CN111333639A - 咔啉衍生物/类似物及其制备方法和用途 - Google Patents

咔啉衍生物/类似物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN111333639A CN202010311968.1A CN202010311968A CN111333639A CN 111333639 A CN111333639 A CN 111333639A CN 202010311968 A CN202010311968 A CN 202010311968A CN 111333639 A CN111333639 A CN 111333639A
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Abstract

本发明属于化学医药领域，提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供了式Ⅰ所示的化合物的类似物。生物学实验表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性，并且是一种很好的微管蛋白抑制剂，其中化合物91b不仅具有优异的抗肿瘤活性，还能够有效的促进微管蛋白的降解，同时还能够克服β‑tubulin III和P‑gp过表达引起的耐药，为临床用药提供了新选择。
Figure DDA0002457983680000011

Description

咔啉衍生物/类似物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及咔啉衍生物/类似物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，据统计，2010年中国城市地区主要死亡原因中，恶性肿瘤排位第一，占28.2％，自1987年恶性肿瘤导致的死亡率排首位以来，中国城市地区的恶性肿瘤患病率一直居高不下。肿瘤的治疗方法有手术治疗，放射治疗和药物治疗。目前，化学治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要手段。寻找新型抗肿瘤药物，一直是新药研究的热点。
微管靶向剂是一类作用于微管蛋白破坏微管的动态平衡从而阻止肿瘤细胞增殖的抗癌药物，其作用机制有两种类型：一类是促进微管蛋白聚合的微管蛋白聚合剂或微管稳定剂(microtubule stabilizing agents,MSAs)，另一类是抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂或微管去稳定剂(microtubule destabilizing agents,MDAs)。其中靶向紫杉醇位点的MTAs能够稳定微管，属于MSAs；靶向长春新碱[22]和秋水仙碱位点的MTAs能够导致微管变得不稳定，属于MDAs。迄今为止，总共发现了6个微管靶向剂结合位点，即紫杉醇位点、长春新碱位点、秋水仙碱位点、maytansine位点、laulimalide/peloruside A位点和pironetin位点。针对目前已经发现的这6个微管抑制剂作用位点，已经报道的微管抑制剂要么促进微管蛋白聚合，要么抑制微管蛋白聚合，而通过直接靶向微管蛋白且促使微管蛋白降解的小分子还未见报道。
咔啉类化合物以β-咔啉类化合物为主，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及抑制中枢神经系统等活性。其中，其在抗肿瘤方面，由于具有多靶点、抗瘤谱广等优点受到了人们的广泛关注。因此，以咔啉为母核，发现一系列新咔啉衍生物/类似物是非常有实际意义的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一类咔啉衍生物或其药学上可接受的盐，其结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002457983660000011
X1、X2选自N或CH；
Y选自CH2或NR3；
Z选自NH、CH2或O；
R1、R3选自H或C1～C3烷基；
R2选自C1～C6烷基、C2～C6烯基、5～6元环烷基、取代或未取代的5～14元芳基，所述芳基含有0～1个杂原子，杂原子为N、O或S；
X1为N、X2为CH、Y为NH、Z为CH2以及R1为H时，R2不为苯和二苯醚。
进一步的，上述的化合物或其药学上可接受的盐，R2选自C1～C3烷基、C2～C4烯基、5～6元环烷基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的芘基、取代或未取代的苯基。
优选的，R2选自甲基、乙基、异丁烯、环戊烷、环己烷、噻吩基、吡咯基、甲基取代的吡咯基、呋喃基、吡啶基、甲氧基取代的吡啶基、萘基、喹啉基、吲哚基、芘基、苯基取代的苯基、-O(CH2)nR4取代的苯基，n＝0或1；
R4选自苯基、取代的苯基、吡啶基、喹啉基、苯并二恶茂基或苯并二恶烷基。
更优选的，R2选自甲基、乙基、异丁烯、环戊烷、环己烷、噻吩基、吡咯基、甲基取代的吡咯基、呋喃基、吡啶基、甲氧基取代的吡啶基、萘基、喹啉基、吲哚基、芘基、苯基取代的苯基、-O(CH2)nR4取代的苯基，n＝0或1；
R4选自苯基、卤素取代的苯基、甲基取代的苯基、甲氧基取代的苯基、乙酰胺基取代的苯基、氰基取代的苯基、三氟甲基取代的苯基、甲硫基取代的苯基、苯基取代的苯基、二苯醚基、异辛烷基取代的苯基、吡啶基、喹啉基、苯并二恶茂基或苯并二恶烷基。
进一步的，上述的化合物或其药学上可接受的盐，结构式如下：
Figure BDA0002457983660000021
Figure BDA0002457983660000031
Figure BDA0002457983660000041
本发明还提供了上述化合物的类似物，结构如下：
Figure BDA0002457983660000042
本发明还提供了一种药物组合物，由上述化合物或其药学上可接受的盐、上述的类似物为活性成分，添加药学上可接受的辅助性成分组成。
本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐、上述的类似物、上述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步的，上述的用途，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肺癌或卵巢癌。
本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐、上述的类似物、上述的药物组合物在制备微管抑制剂中的用途；优选的，所述微管抑制剂为微管蛋白降解剂。
进一步的，上述的用途，所述微管蛋白降解剂在降解微管蛋白时是通过泛素-蛋白酶体途径进行。
进一步的，上述的用途，所述微管蛋白降解剂结合位点为秋水仙碱位点。
本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0002457983660000043
反应式中的R同上述R2；
反应试剂及条件：a)SOCl2,MeOH,0℃下滴加SOCl2，滴加完毕后升至室温回流搅拌反应3小时；b)37％HCHO,MeOH,回流反应3小时；c)TCCA,Et3N,DMF,-20℃下反应1小时，升温至0℃反应2小时；d)85％NH2NH2·H2O,MeOH,回流搅拌反应6小时；e)NaNO2,浓盐酸,H2O,0℃；f)浓盐酸,H2O,回流；g)①醛Ti(iOPr)4,THF,室温；②NaBH(OAc)3,EtOH,室温。
术语定义：
本发明提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。
术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C1～C6烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。
术语“环烷基”是指不包含杂原子的饱和的环状烃基，其可以是单环结构，也可以是多环结构，例如：环丙烷基(3元)、环己烷基(6元)。
术语“烯基”是指由碳和氢原子组成的至少含有一个双键的直链或支链的烃链基团，例如：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基。
术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠环基团，芳基可以是完全芳香族的基团，例如苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基等。芳基中的碳原子可以被杂原子取代，杂原子选自硫、氧和/或氮，例如噻吩、呋喃、吡咯、吡啶、喹啉、吲哚等
术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的有机盐和无机盐，优选无机盐、药学上可接受的无毒的酸形成的盐，包括但不限于，与氨基反应形成的无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、硝酸盐,有机酸盐如乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、盐酸盐、油酸盐、硬脂酸盐、抗坏血酸盐、甲酸盐、硼酸盐、樟脑酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐、苹果酸盐等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明所述药学上可接受的辅助性成分，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质，所述的辅助性成分如环糊精、精氨酸或葡甲胺。所述的环糊精选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(C1-4烷基)-α-环糊精、(C1-4烷基)-β-环糊精、(C1-4烷基)-γ-环糊精、(羟基-C1-4烷基)-α-环糊精、(羟基-C1-4烷基)-β-环糊精、(羟基-C1-4烷基)-γ-环糊精、(羧基-C1-4烷基)-α-环糊精、(羧基-C1-4烷基)-β-环糊精、(羧基-C1-4烷基)-γ-环糊精、α-环糊精的糖类醚、β-环糊精的糖类醚、γ-环糊精的糖类醚、α-环糊精的磺丁基醚、β-环糊精的磺丁基醚和γ-环糊精的磺丁基醚。所述的辅助性成分还包含医学上可接受的载体、佐剂或媒剂。可用于药学上可接受的药物组合物还离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵凝脂；缓冲物质包括磷酸盐、甘氨酸、精氨酸、山梨酸等。
