于G-四链体的小分子化合物包括喹啉衍生物、双芳基化合物、吖啶类化合物、异喹啉衍生物、喹唑啉衍生物、卟啉及其衍生物、端粒霉素及其衍生物、萘酰亚胺类化合物、有机-金属配合物、氟代喹诺酮衍生物等等。这些化合物大多具有一个大的芳香共轭平面，这个大的芳香平面有利于化合物以π-π堆叠的方式结合与G-四分体表面，从而稳定G-四链体，同时可能阻止化合物非特异性地嵌入B-DNA中，提升化合物的选择性。除这个大的芳香共轭平面外，化合物的侧链基团对其与G-四链体的结合力也有较大的影响，一些侧链基团可以嵌入G-四链体的沟槽，从而提升G-四链体结构的稳定性。Quarfloxin(CX-3543)是第一个进入二期临床的G-四链体配体，但由于生物利用度低而终止临床试验。Sami研究组发现，用蒽环代替萘酰亚胺中的萘环结构，可以增加萘酰亚胺类化合物嵌入DNA的能力，提高其对于多种实体瘤的细胞毒性，表明蒽环结构在以后的抗肿瘤活性化合物的设计中具有良好的前景；且根据文献报道，当化合物侧链上的氮原子和环上的氮原子被3个亚甲基间时，它与G-四链体的结合能力最好。基于以上研究，张文等还对萘酰亚胺母环和侧链的取代基进行了不同程度的修饰，并在此基础上研究药物分子并取得了较突出的成就。张文等曾发现含硫稠环萘酰亚胺(苯并硫杂蒽)衍生物能稳定端粒G-四链体或诱导端粒G-四链体构象改变，其中活性最强的衍生物能将端粒G-四链体的Tm值提升29.8℃，并且这类化合物能显著抑制端粒酶活性及有效杀伤SGC7901等肿瘤细胞，其中一个衍生物对SGC7901细胞的IC₅₀值低达0.53μM。

硒是一种人和动物体内维持正常的生理活动所必需的有益的微量元素，具有十分重要的生物学功能。有机硒类化合物相较于无机硒类对机体的免疫激活作用更显著，毒性更低，环境污染更小等特点，近年来已经得到了广泛的关注和大量的研究，其中在人体免疫、抗肿瘤及防治心血管疾病等领域的应用最富有前景。大量试验研究表明硒在肿瘤的预防与治疗上起着至关重要的作用。

分子模拟结果表明一种1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐具有一个大的疏水性共轭平面，可以与G-四链体的G-tetrad平面上的鸟嘌呤通过π-π堆积方式结合，稳定G-四链体的存在；质子化胺基的边链的引入一方面保留了化合物本身的大平面疏水中心，另一方面又增加了化合物的水溶性，同时质子化的边链还可以通过静电作用和G-四链体的沟槽、loop以及带负电荷的磷酸骨架作用，进一步稳定G-四链体的结构。

所以截止目前，没有以G-四链体为靶点的小分子药物在临床上应用；没有本发明目标小分子的报道；没有以TMPRSS2核酸为靶点的小分子研究报道；也没有通过小分子调控TMPRSS2核酸，研发抗病毒药物的报道。

因此设计、合成及开发靶向TMPRSS2核酸的含硒小分子药物，抑制病毒进入宿主细胞，病毒复制，以期找到较理想的靶向TMPRSS2抗病毒的目标药物分子已成为众多研究者追逐的目标。

发明内容

基于上述材料及我们先前的研究成果，针对目前此类研究中出现的不足，本发明提供了一种新型的含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物，即一种1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3

(2H)-二酮衍生物盐酸盐，并将其用于与宿主细胞蛋白酶TMPRSS2基因启动子区富含鸟嘌呤DNA序列作用，下调基因的表达，阻止流感和冠状病毒进入宿主细胞，从而防止病毒的增殖。此类化合物能够在一定程度上选择性地与上述研究靶点相互作用；并且化合物TMPRSS2基因富含鸟嘌呤序列具有较强的亲和力，△Tm值高达20.3℃；强烈抑制TMPRSS2基因表达；有效抑制病毒的复制。这项发明对发现新的抗病毒含硒小分子药物具有重要价值。

本发明采用的技术方案是：

所述含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物为1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐，其结构式如式(1-7)中的任意一种所示：

其中:

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

如步骤(i)反应中，1-溴-2-硝基苯和硒粉发生Ullmann偶联反应得到化合物8；然后在步骤(ii)反应中，化合物8经锌粉还原得到化合物9；接着在步骤(iii)反应中，化合物9与4-溴-1,8-萘酐发生亲核取代反应得到6-(2-氨基苯硒基)-1H,3H-苯并[de]异苯并吡喃-1,3(2H)-二酮中间体，该中间体不需经过纯化处理，可直接当作下一步的反应物，与亚硝酸异戊脂反应(也就是步骤(iv)反应中)，重氮化环合后得到的化合物10；在步骤(v)反应中，化合物10与取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁发生亲核加成-消除反应得到化合物1a-7a，得到的化合物1a-7a与氯化氢气体反应生成合成目标化合物1-7，也就是1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐。其合成路线如下：

其中取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁中的取代基R₁与通式(la-7a)中对应的取代基R₁相同，也就是说取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁为N’,Ν’-二甲基丙二胺、N’,Ν’-二乙基丙二胺、N’,Ν’-二乙醇基丙二胺、3-(1-吡咯烷基)丙胺、3-(1-哌啶基)丙胺、3-(1-吗啉基)丙胺、3-(1-哌嗪基)丙胺，分别能够制得相应的化合物1a-7a。化合物1a-7a中的R₁分别如下所示；

其中化合物1-7中的R分别如下所示；

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

1)亲核取代(步骤i):将硒粉和2-溴硝基苯、碳酸铯、氯化亚铜、1,10-菲咯啉一水合物加到三口烧瓶中，然后加入1,4-二氧六环，在氮气保护下，升温至120℃反应20小时，TLC监测反应进程，原料反应完全后停止加热，冷却反应液，用硅藻土过滤，除去未反应完全的硒粉，滤液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，所得有机层再经无水硫酸镁干燥、过滤，收集滤液并用旋转蒸发仪浓缩后，获得暗色稠状液体。最后，用200～300目硅胶进行柱色谱分离，得到褐色针状结晶中间体双(2-硝基苯)二硒醚(即化合物8)；

2)还原反应(步骤ii)：将步骤(i)中得到的中间体双(2-硝基苯)二硒醚加到烧瓶中，然后加入乙酸溶剂，加热到75℃使其完全溶解，然后缓慢加入锌粉，直到反应液的颜色不再变化，整个反应大概在十五分钟内完成(TLC监测反应进程)。此反应对条件比较苛刻，温度过高、反应时间过长及锌粉的大量剩余均会导致产物收率的降低。反应结束后，将反应液倒入布氏漏斗快速过滤，除去稍过量的锌粉，滤液倒入大量水中，并用10％的氢氧化钠溶液将溶液调至中性左右，此时滤液中会有大量的沉淀析出，过滤，并用水和乙醇分别冲洗滤饼三次，干燥后得到淡白色固体(即化合物9)；