本发明公开了一类式I的化合物，药效学实验结果显示，本发明的化合物具有抗肿瘤活性，并且是一种很好的微管蛋白抑制剂，其中化合物91b不仅具有优异的抗肿瘤活性，还能够有效的促进微管蛋白的降解，同时还能够克服β-tubulin III和P-gp过表达引起的耐药，为临床用药提供了新选择。
附图说明
图1为化合物9与微管蛋白的相互作用，其中被标记的与9有相互作用的氨基酸残基用球棍表示，疏水中心用绿色的半透明椭圆表示，小的椭圆：疏水中心I，大的椭圆：疏水中心II；
图2为部分化合物对HeLa细胞内β-微管蛋白水平的影响图；
图3为化合物91b(0.1,0.5,2.5,12.5μM)，秋水仙碱(5μM)和长春新碱(5,25μM)在A2780S细胞上的EBI(100μM)实验结果；
图4为蛋白酶体抑制剂MG132对化合物91b促进微管蛋白降解的影响；
图5为秋水仙碱、紫杉醇和91b对微管形态的影响；
图6为91b在不同浓度下对A2780S和A2780T细胞周期和凋亡的影响；其中，A)91b导致的细胞G2/M期阻滞。A2780S和A2780T细胞用3,10,30,100and 300nM的91b处理48h；B)A2780S细胞在细胞周期不同阶段的百分比；C)A2780T细胞在细胞周期不同阶段的百分比；D)91b处理A2780S和A2780T细胞48h后凋亡细胞的流式细胞仪直方图；E)91b处理A2780S48h后，双参数直方图不同区域的细胞百分比；F)91b处理A2780T 48h后，双参数直方图不同区域的细胞百分比；
图7为91b对HUVECs细胞迁移的影响；其中，A)91b(1.25,2.5,5and 10nM)处理无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养的HUVECs细胞24h,48h在相差显微镜下的观测结果。空白对照只加DMEM；B)24h后细胞迁移数量统计；C)48h后细胞迁移数量统计；**P<0.01；***P<0.001表示t-test时跟空白对照组有显著性差异；
图8为91b和紫杉醇在A2780S异种移植模型上的抗肿瘤活性，给药周期：91b每周三次，紫杉醇每周一次，给药方式：尾静脉注射；其中，A)91b在A2780S异种移植模型上抑制肿瘤生长的效果；肿瘤体积每两天测一次，体积大小计算方法：V(mm3)＝(π/6)×长×宽×宽；B)91b对小鼠体重的影响，小鼠体重每两天测一次；C、D)91b抑制肿瘤体积增长及重量增加。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中用于合成的原料和试剂均为分析纯，并按具体的实验要求进行预处理或者直接使用。其他用到仪器如下：核磁共振仪(Bruker公司)；质谱仪(Micromass公司)；显微熔点仪(上海光学仪器厂)；高效液相色谱仪(Waters公司)，快速纯化制备液相色谱(瑞典Biotage)。
实施例1、化合物89b、89f的合成
Figure BDA0002457983660000081
(1)L-色氨酸甲酯盐酸盐(化合物2)
在100mL的圆底烧瓶中加入2.04g(10mmol)L-色氨酸，50mL甲醇，将体系冷却至0℃,然后在此温度下将0.88mL(12mmol)二氯亚砜(SOCl2)滴加到反应体系中(10min左右滴完)。滴加完毕升温至室温后加热回流3h。反应毕，旋干溶剂及过量的SOCl2，残渣中加入乙酸乙酯，超声，产生固体，过滤得到白色的L-色氨酸甲酯盐酸盐(2)。收率95％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.24(s,1H),8.82(s,3H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.39(d,J＝8.1Hz,1H),7.28(d,J＝2.4Hz,1H),7.13–7.05(m,1H),7.04–6.94(m,1H),4.19(dd,J＝7.0,5.4Hz,1H),3.62(s,3H),3.44–3.28(m,2H).
(2)(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酸甲酯盐酸盐(化合物3)
在1L的圆底烧瓶中加入24.5g(96.1mmol)L-色氨酸甲酯盐酸盐(1),500mL甲醇，常温搅拌溶解，随后向其中加入8.65g(106.7mmol)37％的甲醛溶液。回流搅拌反应6h。反应毕，浓缩蒸去溶剂甲醇至约50mL时停止浓缩，向其中加入250mL甲基叔丁基醚，析出大量白色固体，抽滤干燥得中间体(3)，收率89％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.25(s,1H),7.48(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,1H),7.15–7.06(m,1H),7.05–6.96(m,1H),4.63(dd,J＝10.0,5.3Hz,1H),4.40(s,2H),3.82(s,3H),3.44–3.23(m,3H),3.08(dd,J＝16.0,9.9Hz,1H).
(3)9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酸甲酯(化合物4)
向250mL的圆底烧瓶中加入7.95g(34.5mmol)化合物3,7.95g(34.5mmol)三乙胺及50mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)。将反应体系降至-20℃，在此温度下，向其中滴加溶有8.0g(34.5mmol)三氯异氰尿酸的DMF溶液。滴加完毕后，缓慢升温至0℃并在此温度下继续反应2h。反应毕，将反应液倾倒进500mL冰水中，析出大量灰色固体，抽滤，真空干燥，得中间体(4),收率80％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ12.06(s,1H),8.97(d,J＝0.9Hz,1H),8.92(s,1H),8.40(d,J＝7.9Hz,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,1H),7.60(ddd,J＝8.3,6.9,1.1Hz,1H),7.32(ddd,J＝8.0,7.0,1.1Hz,1H),3.91(s,3H).
(4)9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼(化合物5)
向盛有120mL甲醇的圆底烧瓶中加入12.0g(50mmol)化合物4,20mL80％的水合肼。反应回流搅拌至原料4完全反应。冷却至室温，析出大量白色固体，抽滤，干燥得中间体5,收率85％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.93(s,1H),9.66(s,1H),8.89(d,J＝0.8Hz,1H),8.83(d,J＝0.8Hz,1H),8.41(d,J＝7.9Hz,1H),7.66(d,J＝8.2Hz,1H),7.60(ddd,J＝8.1,6.8,1.0Hz,1H),7.30(ddd,J＝8.0,7.0,1.1Hz,1H),4.56(s,2H).
(5)9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰基叠氮(化合物6)
向12.1g(50mmol)中间体5的200mL水溶液中滴加10mL浓盐酸，将此深黄色溶液冷却至0-5℃。在此温度下滴加溶有3.6g(53mmol)NaNO2的水溶液，滴加完毕继续在此温度下反应30min，反应毕，饱和NaHCO3调pH至微碱性，析出大量淡黄色固体，抽滤，2×50mL水洗涤，真空干燥，得黄色中间体6收率75％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ12.27(s,1H),8.99(s,1H),8.97(s,1H),8.41(d,J＝7.9Hz,1H),7.71(d,J＝8.2Hz,1H),7.68–7.61(m,1H),7.37(t,J＝7.4Hz,1H).
(6)9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(化合物7)
将11.85g(50mmol)6加入到盛有200mL水的500mL圆底烧瓶中，再向其中滴加10mL浓盐酸，回流搅拌反应约1h。反应毕，饱和NaOH调pH至8左右，冷却至室温，析出大量黄色固体，抽滤，冷水洗涤，干燥。粗产品用乙醇重结晶，得黄色固体7,收率70％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.28(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝6.1Hz,2H),7.11–7.04(m,2H),5.27(s,2H).