3)亲核取代反应(步骤iii)：将步骤(ii)获得的化合物9和4-溴-1,8-萘酐加入到单口瓶中，再加入DMF使其完全溶解，在氮气的保护下，加热到75℃，反应2小时，TLC检测原料反应完全，且有一明显新点生成，收集产品直接进行下一步反应。

4)重氮化环合反应(步骤iv)：将步骤(iii)收集的产品升高温度至80℃，在氮气保护下，加入亚硝酸异戊酯进行重氮化闭环，整个反应持续大约2小时；经TLC监测反应完全后，冷却反应液，倒入分液漏斗中进行萃取操作，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，以除去溶剂DMF。所得有机层再经无水硫酸镁干燥、过滤，收集滤液，加入适量硅胶旋转蒸发仪旋干，用柱色谱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:8,v/v)，得到浅黄色固体(即化合物10)；

5)亲核加成-消除反应(步骤v)：将步骤(iv)得到的化合物10和取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁加入到反应瓶中，再加入适量无水乙醇使其完全溶解，加热搅拌反应至反应完全(TLC检测反应进程)，冷却，拌硅胶，真空旋蒸除去溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝20:1,v/v)纯化，分别得到相应的化合物1a-7a，产物颜色黄色偏红；

6)叔胺的盐酸化反应(步骤vi)：将反应式中步骤(v)得到的化合物1a-7a分别溶解于适量的二氯甲烷中，然后通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应，会有大量沉淀产生，反应完全后，抽滤，用二氯甲烷溶液洗涤，得到的盐酸盐即是目标化合物1-7。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于步骤(i)中TLC监测用溶剂为体积比为2：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂，过柱色谱分离用洗脱剂为体积比为5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于步骤(ii)中TLC监测用溶剂为体积比为3：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于步骤(iii)中TLC监测用溶剂为体积比为3：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于步骤(iv)中的TLC监测用试剂为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂，过柱色谱分离用洗脱剂为体积比为8：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于步骤(v)中的TLC监测用试剂为体积比为30：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，过柱色谱分离用洗脱剂为体积比为50：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐的制备方法，其特征在于步骤(vi)中的TLC监测用试剂为体积比为20：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，过柱色谱分离用洗脱剂为体积比为30：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂。

所述的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐在制备抗病毒药物中的应用：在基因分子水平上，所述目标化合物与II型丝氨酸蛋白酶TMPRSS2基因启动子区富含鸟嘌呤DNA序列作用的研究；及抗病毒效果研究。

通过采用上述技术，本发明的有益效果主要体现如下：

1)本发明得到的七种1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐，其制备工艺简单、原料易得，后处理方便，七个目标化合物收率和纯度高，其纯度高达96％以上，其结构通过核磁和质谱均得以验证；

2)本发明通过应用七种1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐对TMPRSS2基因启动子区富含鸟嘌呤DNA序列作用进行了体外DNA分子水平上的选择性结合能力的研究，凝胶电泳实验(EMSA)、紫外熔融实验(T_m值)结果表明：所测目标化合物与靶DNA序列均具有不同程度的结合能力；

3)本发明得到的七种1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐从分子模拟水平上对所选研究序列进行了选择性结合能力的研究，计算机分子模拟结果显示：化合物1-7中的共轭母体结构能够与富含鸟嘌呤DNA序列所形成的G-四分体以π-π堆积模式进行相互作用，其侧链能够较好地与G-四链体的沟槽结构结合。因此这项发明对筛选含硒化合物的抗病毒药物研究具有实质性的意义。

附图说明

图1为化合物1-7、PEG200(阳性对照)及1％DMSO(空白对照)诱导TMPRSS2基因G-四链体形成及稳定G-四链体的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果图；

图2为化合物1-7与TMPRSS2基因G-四链体DNA的分子对接结果图；

图3为化合物1、3、5和7分别下调TMPRSS2基因mRNA表达的结果图；在图3中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，P表示统计学差异性水平；

图4为化合物1、3、5和7分别下调TMPRSS2基因蛋白表达的结果图；

图5A为化合物1、3、5和7、奥司他韦及卡莫司他分别抑制流感病毒的增殖结果图；在图5A中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，P表示统计学差异性水平；

图5B为化合物1、3、5和7分别在8微摩尔浓度下抑制流感病毒PR8感染引起的细胞病变结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

化合物1-7制备的步骤如下：

1)Ullmann偶联反应：在氮气保护条件下，向配有回流冷凝管的100mL二口圆底烧瓶中依次加入2-溴硝基苯20.0mmol，硒60.0mmol，氯化亚铜5mmol，1,10-菲咯啉5mmol，碳酸铯80mmol，1,4-二氧六环60mL。然后，在110℃回流搅拌下反应24h，反应结束后，冷却至室温，用硅藻土过滤，除去未反应完全的硒粉，滤液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，所得有机层再经无水硫酸镁干燥、过滤，收集滤液并用旋转蒸发仪浓缩后，获得暗色稠状液体。最后，用200～300目硅胶，以石油醚：乙酸乙酯＝5：1(v/v)为洗脱液对暗色稠状液体进行柱色谱分离，得褐色针状结晶(化合物8)3.31g，收率为82％，熔点：210～212℃。¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ8.40(dd,J＝8.2,1.3Hz,2H,3-H,3'-H),7.89(dd,J＝8.1,1.1Hz,2H,6-H,6'-H),7.74-7.69(m,2H,5-H,5'-H),7.62-7.57(m,2H,4-H,4'-H).MS-EI(m/z):358[(M-NO₂)⁺],312[(M-2NO₂)⁺],251[(M-C₆H₄N₂O₃)⁺].

2)还原反应：将3.0g(6.41mmol)化合物8加入到50mL的单口烧瓶中，然后加入乙酸30mL，加热到75℃使其完全溶解，然后缓慢加入锌粉，直到反应液的颜色不再变化，整个反应大概在十五分钟内完成。此反应对条件比较苛刻，温度过高、反应时间过长及锌粉的大量剩余均会导致产物收率的降低。反应结束后，将反应液倒入布氏漏斗快速过滤，除去稍过量的锌粉，滤液倒入大量水中，并用10％的氢氧化钠溶液将溶液调至中性左右，此时滤液中会有大量的沉淀析出，过滤，并用水和乙醇分别冲洗滤饼三次，干燥后得到淡白色固体(化合物9)2.28g，产率为87％，熔点248～250℃。

3)亲核取代反应：将4-溴-1,8-萘酐(2.97g，10.71mmol)，化合物9(2g，4.28mmol)，在氮气的保护下，放入50mL三口瓶中，加入30mL DMF，反应2小时，TLC检测原料反应完全，且有一明显新点生成，收集产品直接进行下一步反应。

4)重氮化环合反应：将上述步骤收集的产品升高温度至75℃，在氮气保护下，加入亚硝酸异戊酯(4.32mL，32.13mmol)进行重氮化闭环，整个反应持续大约2小时；经TLC监测反应完全后，冷却反应液，倒入分液漏斗中进行萃取操作，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，以除去溶剂DMF。所得有机层再经无水硫酸镁干燥、过滤，收集滤液并用旋转蒸发仪浓缩至一定体积后，加入6g硅胶，继续旋干，柱色谱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:8,v/v)得到浅黄色化合物10纯品4.15g，产率为69％，纯度(高效液相色谱检测)：96.5％，熔点285～287℃。¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.53(m,3H,12-H,4-H,5-H),8.26(m,11H,1-H),8.07(m,1H,10-H),7.79(m,11H,7-H),7.50(m,2H,8-H,9-H).MS-EI:calculatedm/z for C₁₈H₈O₃Se:351.96；found:352[M]⁺,308[(M-CO₂)⁺],280[(M-C₂O₃)⁺].

5)亲核加成-消除反应：将化合物10(3.51g,10mmol)溶入70mL无水乙醇中，在氮气的保护条件下，分别加入15mmol取代胺类化合物，加热搅拌反应至无原料(TLC检测反应进程)，冷却至室温，拌硅胶，真空旋蒸除去溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1,v/v)纯化，得到相应的化合物1a-7a，产物颜色黄色偏红，平均产率约为92％。采用上述制备方法，不同取代胺类化合物制得的相应化合物1a-7a结果分别如实施例1-7所示。

实施例1:化合物1a:2-(3-(二甲氨基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮

化合物10与N’,Ν’-二甲基丙二胺反应(摩尔比1:1.5)，获得黄色固体，R_f:0.22(二氯甲烷:甲醇＝20:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：95.1％，熔点:184～186℃。¹HNMR(500MHz,CDCl₃):δ8.52(d,J＝8.1Hz,11H,4-H),8.28(d,J＝7.8Hz,1H,12-H),8.19(d,J＝8.2Hz,1H,11-H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H,5-H),7.64(d,J＝7.8Hz,1H,7-H),7.45(d,J＝7.5Hz,1H,10-H),7.39(t,J＝7.2Hz,1H,8-H),7.34(t,J＝7.3Hz,1H,9-H),4.25-4.18(m,2H,CONCH₂),2.58(t,J＝7.4Hz,2H,CH₂N⁺),2.37(s,6H,N(CH₃)₂),2.06-1.95(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).

实施例2:化合物2a:2-(3-(二乙胺基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮

化合物10与N’,Ν’-二乙基丙二胺反应(摩尔比1:1.5)，获得黄色固体，R_f:0.21(二氯甲烷:甲醇＝20:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：96.0％，熔点:154～156℃。¹HNMR(500MHz,CDCl₃):δ8.52(d,J＝8.2Hz,11H,4-H),8.28(d,J＝7.8Hz,1H,12-H),8.18(d,J＝8.3Hz,1H,11-H),8.14(d,J＝7.9Hz,1H,5-H),7.63(t,J＝6.8Hz,1H,7-H),7.48-7.42(dd,J＝1.2,7.6Hz,1H,10-H),7.42-7.36(m,1H,8-H),7.36-7.30(m,1H,9-H),4.24-4.15(m,2H,CONCH₂),2.78-2.62(m,6H,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),1.98(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N),1.15-1.05(m,6H,2×CH₃).

实施例3:化合物3a:2-(3-(二乙醇氨基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮

化合物10与N’,Ν’-二乙醇基丙二胺反应(摩尔比1:1.5)，获得橘黄色固体，R_f:0.19(二氯甲烷:甲醇＝15:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：97.8％，熔点:102～104℃。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ8.28-8.17(m,3H,11-H,12-H,5-H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H,5-H),7.72(d,J＝7.8Hz,1H,7-H),7.60-7.55(m,1H,10-H),7.40-7.33(m,2H,8-H,9-H),3.99-3.91(m,2H,CONCH₂),3.47(t,J＝6.3Hz,4H,2×CH₂OH),2.68-2.54(m,6H,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),1.81-1.71(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).

实施例4:化合物4a:2-(3-(1-吡咯烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮

化合物10与3-(1-吡咯烷基)丙胺反应(摩尔比1:1.5)，获得黄色固体，R_f:0.20(二氯甲烷:甲醇＝20:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：96.3％，熔点:215～217℃。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ8.33(d,J＝8.5Hz,1H,4-H),8.30-8.24(m,2H,11-H,12-H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H,5-H),7.80(d,J＝7.8Hz,1H,7-H),7.67-7.61(m,1H,10-H),7.43-7.38(m,2H,8-H,9-H),4.04(t,J＝6.7Hz,2H,CONCH₂),3.50(m,2H,⁺NCH₂),3.23-3.18(m,2H,⁺NCH₂),2.96(m,2H,CH₂N⁺),2.12-2.04(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N),2.01-1.83(m,4H,2×CH₂(cyclo)).

实施例5:化合物5a:2-(3-(1-哌啶烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮

化合物10与3-(1-哌啶基)丙胺反应(摩尔比1:1.5)，获得黄色固体，R_f:0.23(二氯甲烷:甲醇＝20:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：97.2％，熔点:157～159℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H,4-H),8.25(d,J＝7.8Hz,1H,12-H),8.13(dd,J＝14.9,8.2Hz,2H,11-H,5-H),7.60(d,J＝7.8Hz,1H,8-H),7.43(d,J＝7.5Hz,1H,10-H),7.40-7.35(m,1H,8-H),7.35-7.31(m,1H,9-H),4.20(t,J＝7.2Hz,2H,CONCH₂),2.71-2.48(m,6H,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),2.11-2.00(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N),1.66(m,4H,2×CH₂(cyclo)),1.45(m,2H,CH₂CH₂CH₂(cyclo)).

实施例6:化合物6a:2-(3-(1-吗啉基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮，

化合物10与3-(1-吗啉基)丙胺反应(摩尔比1:1.5)，获得黄色固体，R_f:0.20(二氯甲烷:甲醇＝20:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：98.4％，mp:131～133℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.51(d,J＝8.2Hz,1H,4-H),8.27(d,J＝7.8Hz,1H,12-H),8.17(t,J＝8.0Hz,1H,11-H),8.14(d,J＝7.8Hz,1H,5-H),7.66-7.61(m,1H,7-H),7.44(dd,J＝7.6,1.3Hz,1H,10-H),7.41-7.36(m,1H,8-H),7.33(m,1H,9-H),4.27-4.18(m,2H,CONCH₂),3.65(t,J＝4.4Hz,4H,CH₂OCH₂),2.53(m,6H,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),2.03-1.91(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).