(7)N-取代-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89b、89f)的合成
向25mL的圆底烧瓶中加入0.183g(1.0mmol)化合物7，1.1mmol环己基甲醛(合成89f)或正丁醛(合成89b)，0.43g(1.5mmol)钛酸四异丙酯(Ti(iOPr)4)及0.1mLTHF，室温反应4h后，向体系中加入20mL乙醇，1.06g(5.0mmol)NaBH(OAc)3，继续反应5h。反应毕，搅拌下向反应体系中再加入30mL乙醇，2mL水淬灭过量的钛酸四异丙酯，硅藻土过滤，滤液旋干，柱层析分离得纯品终产物89b、89f。
N-丁基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89b)
Figure BDA0002457983660000091
黄色固体,收率:54％.M.P.116.4–118.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.84(s,1H),8.39–8.27(m,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),7.50–7.34(m,2H),7.15–6.98(m,2H),5.72(t,J＝5.7Hz,1H),3.24(q,J＝6.7Hz,2H),1.58(p,J＝7.3Hz,2H),1.41(dq,J＝14.4,7.3Hz,2H),0.93(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ153.57,142.38,131.73,131.01,130.86,128.29,122.12,121.09,118.37,111.89,95.42,42.62,31.89,20.40,14.39.HRMS-ESI:calcd for C15H18N3[M+H]+,240.1501,found:240.1500.
N-(环己基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89f)
Figure BDA0002457983660000101
黄色固体，收率:75％.M.P.112.5–113.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.79(s,1H),8.32(d,J＝1.0Hz,1H),8.03(d,J＝7.8Hz,1H),7.45–7.37(m,2H),7.11–7.03(m,2H),5.77(t,J＝5.7Hz,1H),3.10(t,J＝6.1Hz,2H),1.86–1.77(m,2H),1.74–1.66(m,2H),1.64-1.55(m,2H),1.32–1.12(m,5H).HRMS-ESI:calcd for C18H22N3[M+H]+280.1814,found:280.1810.
实施例2、化合物14、15的合成
Figure BDA0002457983660000102
向25mL的圆底烧瓶中加入0.189g(2.0mmol)化合物12(合成14)或0.288g(2.0mmol)13(合成15)，2.2mmol间苯氧基苯甲醛，0.86g(3.0mmol)钛酸四异丙酯(Ti(iOPr)4)及0.2mLTHF，室温反应4h后，向体系中加入20mL乙醇，2.12g(10.0mmol)NaBH(OAc)3,继续反应5h。反应毕，搅拌下向反应体系中再加入30mL乙醇，2mL水淬灭过量的钛酸四异丙酯，硅藻土过滤，滤液旋干，柱层析分离得纯品终产物14,15。
N-(3-苯氧基苄基)吡啶-2-胺(14)，黄色固体,收率:93％.M.P.91.8–92.4℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ7.94(dd,J＝5.1,1.8Hz,1H),7.40–7.26(m,4H),7.12(t,J＝7.2Hz,2H),7.07–6.94(m,4H),6.83(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.53–6.43(m,2H),4.47(d,J＝6.1Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ159.04,157.11,157.03,147.98,143.71,137.13,130.44,130.20,123.78,122.75,118.95,117.82,117.07,112.30,108.63,44.29.HRMS-ESI:calcd for C18H17N2O[M+H]+277.1342,found:277.1346.
N-(3-苯氧基苄基)异喹啉-3-胺(15)，黄色固体，收率:91％.M.P.125.9–127.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.84(s,1H),7.79(d,J＝8.1Hz,1H),7.47(dt,J＝14.8,8.1Hz,2H),7.31(q,J＝7.5Hz,3H),7.16(t,J＝7.2Hz,2H),7.07(dd,J＝18.2,9.3Hz,3H),6.94(d,J＝7.9Hz,2H),6.84(d,J＝7.7Hz,1H),6.54(s,1H),4.50(d,J＝6.4Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.09,157.07,156.11,151.85,143.37,138.83,130.65,130.39,130.31,128.18,124.83,123.74,123.11,122.68,122.34,118.90,117.73,117.19,96.52,45.27.HRMS-ESI:calcd for C22H19N2O[M+H]+327.1498,found:327.1496.
实施例3、化合物19的合成
Figure BDA0002457983660000103
(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)甲醇(16)
向250mL圆底烧瓶中加入2.26g(10.0mmol)化合物4,100mL THF,冷却至0℃后分批加入0.57g(15.0mmol)LiAlH4,升温至室温搅拌反应。反应结束后，向体系中加入10mL H2O,并在室温下继续反应2小时淬灭反应。过滤，二氯甲烷洗涤，滤液浓缩后Flash柱分离纯化，1.78g白色固体16,收率：90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.49(s,1H),8.79(d,J＝1.1Hz,1H),8.24(d,J＝7.8Hz,1H),8.14(s,1H),7.60–7.47(m,2H),7.22(ddd,J＝7.9,6.8,1.2Hz,1H),5.33(t,J＝5.8Hz,1H),4.72(d,J＝5.7Hz,2H).HRMS-ESI:calcd for C12H11N2O[M+H]+199.0872,found:199.0870.
3-(氯甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(17)
向盛有1.98g(10.0mmol)化合物16的50mL圆底烧瓶中加入20mL SOCl2，回流搅拌反应2小时。反应结束后，蒸去过量的SOCl2，残渣经Flash柱分离纯化得1.99g白色固体17，收率：92％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.77(s,1H),8.89(d,J＝0.9Hz,1H),8.31(s,1H),8.26(d,J＝7.9Hz,1H),7.62(dt,J＝8.3,1.0Hz,1H),7.57(ddd,J＝8.3,6.9,1.2Hz,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.9,1.2Hz,1H),4.97(s,2H).
((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)甲基)三苯基氯化鏻(18)
向50mL圆底烧瓶中加入0.433g(2.0mmol)化合物17,0.525g(2.0mmol)三苯基膦，20mL甲苯，反应混合物用N2置换15分钟，随后回流搅拌反应6小时。反应结束后，冷却至室温，过滤得白色固体18，冷甲苯洗涤。固体不经进一步纯化直接用于下一步反应。
3-(3-苯氧基苯乙基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(19)
向100mL圆底烧瓶中加入0.479g(1.0mmol)化合物18,0.297g(1.5mmol)间苯氧基苯甲醛，0.42g(10.0mmol)LiCl,0.420g(10.0mmol)LiOH一水合物，40mL H2O，回流搅拌反应6小时。反应毕，25mL(x3)乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，Na2SO4干燥，蒸发浓缩，Flash柱分离纯化得E式和Z式异构体(70:30)。两种异构体在乙醇中经H2钯/碳还原，硅藻土过滤、萃取、Flash柱分离纯化后得0.258g无色液体19，两步总收率：71％。M.P.78.2–79.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.45(s,1H),8.80(d,J＝1.0Hz,1H),8.15(d,J＝7.9Hz,1H),7.88(s,1H),7.57(dt,J＝8.3,1.1Hz,1H),7.52(ddd,J＝8.2,6.8,1.2Hz,1H),7.31–7.18(m,4H),7.11–7.01(m,2H),6.92–6.84(m,2H),6.82–6.76(m,2H),3.22–3.11(m,2H),3.11–3.02(m,2H).