实施例7:化合物7a:2-(3-(1-哌嗪烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮，

化合物10与3-(1-哌嗪烷基)丙胺反应(摩尔比1:1.5)，获得橘黄色固体，R_f:0.19(二氯甲烷:甲醇＝20:1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：96.5％，熔点:245～247℃。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆):δ8.58(s,1H,NH),8.31(d,J＝8.5Hz,1H,4-H),8.25(m,2H,11-H,12-H),8.05(d,J＝7.8Hz,1H,5-H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H,7-H),7.66-7.59(m,1H,10-H),7.43-7.35(m,2H,8-H,9-H),4.01(t,J＝7.7Hz,2H,CONCH₂),3.03(m,4H,CH₂NHCH₂),2.56(m,4H,2×⁺NCH₂),2.49(m,2H,CH₂N⁺),1.84-1.71(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).

在以下的实施例8-14中，目标化合物1-7的合成方法为：

将经上述合成的含有二甲氨基、二乙胺基、二乙醇胺基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基的七个化合物1a-7a分别溶解于二氯甲烷中，然后通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌半小时。可以发现在通入氯化氢气体的过程中逐渐变浑浊，反应完全后，抽滤，用二氯甲烷溶液洗涤，得到盐酸盐即是目标化合物1-7。

实施例8:化合物1：2-(3-(二甲氨基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物1的收率为75.4％。

橙色固体，R_f:0.21(二氯甲烷:甲醇＝15/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：98.1％，熔点:270～272℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ6.90(m,4H,11-H,2-H,4-H,5-H),6.75(m,2H,7-H,10-H),6.49(m,2H,8-H,9-H),3.38(m,2H,CONCH₂),3.11(m,2H,CH₂N⁺),2.89(s,6H,2×CH₃),1.73(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).ESI-Mass:calcd m/z for C₂₃H₂₁ClN₂O₂Se:472.05；found:437.20[M-Cl]⁺.Anal.Calcd for C₂₃H₂₁ClN₂O₂Se:C,58.55；H,4.49；N,5.94；Se,16.73；found:C,58.38；H,4.50；N,5.91；Se,16.69.

实施例9:化合物2：2-(3-(二乙胺基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物2的收率为83.0％。

橙黄色固体，R_f:0.20(二氯甲烷:甲醇＝15/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：95.9％，熔点:220～222℃。¹H NMR(500MHz,MeOD):δ8.13(d,J＝8.2Hz,1H,5-H),8.04-8.01(m,1H,12-H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H,11-H),7.92(d,J＝7.8Hz,1H,5-H)),7.44(t,J＝5.8Hz,1H,7-H),7.39(m,1H,10-H),7.34-7.29(m,2H,8-H,9-H),4.16-4.10(m,2H,CONCH₂),3.33(m,6H,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),2.19-2.14(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N),1.37(t,J＝7.3Hz,6H,2×CH₃).ESI-Mass:calcd m/z for C₂₅H₂₅ClN₂O₂Se:500.08；found:465.10[M-Cl]⁺.Anal.Calcdfor C₂₅H₂₅ClN₂O₂Se:C,60.07；H,5.04；N,5.60；Se,15.80；found:C,60.01；H,5.07；N,5.65；Se,15.75.

实施例10:化合物3：2-(3-(二乙醇氨基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物3的收率为78.4％。

黄色固体，R_f:0.18(二氯甲烷:甲醇＝12/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：98.6％，熔点:198～200℃。¹H NMR(500MHz,MeOD):δ8.06(d,J＝8.1Hz,1H,4-H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H,12-H),7.91-7.82(m,2H,11-H,5-H),7.39-7.32(m,2H,7-H,10-H),7.28(m,2H,8-H,9-H),4.11(t,J＝6.6Hz,2H,CONCH₂),4.02-3.93(m,4H,2×CH₂OH),3.53-3.43(m,6H,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),2.29-2.19(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).ESI-Mass:calcd m/z for C₂₅H₂₅ClN₂O₄Se:532.07；found:497.10[M-Cl]⁺,519.1[M-Cl+Na]⁺.Anal.Calcd for C₂₅H₂₅ClN₂O₄Se:C,56.45；H,4.74；N,5.27；Se,14.85；found:C,56.62；H,4.77；N,5.21；Se,14.90.

实施例11:化合物4：2-(3-(1-吡咯烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物4的收率为75.8％。

黄色固体，R_f:0.19(二氯甲烷:甲醇＝15/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：97.1％，熔点:219～221℃。¹H NMR(500MHz,D₂O):δ6.91(m,8H,11-H,12-H,4-H,5-H,7-H,9-H,8-H,11-H),3.74-2.69(m,8H,CONCH₂,2×⁺NCH₂,CH₂N⁺),2.21-1.49(m,6H,NCH₂CH₂CH₂N,2×CH₂(cyclo)).ESI-Mass:calcd m/z for C₂₅H₂₃ClN₂O₂Se:498.06；found:463.10[M-Cl]⁺.Anal.Calcd for C₂₅H₂₃ClN₂O₂Se:C,60.31；H,4.66；N,5.63；Se,15.86；found:C,60.16；H,4.62；N,5.68；Se,15.79.

实施例12:化合物5：2-(3-(1-哌啶烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物5的收率为73.9％。

浅黄色固体，R_f:0.22(二氯甲烷:甲醇＝20/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：97.6％，熔点:231～233℃。¹H NMR(500MHz,MeOD):δ8.37-7.66(m,4H,11-H,12-H,4-H,5-H),7.30(m,4H,7-H,8-H,9-H,10-H),4.10(m,2H,CONCH₂),3.64(m,2H,⁺NCH₂),3.26-3.03(m,4H,⁺NCH₂,CH₂N⁺),2.20(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N),2.07-1.49(m,6H,3×CH₂(cyclo)).ESI-Mass:calcd m/z for C₂₆H₂₅ClN₂O₂Se:512.08；found:477.10[M-Cl]⁺.Anal.Calcd forC₂₆H₂₅ClN₂O₂Se:C,61.00；H,4.92；N,5.47；Se,15.42；found:C,61.26；H,4.90；N,5.50；Se,15.37.