实施例4、化合物24的合成
Figure BDA0002457983660000111
2'-硝基-[1,1'-联苯基]-3-胺(22)
向盛有0.33g(2.0mmol)化合物20的三口瓶中加入0.38g(2.2mmol)化合物21，0.42g(4.0mmol)Na2CO3，0.12g(0.05mmol)Pd(PPh3)4，30mL 1,4-dioxane/H2O(4/1,v/v)。将反应混合物用N2置换15分钟，然后将体系置于85℃下反应8小时。反应毕，冷却至室温，硅藻土过滤，滤液加入200mL水，50mL乙酸乙酯(×3)萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产品经Flash柱纯化得到0.31g。收率：71％。黄色固体22。
9H-咔唑-3-胺(23)
向50mL圆底烧瓶中加入0.214g(1.0mmol)化合物22，0.52g(2.0mmol)PPh3,12mL邻二氯苯，体系用N2置换15分钟，然后升温至180℃反应24小时。反应毕，冷却至室温，蒸发浓缩溶剂，Flash柱分离纯化得0.15g片状白色晶体23，收率81％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.68(s,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(d,J＝8.1Hz,1H),7.27(ddd,J＝8.2,6.9,1.1Hz,1H),7.23(d,J＝2.1Hz,1H),7.19(d,J＝8.5Hz,1H),7.03(ddd,J＝7.9,7.0,1.1Hz,1H),6.76(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),4.65(s,2H).
N-(3-苯氧基苄基)-9H-咔唑-3-胺(24)
向25mL的圆底烧瓶中加入0.182g(1.0mmol)化合物23，1.1mmol间苯氧基苯甲醛，0.43g(1.5mmol)钛酸四异丙酯(Ti(iOPr)4)及0.1mLTHF，室温反应4h后，向体系中加入20mL乙醇，1.06g(5.0mmol)NaBH(OAc)3，继续反应5h。反应毕，搅拌下向反应体系中再加入30mL乙醇，2mL水淬灭过量的钛酸四异丙酯，硅藻土过滤，滤液旋干，柱层析分离得纯品终产物24。灰色固体，收率：92％。M.P.158.7–159.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.72(s,1H),7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.38–7.17(m,8H),7.14–7.00(m,3H),6.99–6.91(m,2H),6.88–6.79(m,2H),5.86(t,J＝5.8Hz,1H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.22,157.03,143.87,142.42,140.58,133.30,130.41,130.27,125.28,123.69,123.43,123.07,122.79,120.25,118.84,118.18,117.95,117.26,115.06,111.82,111.21,102.06,47.96.HRMS-ESI:calcd forC25H21N2O[M+H]+365.1655,found:365.1651.
实施例5、化合物89a-q,90a-y,91a-f的合成
向25mL的圆底烧瓶中加入0.183g(1.0mmol)化合物7,1.1mmol醛，0.43g(1.5mmol)钛酸四异丙酯(Ti(iOPr)4)及0.1mLTHF，室温反应4h后，向体系中加入10mL乙醇，1.06g(5.0mmol)NaBH(OAc)3，继续反应5h。反应毕，搅拌下向反应体系中再加入15mL乙醇，1mL水淬灭过量的钛酸四异丙酯，硅藻土过滤，滤液旋干，柱层析分离得纯品终产物89a-q,90a-y,91a-f。
N-丙基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89a)
Figure BDA0002457983660000121
黄色固体，收率：56％.M.P.106.5–107.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.84(s,1H),8.35(s,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝5.7Hz,2H),7.14–6.98(m,2H),5.76(t,J＝5.9Hz,1H),3.21(q,J＝6.6Hz,2H),1.61(h,J＝7.3Hz,2H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ153.56,142.41,131.77,131.01,130.88,128.31,122.13,121.10,118.39,111.90,95.43,44.82,22.89,12.21.HRMS-ESI:calcd forC14H16N3[M+H]+226.1345,found:226.1348.
N-异丁基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89c)
Figure BDA0002457983660000122
黄色固体，收率：75％.M.P.73.4–74.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.80(s,1H),8.32(s,1H),8.03(d,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.37(m,2H),7.11–7.03(m,2H),5.81(t,J＝5.8Hz,1H),3.07(t,J＝6.3Hz,2H),1.94–1.86(m,1H),0.96(s,3H),0.94(s,3H).HRMS-ESI:calcd for C15H18N3[M+H]+240.1501,found:240.1504.
N-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89d)
Figure BDA0002457983660000123
黄色固体，收率：75％.M.P.99.3–100.9℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.84(s,1H),8.35(d,J＝1.1Hz,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.38(m,2H),7.12–7.02(m,2H),5.74(t,J＝5.4Hz,1H),5.38–5.30(m,1H),3.84(t,J＝5.5Hz,2H),1.72(s,3H),1.70(s,3H).HRMS-ESI:calcd for C16H18N3[M+H]+252.1501,found:252.1497.
N-环戊基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89e)
Figure BDA0002457983660000131
黄色固体，收率：69％.M.P.123.6–125.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.82(s,1H),8.33(d,J＝0.9Hz,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),7.45–7.37(m,2H),7.11–7.03(m,2H),5.71(s,1H),4.06(p,J＝5.8Hz,1H),2.03–1.92(m,2H),1.76–1.64(m,2H),1.62–1.52(m,2H),1.52–1.42(m,2H).HRMS-ESI:calcd for C16H18N3[M+H]+252.1501,found:252.1497.
N-(噻吩-2-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89g)
Figure BDA0002457983660000132
黄色固体，收率：78％.M.P.185.4–185.9℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.37(s,1H),8.01(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(d,J＝6.1Hz,2H),7.34–7.26(m,1H),7.15(s,1H),7.11–7.06(m,1H),7.05(d,J＝2.7Hz,1H),6.94(dd,J＝4.9,3.5Hz,1H),6.45(t,J＝6.2Hz,1H),4.69(d,J＝6.2Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ152.52,145.67,142.49,131.71,131.32,130.87,128.47,126.98,125.06,124.62,122.15,120.97,118.53,111.99,96.68,41.61.HRMS-ESI:calcd for C16H14N3S[M+H]+280.0909,found:280.0910.
N-(噻吩-3-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89h)
Figure BDA0002457983660000133
黄色固体，收率：77％.M.P.204.9–206.4℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.36(s,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.51–7.38(m,3H),7.35(s,1H),7.14(d,J＝5.9Hz,2H),7.09(dd,J＝10.0,3.6Hz,1H),6.28(t,J＝5.9Hz,1H),4.50(d,J＝5.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ153.01,142.79,142.43,131.71,131.16,130.95,128.40,128.22,126.25,122.11,121.56,121.02,118.47,111.94,96.23,41.99.HRMS-ESI:calcd for C16H14N3S[M+H]+280.0909,found:280.0900.
N-((1-甲基-1H-吡咯-2-基)甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89i)
Figure BDA0002457983660000134
黄色固体，收率：67％.M.P.156.3–158.1℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.41–8.34(m,1H),8.01(d,J＝7.8Hz,1H),7.47–7.38(m,2H),7.18(s,1H),7.08(ddd,J＝7.9,6.1,1.9Hz,1H),6.65(t,J＝2.3Hz,1H),6.06–5.94(m,2H),5.88(t,J＝3.1Hz,1H),4.42(d,J＝5.5Hz,2H),3.61(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ152.98,142.46,131.68,131.29,131.16,130.79,128.40,122.36,122.08,121.04,118.47,111.94,107.98,106.42,96.40,38.80,33.84.HRMS-ESI:calcd for C17H17N4[M+H]+277.1454,found:277.1449.
N-(呋喃-3-基-甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89j)
Figure BDA0002457983660000135
黄色固体，收率：77％.M.P.192.9–194.0℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.37(d,J＝1.1Hz,1H),8.03(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(s,1H),7.56(t,J＝1.6Hz,1H),7.47–7.37(m,2H),7.15(s,1H),7.09(ddd,J＝7.9,6.0,2.1Hz,1H),6.56–6.45(m,1H),6.09(t,J＝6.1Hz,1H),4.32(d,J＝6.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ153.02,143.45,142.42,140.23,131.68,131.19,130.95,128.40,125.00,122.12,121.03,118.48,111.95,111.31,96.31,37.68.HRMS-ESI:calcd for C16H14N3O[M+H]+264.1138,found:264.1134.