实施例13:化合物6：2-(3-(1-吗啉基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物6的收率为71.2％。

黄色固体，R_f:0.19(二氯甲烷:甲醇＝15/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：96.6％，熔点:223～225℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.97(m,4H,11-H,12-H,4-H,5-H),6.79(m,2H,7-H,10-H),6.61-6.52(m,2H,8-H,9-H),4.00(m,4H,CH₂OCH₂),3.46(m,2H,CONCH₂),3.29(m,4H,2×⁺NCH₂),3.11(m,2H,CH₂N⁺),1.78(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).ESI-Mass:calcd m/zfor C₂₅H₂₃ClN₂O₃Se:514.06；found:479.10[M-Cl]⁺.Anal.Calcd for C₂₅H₂₃ClN₂O₃Se:C,58.43；H,4.51；N,5.45；Se,15.37；found:C,58.56；H,4.54；N,5.42；Se,15.44.

实施例14:化合物7：2-(3-(1-哌嗪烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐：

以化合物10为起始原料计，合成化合物7的收率为68.5％。

橘黄色固体，R_f:0.18(二氯甲烷:甲醇＝15/1,v/v)。纯度(高效液相色谱检测)：96.3％，熔点:247～249℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ7.02(m,4H,11-H,12-H,4-H,5-H),6.86-6.76(m,2H,7-H,10-H),6.61(m,2H,8-H,9-H),3.71(m,8H,4×⁺NCH₂),3.52(m,2H,CONCH₂),3.33(m,2H,CH₂N⁺),1.88(m,2H,NCH₂CH₂CH₂N).ESI-Mass:calcd m/z forC₂₅H₂₅Cl₂N₃O₂Se:549.05；found:478.1[M-2Cl-H]⁺,522.1[M-2Cl+2Na-H]⁺.Anal.Calcd forC₂₅H₂₅Cl₂N₃O₂Se:C,54.66；H,4.59；N,7.65；Se,14.37；found:C,54.47；H,4.57；N,7.61；Se,14.42.

实施例15:本发明制得的七个化合物与TMPRSS2基因启动子区富含鸟嘌呤DNA序列G-四链体作用的紫外熔融温度实验结果(表1)

(1)溶液配制：

2×TE buffer(200mM KCl)：称取10.8g Tris，1g EDTA，用300mL ddH₂O溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，定容至500mL；

2×TE buffer(10mM KCl)：称取10.8g Tris，0.75g EDTA，0.37g KCl，用300mLddH₂O溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，定容至500mL；

2×TE buffer(200mM CsCl)：称取10.8g Tris，0.75g EDTA，16.84g CsCl，用300mL ddH₂O溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，定容至500mL。

(2)紫外熔融分析：

1)参比对照样品的配制：取500μL 2×TE buffer(10mM KCl)，100μL DNA(TMPRSS2-G，10μM)，10μL DMSO，加ddH₂O补足至1mL；混匀后于100℃变性10min,然后自然冷却至室温后保存至4℃冰箱待用；

不同浓度的化合物1-7样品配制：取500μL 2×TE buffer(10mM KCl)，100μL DNA(TMPRSS2-G，10μM)，10mM浓度的化合物1-7的DMSO溶液1μL、2μL或4μL，加ddH₂O补足至1mL；混匀后于100℃变性10min，然后自然冷却至室温后保存至4℃冰箱待用，分别配制得到1μM、2μM或4μM浓度的化合物1-7；

2)1μM DNA样品配制：配制含1μM DNA(TMPRSS2-G)溶液，配方为：500μL2×TEbuffer(10mM KCl)，100μL DNA(10μM)，用ddH2O补足至1mL；混匀后于100℃变性10min，然后自然冷却至室温后保存至4℃冰箱待用；

3)将DNA样品注入光程为1cm石英比色皿，设置参数为：测量波长：295nm，温度范围：25-95℃，升温速率：1℃/min；然后点击开始测试。

(3)TMPRSS2基因启动子区富含鸟嘌呤(G)靶DNA：TMPRSS2-G(富含鸟嘌呤(G)序列)5′-CCTGGGCGGGCGGGGGCGGGGGCGGCGGGAGGAGG-3′。

表1.1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐提升TMPRSS2 G-四链体的ΔTm值(℃)

紫外熔融实验(熔融温度(Tm)分析)是测定药物分子和靶DNA作用强度和确定靶DNA是否形成G-四链体的技术手段。本发明通过紫外熔融实验发现2-(3-(1-吗啉基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐能显著提升TMPRSS2-G形成的G-quadruplex的热稳定性(参见表1结果)，并且，在295nm检测条件下，能形成‘倒S’G-四链体典型熔融曲线。在化合物1-7分别在4μM浓度下，这些化合物均能将TMPRSS2G-quadruplex的Tm提高10℃以上，最高提升20.3℃。说明本发明的化合物能较强和TMPRSS2 G-quadruplex作用，稳定G-quadruplex结构。

实施例16:本发明制得的七个化合物1-7诱导TMPRSS2基因G-四链体形成及稳定G-四链体的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果。

(1)溶液配制：

5×TBE buffer：称取27g Tris，1g EDTA，13.75g硼酸，用ddH₂O溶解并定容至500mL；

5×TBE buffer(250mM KCl)：称取27g Tris，1g EDTA，13.75g硼酸，18.6g KCl用ddH₂O溶解并定容至500mL；

1×TBE buffer：取200mL 5×TBE buffer用ddH₂O定容至1L；

1×TBE buffer(50mM KCl)：取200mL 5×TBE buffer(250mM KCl)用ddH₂O定容至1L；

2×TE buffer：称取10.8g Tris，1g EDTA，用300mL ddH₂O溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，定容至500mL；

2×TE buffer(200mM KCl)：称取10.8g Tris，0.75g EDTA，7.45g KCl，用300mLddH₂O溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，定容至500mL；

DNA溶液：用ddH₂O将DNA稀释至10或20μM；分装后于-20℃冻存。

(2)凝胶电泳：

1)DNA测试样品配制：在200μL PCR管中按1μLTMPRSS2-G(10μM)和1μL TMPRSS2-C(10μM)，5μL 2×TE buffer(200mM KCl)，0.1μL DMSO或3μL PEG200或1μL化合物1-7的DMSO溶液(该DMSO溶液中的化合物1-7浓度为80mM)，加ddH₂O至10μL，混匀后于100℃变性10min,然后自然冷却至室温；

2)在样品中加入2μL 6×DNAloadingbuffer，混匀；

3)制备含50mM KCl的12％Native-PAGE凝胶；凝胶配方为：ddH₂O 9.9mL，30％Acr-Bis 8mL，5×TBE buffer(含50mM KCl)2mL，10％APS 140μL，TEMED 13μL；灌胶后室温静置40min；

4)120V预电泳30min；

5)取1.5μLDNA测试样品上样含KCl的12％Native-PAGE凝胶，电泳条件为恒压120V，4℃冷凝循环，待溴酚蓝泳动至凝胶底部时停止电泳；

6)取出凝胶，用ddH₂O漂洗两次，再用SYBR GOLD染色30min,然后置于凝胶成像仪中成像。

(3)TMPRSS2基因启动子区富含鸟嘌呤(G)/胞嘧啶(C)的靶DNA：TMPRSS2-G(富含鸟嘌呤(G)序列)5′-CCTGGGCGGGCGGGGGCGGGGGCGGCGGGAGGAGG-3′，互补链TMPRSS2-C(富含胞嘧啶(C)序列)，5′-CCTCCTCCCGCCGCCCCCGCCCCCGCCCGCCCAGG-3′