N-((6-甲氧基-吡啶-3-基)甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89k)
Figure BDA0002457983660000141
黄色固体，收率：58％.M.P.173.9–175.7℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.36(d,J＝1.0Hz,1H),8.20(d,J＝2.1Hz,1H),8.03(d,J＝7.9Hz,1H),7.74(dd,J＝8.5,2.4Hz,1H),7.43(dd,J＝5.9,1.1Hz,2H),7.13(s,1H),7.08(ddd,J＝8.0,6.0,2.1Hz,1H),6.75(dd,J＝8.5,0.7Hz,1H),6.41(t,J＝6.3Hz,1H),4.45(d,J＝6.2Hz,2H),3.81(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ162.98,152.77,146.15,142.43,139.27,131.71,131.20,130.97,129.97,128.43,122.15,120.97,118.49,111.94,110.46,96.36,53.44,43.22.HRMS-ESI:calcd for C18H17N4O[M+H]+305.1403,found:305.1403.
N-(萘-1-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89l)
Figure BDA0002457983660000142
黄色固体，收率：71％.M.P.201.1–202.7℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.37(s,1H),8.23(d,J＝7.9Hz,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.95(dd,J＝7.3,1.9Hz,1H),7.81(d,J＝8.2Hz,1H),7.60–7.51(m,3H),7.46–7.38(m,3H),7.19(s,1H),7.07(ddd,J＝7.9,5.9,2.1Hz,1H),6.46(t,J＝6.0Hz,1H),5.00(d,J＝5.8Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ153.11,142.49,136.83,133.82,131.84,131.75,131.14,130.91,128.93,128.43,127.43,126.42,126.09,125.92,125.31,124.17,122.13,121.00,118.46,111.93,96.21,44.16.HRMS-ESI:calcd for C22H18N3[M+H]+324.1501,found:324.1497.
N-(萘-2-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89m)
Figure BDA0002457983660000143
黄色固体，收率：77％.M.P.216.3–216.9℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.85(s,1H),8.35(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.93–7.77(m,4H),7.58(d,J＝8.3Hz,1H),7.51–7.34(m,4H),7.16(s,1H),7.11–7.02(m,1H),6.57(t,J＝6.1Hz,1H),4.69(d,J＝6.1Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ153.03,142.44,139.55,133.47,132.53,131.74,131.14,130.98,128.41,128.10,127.96,127.91,126.64,126.44,125.78,125.59,122.10,120.98,118.47,111.93,96.12,46.34.HRMS-ESI:calcd forC22H18N3[M+H]+324.1501,found:324.1502.
N-(喹啉-2-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89n)
Figure BDA0002457983660000144
黄色固体，收率：68％.M.P.202.9–204.6℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.90(s,1H),8.35(s,1H),8.27(d,J＝8.5Hz,1H),8.02(d,J＝8.1Hz,2H),7.92(d,J＝8.1Hz,1H),7.75(ddd,J＝8.4,6.8,1.5Hz,1H),7.61–7.53(m,2H),7.46–7.39(m,2H),7.23(s,1H),7.08(ddd,J＝7.9,6.0,2.0Hz,1H),6.73(t,J＝6.0Hz,1H),4.80(d,J＝6.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ161.96,152.79,147.50,142.46,136.75,131.80,131.26,131.03,129.93,128.81,128.46,128.28,127.38,126.34,122.12,120.96,120.29,118.53,111.96,96.25,48.79.HRMS-ESI:calcd for C21H17N4[M+H]+325.1454,found:325.1451.
N-((1H-吲哚-3-基)甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89o)
Figure BDA0002457983660000145
黄色固体，收率：49％.M.P.110.4–110.7℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.83(s,2H),8.37(d,J＝0.8Hz,1H),8.01(d,J＝7.8Hz,1H),7.66(dd,J＝6.5,3.8Hz,1H),7.44–7.40(m,2H),7.37–7.30(m,2H),7.19(s,1H),7.10–7.04(m,2H),7.00–6.95(m,1H),5.98(t,J＝5.7Hz,1H),4.62(d,J＝4.9Hz,2H).HRMS-ESI:calcdfor C20H17N4[M+H]+313.1354,found:313.1448.
N-([1,1’-联苯基]-4-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89p)
Figure BDA0002457983660000151
黄色固体，收率：75％.M.P.205.7–207.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.37–8.31(m,1H),8.01(d,J＝7.8Hz,1H),7.64–7.58(m,4H),7.49(d,J＝8.2Hz,2H),7.46–7.38(m,4H),7.36–7.30(m,1H),7.14(s,1H),7.07(ddd,J＝8.0,6.0,2.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.3Hz,1H),4.56(d,J＝6.2Hz,2H).HRMS-ESI:calcd for C24H20N3[M+H]+350.1658found:350.1652.
N-(芘-1-基甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(89q)
Figure BDA0002457983660000152
黄色固体，收率：74％.M.P.246.9–248.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.89(s,1H),8.55(d,J＝9.2Hz,1H),8.40(s,1H),8.25(dq,J＝26.0,8.1Hz,5H),8.13(s,2H),8.07(t,J＝7.6Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.50–7.37(m,2H),7.25(s,1H),7.06(ddd,J＝8.1,5.2,2.9Hz,1H),6.66(t,J＝6.0Hz,1H),5.28(d,J＝5.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ153.11,142.49,135.40,131.84,131.31,131.20,130.95,130.88,130.23,128.71,128.44,127.91,127.72,127.17,126.63,125.52,125.48,125.14,124.53,123.94,122.12,121.00,118.47,111.94,96.33,44.45.HRMS-ESI:calcdfor C28H20N3[M+H]+398.1658,found:398.1811.
N-(3-(2-氟苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90a)
Figure BDA0002457983660000153
黄色固体，收率：76％.M.P.132.6–134.4℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.32(s,1H),8.00(d,J＝7.2Hz,1H),7.43(d,J＝6.3Hz,2H),7.37–7.05(m,8H),7.03(s,1H),6.78(d,J＝6.8Hz,1H),6.47(d,J＝6.6Hz,1H),4.71–4.40(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.37,155.31,152.87,144.50,143.30,143.19,142.43,131.71,131.15,130.96,130.10,128.41,125.84,125.80,125.77,122.63,122.48,122.10,120.99,118.47,117.66,117.48,116.13,115.13,111.94,96.17,45.83.19FNMR(376MHz,DMSO)δ-131.48.HRMS-ESI:calcd for C24H19FN3O[M+H]+384.1513,found:384.1515.
N-(3-(3-氟苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90b)
Figure BDA0002457983660000154
黄色固体，收率：75％.M.P.114.3–115.9℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.85(s,1H),8.32(s,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝6.1Hz,2H),7.33(dt,J＝14.7,7.9Hz,2H),7.24(d,J＝7.6Hz,1H),7.15–7.01(m,3H),6.97–6.85(m,2H),6.84–6.69(m,2H),6.50(t,J＝6.4Hz,1H),4.53(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ164.53,162.09,158.93,158.82,156.09,152.85,144.69,142.43,131.70,131.68,131.58,131.16,130.97,130.32,128.41,123.61,122.09,120.97,118.50,118.47,117.60,114.40,114.37,111.94,110.36,110.15,106.16,105.92,96.17,45.81.19F NMR(376MHz,DMSO)δ-110.93.HRMS-ESI:calcd for C24H19FN3O[M+H]+384.1513,found:384.1515.