化合物1-7、PEG200及DMSO空白对照分别诱导TMPRSS2基因G-四链体形成及稳定G-四链体的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果如图1所示。通过EMSA实验，发现在2-(3-(1-吡咯烷基)丙基)-1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮盐酸盐存在下，TMPRSS2-G(富含鸟嘌呤(G碱基)序列)和TMPRSS2-C富含胞嘧啶(C碱基)序列混合物的退火产物在非变性凝胶上形成了一条滞后于双链DNA的条带，并且该条带与PEG200诱导形成的含G-四链体的双链DNA迁移速度基本一致。同加入PEG200类似，加入化合物1-7后同样产生了单链形成的G-四链体和线性的TMPRSS2-C，由此可知苯并杂蒽类化合物也能够稳定TMPRSS2启动子近端单链富含鸟嘌呤(G碱基)序列形成的G-四链体，进而使G-四链体能在双链DNA中稳定存在(参见图1结果)。与PEG200阳性对照相比，在化合物1-7作用下，未转化为G-四链体的B-DNA残留更少，说明此类化合物比PEG200诱导/稳定G-四链体能力更强。同时，在化合物1-7作用下，双链G-四链体形成比例更高，而单链G-四链体所占比例较小，这可能是由于化合物不具备PEG200破坏DNA水化层、减弱双链互补配对的能力，因此在TMPRSS2-G单链形成G-四链体后，G-四链体的侧翼序列仍倾向于与TMPRSS2-C互补配对。

实施例17:本发明制得的七个化合物1-7与TMPRSS2基因G-四链体DNA的分子对接实验结果。

本发明制得的七个化合物1-7与人类染色体端粒26nt DNA序列和27nt、43nt原癌基因c-Myc DNA序列相互作用的计算机分子模拟图

(1)计算方法：Libdock是Discovery Studio软件中一种最为快速的分子对接工具，它根据小分子构象与受体相互作用热点(Hotspot)匹配的原理将这些构象刚性对接到受体的结合口袋中，其最大的优势是速度快。

1)准备配体：小分子化合物1-7通过ChemBioDraw Ultra 11.0软件建立3D分子模型后，导入DS软件中进行加氢和结构优化处理，应用“Prepare Ligands”工具完成配体质子化，赋予CHARMm力场并进行能量优化，循环次数为200，收敛标准是rms 0.1，保存配体小分子化合物文件。

2)定义口袋：受体和配体准备工作完成后，采用Receptor-Ligand Interaction模块中的Define Site工具，以From Current Selection定义口袋，口袋半径为

3)对接：使用Libdock进行对接，设定热点数(Hotspot)为100，对接公差为0.25，运用LibDockScore打分函数对对接结果进行考评分析，得分大于100的对接。

化合物1-7与TMPRSS2基因G-四链体DNA的分子对接结果图如图2所示(化合物1-7的打分结果分别为：124.36、130.73、145.65、139.89、135.02、136.80、150.95)。从附图2中可以看出，化合物1-7的共轭母体结构与靶DNA的G-四分体通过π-π堆积的模式相互作用，氨基侧链能很好的结合在G-四链体DNA的沟槽结构中，且侧链末端带正电的质子化基团还可以与带负电的磷酸骨架形成氢键，增强了化合物与G-四链体的亲和力，运用LibDock Score打分函数对对接结果进行考评分析，其中化合物3、7的打分最高，分别为145.65、150.95，表明这两个个化合物与G-四链体结合的最好。

实施例18:本发明制得的化合物1、3、5和7下调TMPRSS2基因mRNA表达的实验结果。

(1)溶液配制

焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水：量取1L ddH₂O，加入100μL DEPC，置于摇床中剧烈震荡5h，室温放置过夜，高压蒸汽去除DEPC；

75％DEPC乙醇：取25mL无水乙醇与75mL DEPC处理水混匀，4℃保存；

1×TE buffer：称取10.8g Tris，0.75g EDTA，用300mL ddH₂O溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，定容至1000mL，4℃保存；

DMEM完全培养液：每500mL培养液添加50mL FBS，5mL青霉素-链霉素。

(2)细胞培养与药物处理

1)接种Calu-3细胞(人肺腺癌瘤株)至6孔板；

2)待细胞长至80％铺满时，每孔加入20μL DMSO或不同浓度的化合物1、3、5或7，继续培养24h。

(3)RNA的提取与定量

1)从培养箱取出细胞，吸弃培养液，每孔加入1mL Trizol(6孔板)，室温放置10min；

2)收集裂解产物至1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，置于室温放置15min；

3)取上层水相400μL至一新的离心管中，加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，置于室温放置10min；

4)4℃，13000g离心10min，弃去上清；

5)加入1mL 75％DEPC乙醇，温和震荡离心管，洗涤沉淀；

6)4℃，8000g离心5min，弃上清；

7)室温晾干沉淀，用DEPC处理水溶解RNA；

8)取2μL RNA样品用198μL 1×TE buffer稀释；

9)用紫外分光光度计测定RNA样品OD₂₃₀，OD₂₆₀，OD₂₈₀，OD₃₂₀；1×TE buffer为空白；RNA浓度＝(OD₂₆₀-OD₃₂₀)×100×0.04μg/mL。

(1)cDNA合成

1)取1μL Oligo(dT)18Primer(10pM)，500ng RNA，补加DEPC处理水12μL；

2)65℃变性5min后置于冰上；

3)配置逆转录反应液：取第一步变性后RNA溶液12μL，5×RT-buffer 4μL，dNTP 2μL，RNase Inhibitor(10U/μL)1μL，ReverTraAce 1μL混合；

4)设置反应程序：30℃，10min；42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min；

5)反应结束后将样品稀释20倍，分装保存至-20℃。

(2)PCR反应

1)配置PCR反应液：取20μL SYBRGreen超混合液，上下游引物(5pM)各1.6μL，cDNA4μL，ddH₂O 12.8μL，混匀，按每孔10μL加入PCR反应板；

2)设置反应程序：95℃，30s；95℃，15s，60℃，60s，40个循环；60-95℃、0.5℃/2s(溶解曲线)；

3)运行。

化合物1、3、5和7分别在2μM、4μM、8μM三个浓度下处理Calu-3细胞，然后通过qPCR考察化合物能否影响TMPRSS2基因的转录。化合物1、3、5和7分别在2μM、4μM、8μM三个浓度下下调TMPRSS2基因mRNA表达的结果如图3所示。结果显示四个化合物均能显著抑制TMPRSS2基因的转录，在8μM浓度时四个化合物对TMPRSS2基因转录抑制均大于50％(参见图3结果)。这些结果表明由于化合物大环平面结构中与引入Se可能提高化合物对特定结构G-四链体的选择性作用。进一步的Western blot分析显示苯并硒杂蒽类化合物处理细胞24h即可显著降低TMPRSS2蛋白的表达量。