N-(3-(4-氟苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90c)
Figure BDA0002457983660000161
黄色固体，收率：72％.M.P.118.1–119.4℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.36–8.27(m,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.49–7.36(m,2H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.23–7.05(m,5H),7.03(t,J＝2.0Hz,1H),7.02–6.91(m,2H),6.79(dd,J＝8.2,2.5Hz,1H),6.47(t,J＝6.3Hz,1H),4.50(d,J＝6.2Hz,2H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ159.73,157.44,153.10,152.87,144.47,142.42,131.70,131.14,130.97,130.15,128.41,122.76,122.09,120.96,120.94,120.85,118.47,117.43,117.02,116.78,116.48,111.95,96.16,45.84.19F NMR(376MHz,DMSO)δ-120.08.HRMS-ESI:calcdfor C24H19FN3O[M+H]+384.1513,found:384.1511.
N-(3-(2-氯苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90d)
Figure BDA0002457983660000162
黄色固体，收率：62％.M.P.149.7-151.2℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.53(dt,J＝7.6,1.3Hz,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),7.46–7.39(m,3H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(ddd,J＝8.1,2.4,1.2Hz,2H),7.14–7.04(m,3H),6.91(dd,J＝7.7,2.1Hz,1H),6.50(t,J＝6.3Hz,1H),4.54(d,J＝6.2Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ156.87,152.80,152.02,144.55,142.46,131.70,131.15,131.11,130.93,130.15,129.11,128.37,125.69,125.01,122.85,122.07,121.37,120.94,118.41,116.81,115.76,111.97,96.19,45.83.HRMS-ESI:calcd for C24H19ClN3O[M+H]+400.1217,found:400.1214.
N-(3-(3-氯苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90e)
Figure BDA0002457983660000163
黄色固体，收率：73％.M.P.111.2–112.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.48–7.37(m,2H),7.33(dt,J＝15.4,8.0Hz,2H),7.24(d,J＝7.7Hz,1H),7.16–7.03(m,4H),6.98(t,J＝2.1Hz,1H),6.94–6.85(m,2H),6.51(t,J＝6.4Hz,1H),4.53(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ158.49,156.04,152.81,144.74,142.42,134.38,131.76,131.70,131.15,130.97,130.34,128.40,123.66,123.46,122.09,120.96,118.51,118.42,117.63,117.16,111.92,96.17,45.79.HRMS-ESI:calcd for C24H19ClN3O[M+H]+400.1217,found:400.1210.
N-(3-(4-氯苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90f)
Figure BDA0002457983660000164
黄色固体，收率：66％.M.P.129.2–130.1℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.48–7.37(m,2H),7.37–7.27(m,3H),7.21(d,J＝7.6Hz,1H),7.15–7.03(m,3H),7.01–6.90(m,2H),6.85(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.50(t,J＝6.4Hz,1H),4.52(d,J＝5.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ156.54,156.18,152.81,144.57,142.43,131.72,131.14,130.92,130.26,130.19,128.42,127.39,123.29,122.10,120.94,120.41,118.47,118.08,117.22,111.95,96.19,45.81.HRMS-ESI:calcd for C24H19ClN3O[M+H]+400.1217,found:400.1210.
N-(3-(2-甲基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90g)
Figure BDA0002457983660000171
黄色固体，收率：73％.M.P.79.8–80.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.32(d,J＝1.1Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.48–7.37(m,3H),7.31–7.20(m,2H),7.15–7.04(m,4H),6.95(t,J＝1.9Hz,1H),6.83(d,J＝7.8Hz,1H),6.69(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),6.45(t,J＝6.3Hz,1H),4.49(d,J＝6.3Hz,2H),2.10(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.73,154.33,152.88,144.28,142.42,131.87,131.70,131.12,130.95,130.02,129.56,128.56,128.39,127.74,124.47,122.02,120.98,119.85,118.45,116.35,115.36,111.93,96.15,45.91,16.26.HRMS-ESI:calcd forC25H22N3O[M+H]+380.1764,found:380.1758.
N-(3-(3-甲基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90h)
Figure BDA0002457983660000172
黄色固体，收率：74％.M.P.49.8–50.6℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.32(s,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.45–7.39(m,2H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.17(t,J＝7.7Hz,2H),7.11–7.01(m,3H),6.88(d,J＝7.5Hz,1H),6.80(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),6.77–6.67(m,2H),6.48(t,J＝6.4Hz,1H),4.51(d,J＝6.3Hz,2H),2.20(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.13,157.07,152.86,144.38,142.42,140.07,131.69,131.13,130.96,130.08,130.04,128.39,124.40,122.74,120.97,119.40,118.45,117.86,116.98,115.94,111.93,96.12,45.84,21.32.HRMS-ESI:calcdfor C25H22N3O[M+H]+380.1764,found:380.1761.
N-(3-(4-甲基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90i)
Figure BDA0002457983660000173
黄色固体，收率：70％.M.P.51.9–52.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.33(s,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(d,J＝5.8Hz,2H),7.28(t,J＝7.8Hz,1H),7.16–7.11(m,1H),7.11–7.04(m,4H),7.01(t,J＝1.9Hz,1H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.78(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.46(t,J＝6.2Hz,1H),4.50(d,J＝6.0Hz,2H),2.21(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.53,154.61,152.86,144.27,142.42,132.83,131.69,131.12,130.94,130.70,130.02,128.39,122.41,122.08,120.97,119.11,118.45,117.30,116.46,111.93,96.16,45.85,20.64.HRMS-ESI:calcdfor C25H22N3O[M+H]+380.1764,found:380.1763.
N-(3-(2-甲氧基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90j)
Figure BDA0002457983660000174
黄色固体，收率：75％.M.P.91.2–92.4℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.07(s,1H),8.34(d,J＝0.9Hz,1H),8.10(d,J＝1.4Hz,1H),7.43(d,J＝1.3Hz,2H),7.21(t,J＝7.9Hz,1H),7.13(ddd,J＝8.7,7.0,1.7Hz,1H),7.11–7.04(m,3H),6.95(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),6.92–6.86(m,2H),6.61(dd,J＝7.9,2.1Hz,1H),6.51(d,J＝6.4Hz,1H),4.45(d,J＝6.3Hz,2H),3.65(s,3H).HRMS-ESI:calcd for C25H22N3O2[M+H]+396.1713,found:396.1719.
N-(3-(3-甲氧基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90k)
Figure BDA0002457983660000181
黄色固体，收率：70％.M.P.112.3–113.4℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.34(s,1H),7.99(d,J＝7.9Hz,1H),7.42(q,J＝5.8,4.2Hz,2H),7.31(t,J＝7.8Hz,1H),7.19(t,J＝8.0Hz,2H),7.13–7.01(m,3H),6.89–6.79(m,1H),6.65(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.59–6.39(m,3H),4.53(d,J＝6.4Hz,2H),3.66(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ161.10,158.38,156.77,152.86,144.42,142.42,131.70,131.13,130.96,130.80,130.11,128.39,122.97,122.08,120.97,118.45,118.02,117.16,111.93,110.75,109.36,104.90,96.10,55.62,45.84.HRMS-ESI:calcd forC25H22N3O2[M+H]+396.1713,found:396.1710.
N-(3-(4-甲氧基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90l)
Figure BDA0002457983660000182
黄色固体，收率：75％.M.P.116.6–118.3℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.06(s,1H),8.35(d,J＝0.9Hz,1H),8.12(d,J＝1.4Hz,1H),7.43(d,J＝1.4Hz,2H),7.26(t,J＝7.8Hz,1H),7.10(d,J＝7.0Hz,2H),7.07-7.03(m,1H),6.97(t,J＝2.0Hz,1H),6.94–6.89(m,2H),6.89–6.83(m,2H),6.73(dd,J＝8.2,2.5Hz,1H),6.53(t,J＝6.4Hz,1H),4.47(d,J＝6.3Hz,2H),3.69(s,3H).HRMS-ESI:calcd forC25H22N3O2[M+H]+396.1713,found:396.1707.
N-(2-(3-(((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)氨基)甲基)苯氧基)苯基)乙酰胺(90m)
Figure BDA0002457983660000183
黄色固体，收率：75％.M.P.94.3–95.6℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),9.43(s,1H),8.34(s,1H),7.98(dd,J＝12.4,7.9Hz,2H),7.43(d,J＝5.4Hz,2H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.19(d,J＝7.6Hz,1H),7.13–7.00(m,4H),6.97(t,J＝7.4Hz,1H),6.84–6.73(m,2H),6.49(t,J＝6.4Hz,1H),4.52(d,J＝6.2Hz,2H),2.00(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.10,156.99,152.85,147.86,144.28,142.40,131.68,131.11,130.96,130.24,129.97,128.40,124.98,124.12,123.68,122.82,122.08,120.95,118.68,118.46,117.87,116.91,111.93,96.08,45.85,24.09.HRMS-ESI:calcd for C26H23N4O2[M+H]+423.1822,found:423.1820.
N-(3-(3-(((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)氨基)甲基)苯氧基)苯基)乙酰胺(90n)
Figure BDA0002457983660000184
黄色固体，收率：73％.M.P.108.2–109.8℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.94(s,1H),10.11(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(q,J＝7.2,6.2Hz,2H),7.37–7.24(m,3H),7.24–7.14(m,2H),7.14–6.94(m,3H),6.82(d,J＝7.6Hz,1H),6.60(dd,J＝8.0,2.4Hz,1H),6.51(t,J＝6.3Hz,1H),4.51(d,J＝5.9Hz,2H),2.01(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.97,157.39,156.96,152.82,144.37,142.48,141.40,131.76,131.13,130.85,130.28,130.10,128.41,122.84,122.12,120.94,118.45,118.02,117.07,114.24,113.29,111.96,109.50,96.18,45.86,24.46.HRMS-ESI:calcd for C26H23N4O2[M+H]+423.1822,found:423.1820.
N-(4-(3-(((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)氨基)甲基)苯氧基)苯基)乙酰胺(90o)
Figure BDA0002457983660000191
黄色固体，收率：72％.M.P.107.8–109.2℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.85(s,1H),9.91(s,1H),8.33(d,J＝1.0Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.59–7.50(m,2H),7.46–7.38(m,2H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(d,J＝7.7Hz,1H),7.11–7.05(m,2H),7.03(t,J＝2.0Hz,1H),6.97–6.89(m,2H),6.76(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),6.46(t,J＝6.4Hz,1H),4.49(d,J＝6.3Hz,2H),2.02(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.49,157.82,152.91,152.01,144.32,142.42,135.66,131.69,131.13,130.98,130.03,128.40,122.34,122.09,121.08,120.97,119.77,118.48,117.16,116.17,111.95,96.09,45.91,24.34.HRMS-ESI:calcd for C26H23N4O2[M+H]+423.1822,found:423.1820.
2-(3-(((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)氨基)甲基)苯氧基)苯基甲氰(90p)
Figure BDA0002457983660000192
黄色固体，收率：75％.M.P.189.8–190.9℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.33(d,J＝0.8Hz,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.84(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.53(ddd,J＝8.9,7.5,1.7Hz,1H),7.46–7.36(m,3H),7.30(d,J＝7.7Hz,1H),7.25–7.19(m,1H),7.17(d,J＝2.1Hz,1H),7.13–7.04(m,2H),6.97(dd,J＝7.9,1.9Hz,1H),6.88(d,J＝8.4Hz,1H),6.52(t,J＝6.4Hz,1H),4.55(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ159.22,155.32,152.81,144.98,142.43,135.57,134.55,131.72,131.18,130.97,130.52,128.42,124.33,124.05,122.12,120.97,118.62,118.48,117.86,117.76,116.36,111.94,103.23,96.26,45.77.HRMS-ESI:calcd for C25H19N4O[M+H]+391.1560,found:391.1557.
3-(3-(((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)氨基)甲基)苯氧基)苯基甲氰(90q)
Figure BDA0002457983660000193
黄色固体，收率：75％.M.P.62.4–63.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.53(dt,J＝7.6,1.3Hz,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),7.46–7.39(m,3H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(ddd,J＝8.1,2.5,1.3Hz,2H),7.15–7.03(m,3H),6.91(dd,J＝7.7,2.1Hz,1H),6.50(t,J＝6.3Hz,1H),4.54(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.77,155.83,152.83,144.84,142.43,131.77,131.71,131.16,130.97,130.42,128.41,127.36,123.85,123.51,122.10,121.79,120.96,118.60,118.51,118.47,117.62,113.15,111.94,96.19,45.81.HRMS-ESI:calcd for C25H19N4O[M+H]+391.1560,found:391.1555.
4-(3-(((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)氨基)甲基)苯氧基)苯基甲氰(90r)
Figure BDA0002457983660000194
黄色固体，收率：76％.M.P.60.1–61.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.33(s,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.77–7.70(m,2H),7.47–7.36(m,3H),7.31(d,J＝7.7Hz,1H),7.15(t,J＝1.9Hz,1H),7.12–7.05(m,2H),7.05–6.99(m,2H),6.96(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),6.52(t,J＝6.4Hz,1H),4.55(d,J＝6.3Hz,2H).HRMS-ESI:calcd for C25H19N4O[M+H]+391.1560,found:391.1558.
N-(3-(4-(三氟甲基)苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90s)
Figure BDA0002457983660000201
黄色固体，收率：75％.M.P.176.1–177.3℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.32(d,J＝1.0Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H),7.46–7.40(m,2H),7.40–7.35(m,1H),7.29(d,J＝7.7Hz,1H),7.15(t,J＝2.0Hz,1H),7.12–7.03(m,4H),6.95(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),6.52(t,J＝6.3Hz,1H),4.54(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ160.88,155.31,152.80,144.86,142.43,131.69,131.16,130.98,130.49,128.42,127.80,127.76,124.17,122.08,120.94,119.07,118.46,118.26,118.17,111.95,96.20,45.76.19F NMR(376MHz,DMSO)δ-60.18.HRMS-ESI:calcdfor C25H19F3N3O[M+H]+434.1481,found:434.1474.
N-(3-(4-(甲硫基)苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90t)
Figure BDA0002457983660000202
黄色固体，收率：71％.M.P.124.0–125.2℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.34(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.48–7.38(m,2H),7.31(t,J＝7.8Hz,1H),7.25–7.15(m,3H),7.12–7.03(m,3H),6.96–6.87(m,2H),6.82(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.49(t,J＝6.4Hz,1H),4.52(d,J＝6.2Hz,2H),2.40(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.09,154.88,152.87,144.40,142.44,132.52,131.71,131.15,130.99,130.16,128.80,128.42,122.83,122.10,120.98,119.77,118.48,117.65,116.80,111.96,96.16,45.87,16.16.HRMS-ESI:calcd for C25H22N3OS[M+H]+412.1484,found:412.1481.
N-(3-([1,1’-联苯基]-4-基氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90u)
Figure BDA0002457983660000203
黄色固体，收率：74％.M.P.183.2–184.7℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.52(dd,J＝7.9,5.2Hz,4H),7.48–7.37(m,4H),7.33(q,J＝8.0Hz,2H),7.21(d,J＝7.7Hz,1H),7.10-7.05(m,3H),6.99(d,J＝8.3Hz,2H),6.93–6.83(m,1H),6.58–6.46(m,1H),4.53(d,J＝6.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.89,156.65,152.80,144.43,142.47,139.91,135.52,131.76,131.14,130.89,130.24,129.35,128.57,128.45,127.54,126.83,123.09,122.13,120.97,118.96,118.50,118.08,117.30,111.97,96.24,45.83.HRMS-ESI:calcdfor C30H24N3O[M+H]+442.1920,found:442.1917.