实施例19:本发明制得的化合物1、3、5和7下调TMPRSS2基因蛋白表达的实验结果。

(1)溶液配制

1.0mol/L Tris·HCl(pH6.8)：称取12.114g Tris，用ddH₂O溶解，调pH至6.8，定容至100mL；

1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)：称取18.671g Tris，用ddH₂O溶解，调pH至8.8，定容至100mL；

10％SDS：称取10g SDS，加入ddH₂O 80mL，50℃加热溶解，定容至100mL；

10×电泳液缓冲液：取30.2g Tris，188g甘氨酸，10g SDS，用ddH₂O溶解并定容至1L；

1×电泳液缓冲液：量取100mL 10×电泳液缓冲液，加入900mL ddH₂O，混匀；

10×转膜缓冲液：称取151.1g甘氨酸，30.3g Tris，用ddH₂O溶解并定容至1L；

1×转膜缓冲液：量取100mL 10×转膜缓冲液，加入900mL ddH₂O，混匀；

10×TBS缓冲液：称取24.2g Tris，80.0g NaCl，用ddH₂O溶解后调节pH至7.6，定容至1L；

1×TBST缓冲液：量取100mL 10×TBS缓冲液，加入900mL ddH₂O，1mL Tween-20，混匀；

裂解液：每100mL RIPA裂解液中加入1片cocktail蛋白酶抑制剂；

封闭液：称取5g脱脂奶粉，用100mL 1×TBST缓冲液溶解；

(2)细胞培养与药物处理

1)接种Calu-3细胞(人肺腺癌瘤株)至6孔板；

(3)蛋白提取

1)从培养箱中取出细胞，弃培养液，用预冷的PBS清洗两次；

2)将培养板置于冰上，每孔(6孔板)滴加100μL裂解液，冰上裂解5min；

3)用刮刀将细胞裂解产物搜集至1.5mL预冷的离心管中，15000g离心5min；

4)小心吸取上清至一新离心管中，15000g离心5min；

5)吸取上清，分装，并于-80℃保存。

(4)蛋白定量

1)0.5mg/mL蛋白标准品配置：取20μL 25mg/ml蛋白标准，加入980μL裂解液，混匀；

2)BCA工作液的配制：10mL BCA试剂A与200μL BCA试剂B混匀，配制成10.2mL BCA工作液；

3)将标准品按0、10、20、40、60、80、100μL加到200μL PCR管中，加裂解液补足到100μL，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL；

4)取5μL待测样品用裂解液稀释20倍，混匀；

5)取800μL BCA工作液加入一新的离心管中，分别给各管中加入80μL待测样品及蛋白标准品，混匀；

6)取220μL混匀后的样品加入96孔板中，每个样品三组重复；

7)37℃静置30min，用酶标仪测定OD₅₆₂；

8)制作标准曲线，并根据标准曲线计算待测蛋白样品浓度。

(5)凝胶电泳

1)凝胶制作：10％下层胶：在烧杯中依次加入4.9mL ddH₂O，6mL 30％Acr-Bis，3.8mL 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，150μL 10％SDS，150μL 10％APS，6μL TEMED，搅拌混匀，混匀后立刻灌胶，灌胶后加入1mL异丙醇液封，室温静置40min；弃异丙醇，用ddH₂O冲洗两次，吸干玻璃板中残留水；在烧杯中依次加入3.35mL ddH₂O，1mL 30％Acr-Bis，1.5mL 1.0MTris-HCl(pH6.8)，60μL 10％SDS，60μL 10％APS，6μL TEMED，搅拌混匀，混匀后立刻灌胶，灌胶后插入梳子，室温静置30min；

2)样品准备：从-80℃取出蛋白样品，取20μg蛋白样品用裂解液稀释至24μL，加入4μL 6×SDS PAGE loadingbuffer，混匀，100℃煮沸10min；

3)电泳：取20μL样品加入样品孔中，80V恒压电泳，待溴酚蓝进入分离胶后切换电压至100V，待溴酚蓝泳动至接近胶板底部时，停止电泳。

(6)转膜

1)剪适当大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡30s，然后转移至1×转膜缓冲液中待用；滤纸、海绵均用1×转膜缓冲液浸润待用；

2)取出凝胶，夹子黑色一面在下，按海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵制作三明治结构，每铺一层均用玻璃棒擀去其中的气泡；

3)将转膜夹放入转膜槽中，加入1×转膜缓冲液，在冰浴中80V转膜150min。

(7)封闭

转膜结束后，将膜转移至孵育盒中，加入适量的封闭液，在水平摇床上缓慢摇晃2h。

(8)抗体杂交

1)用封闭液按1：1000比例稀释一抗，稀释后加入孵育盒中，将膜正面朝下置于孵育盒中；

2)在水平摇床上4℃轻摇过夜；

3)将膜转移至培养皿中，加入1×TBST缓冲液，在水平摇床轻摇洗涤10min，重复洗涤三次；

4)用1×TBST缓冲液按1：1000比例稀释二抗，稀释后加入孵育盒中，将膜正面朝下置于孵育盒中；

5)在水平摇床上室温轻摇2h；

6)将膜转移至培养皿中，加入1×TBST缓冲液，在水平摇床轻摇洗涤10min，重复洗涤三次。

(9)曝光

1)ECL A液和B液按1：1比例配置；

2)取出膜，在膜上滴加ECL显色液，避光静置3min；

3)使用化学发光成像仪曝光60s。

化合物1、3、5和7分别在0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM五个浓度下下调TMPRSS2基因蛋白表达的结果如图4所示。化合物1、3、5和7在0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM五个浓度下处理Calu-3细胞，然后通过Western blot考察化合物能否影响TMPRSS2基因的蛋白表达量。结果显示四个化合物均能不同程度抑制TMPRSS2基因的蛋白表达。

Westernblot分析显示化合物处理细胞24h即可显著降低TMPRSS2蛋白的表达量。

实施例20:本发明制得的化合物1、3、5和7抑制流感复制和流感病毒感染引起的细胞病变的实验结果。

(1)溶液配制

DMEM完全培养液：每500mL培养液添加50mL FBS，5mL青霉素-链霉素；

DMEM/F12完全培养液：每500mL培养液添加50mL FBS，5mL Non-Essential AminoAcids Solution，5mL青霉素-链霉素；

DMEM培养液(0.2％BSA)：每50mL培养液添加1.33mL 7.5％BSA，0.5mL青霉素-链霉素；

1μg/μL TPCK处理胰酶：称取10mg TPCK处理胰酶粉末，用10mL DPBS溶解，分装冻存至-20℃；

DMEM培养液(0.2％BSA，2μg/mL TPCK处理胰酶)：每50mL培养液添加1.33mL7.5％BSA，100μL 1μg/μL的TPCK处理胰酶，0.5mL青霉素-链霉素；

1.2％琼脂糖：称取1.2g低熔点琼脂糖粉末，加入100mL ddH₂O，高压蒸汽灭菌，灭菌后保存于4℃；

2×DMEM培养液：将一小袋DMEM培养基粉末倒入烧杯中，加400mL ddH₂O溶解，用浓盐酸调节pH至7.2，定容至500mL；用滤器过滤后保存至4℃；

0.6％半固体培养基：现用现配，提前65℃水浴熔解1.2％琼脂糖，熔解后置于42℃水浴中，2×DMEM培养液提前在37℃水浴中预热；取25mL 2×DMEM培养液，加入1.33mL7.5％BSA，100μL 1μg/μL的TPCK处理胰酶，0.5mL Penicillin-Streptomycin；最后加入27mL1.2％琼脂糖，颠倒混匀，置于37℃水浴中待用；

固定液：取10mL 37％甲醛与90mL DPBS混合，室温避光保存；

染色液：称取0.1g结晶紫，用1mL无水乙醇溶解，溶解后加入99mL DPBS，室温避光保存。

(2)病毒生长曲线测定

1)在6孔板中用DMEM/F12全培养液培养Calu-3细胞；

2)待细胞长至铺满时，弃培养液，用DPBS清洗两次；

3)每孔加入500μL病毒液(MOI＝0.0001)，37℃吸附1h，期间每隔15min摇晃一次；

4)弃感染液，用DPBS清洗三次，加入DMEM(0.2％BSA)，继续培养7天；

5)培养期间每隔24h收集50μL上清，储存于-80℃或进行滴度测定。

(3)病毒滴度测定

1)在6孔板中用DMEM全培养液培养MDCK细胞至长满；

2)取出病毒储液，在冰水中融化，用DMEM培养液(0.2％BSA)按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12稀释病毒储液；

3)弃细胞培养液，用DPBS清洗细胞两次；

4)在各孔中分别加入500μL不同稀释度的病毒感染液；

5)37℃吸附1h，期间每隔15min摇晃一次；

6)弃感染液，用DPBS清洗细胞两次；

7)每孔加入1.5mL 0.6％半固体培养基，室温静置30-60min；

8)转移细胞至37℃培养箱倒置培养48-72h；

9)取出培养板，每孔加入1mL固定液，室温固定1h；

10)挑去半固体培养基，每孔加入0.5mL染液，室温染色5min；

11)弃染色液，轻轻用清水冲洗残留的染色液，晾干；

12)选取含10-150个斑的孔进行计数；

13)计算病毒滴度(滴度(PFU/mL)＝斑点数/稀释度×感染液体积)。

(4)病毒感染及药物处理

1)在6孔板中用DMEM/F12全培养液培养Calu-3细胞；

2)待细胞长至铺满时，弃培养液，用DPBS清洗两次；

3)加入2mL含不同浓度化合物的DMEM培养液(0.2％BSA)继续培养24h；

4)弃培养液，每孔加入500μL病毒液(MOI＝0.0001)，37℃吸附1h，期间每隔15min摇晃一次；

5)弃感染液，用DPBS清洗三次，更换含不同浓度化合物的DMEM培养液(0.2％BSA)，继续培养72h；

6)药物处理72h后用光学显微镜观察细胞病变情况并采集图像；

7)72h后收集上清，储存于-80℃或进行滴度测定。

化合物1、3、5和7、奥司他韦及卡莫司他分别在2μM、4μM、8μM三个浓度下抑制流感病毒的增殖结果如图5A所示。化合物1、3、5和7分别在8μM浓度下抑制流感病毒PR8感染引起的细胞病变结果如图5B所示。

病毒生长周期测试显示H1N1(A/PR8/34，在这里简写为：PR8)在感染Calu-3细胞后24-72h为指数期，72h后滴度开始下降。鉴于TMPRSS2是宿主基因，在进行化合物抗病毒活性测试时，本发明先用化合物预处理细胞24h，而后再接种病毒液，接种病毒72h后收集病毒液测定滴度。结果(图5A)显示，四个化合物均可有效抑制流感病毒的增殖，所有化合物均能降低90％以上的病毒滴度，其抗病毒效果与等浓度的奥司他韦相近。四个化合物还能有效抑制流感病毒感染引起的细胞病变(CPE)(图5B)显示。

Claims

1.一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物，其特征在于所述含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物为1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐，其结构式如式(1-7)中的任意一种所示：

2.一种根据权利要求1所述的含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物(la-7a)的合成：

将式(10)所示的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异苯并吡喃-1,3(2H)-二酮溶于溶剂A中，氮气保护下，加入取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁，搅拌回流反应3-5小时，TLC跟踪至反应结束后，降温至室温，旋蒸去除溶剂得固体，经柱层析得到相应如式(la-7a)所示的带有边链的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物；

其中取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁中的取代基R₁与通式(la-7a)中对应的取代基R₁相同，化合物1a-7a中的R₁分别如下所示：

2)1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐(1-7)的合成:

在氮气保护下，将步骤1)得到的带有边链的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物(la-7a)溶解于溶剂B中，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应，在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐变浑浊，且有大量颗粒析出，这些颗粒即为盐酸化的固体产物；反应完全后抽滤，滤饼用溶剂B反复冲洗几次，真空干燥后得到1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异喹啉-1,3(2H)-二酮衍生物盐酸盐(1-7)，即制得所述的萘酰亚胺类衍生物；

其反应过程如下：

3.根据权利要求2所述的一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，其特征在于式(10)所示的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异苯并吡喃-1,3(2H)-二酮与取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁的投料摩尔比为1:0.5-3。

4.根据权利要求3所述的一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，其特征在于式(10)所示的1H,3H-硒呫吨并[2,1,9-def]异苯并吡喃-1,3(2H)-二酮与取代胺类化合物NH₂CH₂CH₂CH₂R₁的投料摩尔比为1:1.3-1.6。

5.根据权利要求2所述的一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，其特征在于步骤1)中的柱层析所用溶剂为体积比为10-20:1的二氯甲烷和甲醇混合液。

6.根据权利要求2所述的一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，其特征在于溶剂A为醇类溶剂；溶剂B为卤代烷溶剂。

7.根据权利要求6所述的一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，其特征在于溶剂A为无水乙醇；溶剂B为二氯甲烷。

8.根据权利要求1所述的一种含硒杂环的萘酰亚胺类衍生物在制备抗病毒药物中的应用。