N-(3-(4-苯氧基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90v)
Figure BDA0002457983660000204
黄色固体，收率：72％.M.P.135.3–137.1℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.33(s,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.39(dq,J＝15.9,8.1Hz,4H),7.30(t,J＝7.9Hz,1H),7.17(d,J＝7.7Hz,1H),7.14–7.03(m,4H),6.97(d,J＝9.2Hz,6H),6.82(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),6.49(t,J＝6.4Hz,1H),4.52(d,J＝6.2Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.70,157.54,152.89,152.73,152.50,144.42,142.43,131.70,131.14,130.97,130.46,130.12,128.40,123.62,122.63,122.08,120.96,120.89,120.75,118.52,118.46,117.43,116.47,111.94,96.15,45.87.HRMS-ESI:calcdfor C30H24N3O2[M+H]+458.1869,found:458.1870.
N-(3-(4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90w)
Figure BDA0002457983660000211
黄色固体，收率：70％.M.P.71.3–73.2℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.35–8.30(m,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.39(m,2H),7.33–7.23(m,3H),7.15(d,J＝7.7Hz,1H),7.10–7.05(m,2H),7.03(t,J＝1.9Hz,1H),6.88–6.80(m,2H),6.77(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),6.47(t,J＝6.3Hz,1H),4.51(d,J＝6.2Hz,2H),1.65(s,2H),1.26(s,6H),0.64(s,9H).HRMS-ESI:calcd for C32H36N3O[M+H]+478.2859found:478.2856.
N-(3-(3,4-二甲氧基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90x)
Figure BDA0002457983660000212
黄色固体，收率：75％.M.P.148.8–150.2℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.06(s,1H),8.35(d,J＝0.9Hz,1H),8.12(d,J＝1.4Hz,1H),7.43(d,J＝1.3Hz,2H),7.26(t,J＝7.8Hz,1H),7.15–7.05(m,2H),7.00(t,J＝1.9Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,1H),6.75(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),6.66(d,J＝2.7Hz,1H),6.54(t,J＝6.4Hz,1H),6.43(dd,J＝8.7,2.7Hz,1H),4.47(d,J＝6.2Hz,2H),3.68(s,3H),3.64(s,3H).HRMS-ESI:calcdfor C26H24N3O3[M+H]+426.1818,found:426.1810.
N-(3-(3,4,5-三甲氧基苯氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(90y)
Figure BDA0002457983660000213
黄色固体，收率：75％.M.P.181.6–182.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.31(s,1H),7.99(d,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝5.8Hz,2H),7.29(t,J＝7.9Hz,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),7.11–6.97(m,3H),6.81(dd,J＝8.0,2.4Hz,1H),6.50(t,J＝6.1Hz,1H),6.28(s,2H),4.51(d,J＝6.2Hz,2H),3.61(s,6H),3.59(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ161.59,154.77,152.79,144.97,142.42,134.97,131.70,131.17,130.98,130.56,128.44,124.53,122.10,120.94,119.38,119.14,118.53,118.49,118.33,111.96,105.37,96.25,45.76.HRMS-ESI:calcd for C27H26N3O4[M+H]+456.1924,found:456.1924.
N-(3-(吡啶-3-基氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(91a)
Figure BDA0002457983660000214
黄色固体，收率：62％.M.P.133.9–135.7℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.91(s,1H),8.45–8.24(m,3H),8.00(d,J＝7.7Hz,1H),7.47–7.29(m,5H),7.23(d,J＝7.7Hz,1H),7.17–7.01(m,3H),6.89(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),6.51(t,J＝6.4Hz,1H),4.53(d,J＝5.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.42,153.73,152.84,144.82,144.74,142.43,141.30,131.70,131.15,130.97,130.36,128.42,125.91,125.00,123.47,122.11,120.96,118.48,117.90,117.01,111.94,96.18,45.81.HRMS-ESI:calcdfor C23H19N4O[M+H]+367.1560,found:367.1557.
N-(3-(苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(91b)
Figure BDA0002457983660000221
黄色固体，收率：75％.M.P.64.5-65.1℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.88(s,1H),8.33(d,J＝0.9Hz,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.39(m,2H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),7.13(d,J＝7.7Hz,1H),7.11–7.05(m,2H),7.01(t,J＝2.0Hz,1H),6.83(d,J＝8.4Hz,1H),6.76(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,1H),6.47(t,J＝6.4Hz,1H),6.43(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),5.99(s,2H),4.50(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ158.17,152.89,151.19,148.59,144.27,143.92,142.43,131.70,131.13,130.94,129.99,128.40,122.23,122.10,120.97,118.46,116.81,115.87,112.07,111.93,108.81,102.34,101.97,96.12,45.88.HRMS-ESI:calcd for C25H10N3O3[M+H]+410.1505,found:410.1508.
N-(3-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基)氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(91c)
Figure BDA0002457983660000222
黄色固体，收率：68％.M.P.74.9–76.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.96(s,1H),8.33(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.39(m,2H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),7.16–7.05(m,3H),7.01(t,J＝1.9Hz,1H),6.80(d,J＝8.7Hz,1H),6.76(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.58–6.47(m,2H),6.45(dd,J＝8.7,2.8Hz,1H),4.49(d,J＝5.2Hz,2H),4.18(t,J＝2.7Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.91,152.84,150.45,144.31,144.24,142.46,140.12,131.70,131.14,130.92,129.98,128.39,122.28,122.09,120.95,118.43,118.06,117.03,116.08,112.37,111.95,108.53,96.11,64.64,64.26,45.89.HRMS-ESI:calcd for C26H22N3O3[M+H]+424.1662,found:424.1664.
N-(3-(喹啉-6-基氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(91d)
Figure BDA0002457983660000223
黄色固体，收率：75％.M.P.86.7–88.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.86(s,1H),8.78(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.31(d,J＝0.9Hz,1H),8.12–8.06(m,1H),7.98(dd,J＝8.4,4.4Hz,2H),7.48(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),7.46–7.34(m,4H),7.30(d,J＝2.7Hz,1H),7.26(d,J＝7.8Hz,1H),7.17(t,J＝2.0Hz,1H),7.12–7.02(m,2H),6.95(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),6.51(t,J＝6.4Hz,1H),4.54(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.47,155.31,152.83,149.62,145.01,144.69,142.43,135.56,131.69,131.56,131.13,130.98,130.37,129.17,128.41,123.53,123.34,122.23,122.10,120.96,118.47,118.41,117.64,113.20,111.94,96.14,45.81.HRMS-ESI:calcd forC27H21N4O[M+H]+417.1716,found:417.1717.
N-(3-(苄氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(91e)
Figure BDA0002457983660000224
黄色固体，收率：72％.M.P.147.4–148.0℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.35(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.41(t,J＝6.0Hz,4H),7.35(t,J＝7.3Hz,2H),7.32–7.25(m,1H),7.21(t,J＝7.9Hz,1H),7.15–7.03(m,3H),6.99(d,J＝7.5Hz,1H),6.88–6.79(m,1H),6.45(t,J＝6.3Hz,1H),5.06(s,2H),4.50(d,J＝6.2Hz,2H).HRMS-ESI:calcd for C25H22N3O[M+H]+380.1764,found:380.1761.
N-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(91f)
Figure BDA0002457983660000231
黄色固体，收率：76％.M.P.174.8–175.3℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.87(s,1H),8.34(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝5.9Hz,2H),7.32(d,J＝8.5Hz,2H),7.19(t,J＝7.9Hz,1H),7.14–7.02(m,3H),6.97(d,J＝7.6Hz,1H),6.87(d,J＝8.5Hz,2H),6.84–6.77(m,1H),6.44(t,J＝6.2Hz,1H),4.96(s,2H),4.49(d,J＝6.1Hz,2H),3.71(s,3H).HRMS-ESI:calcd for C26H24N3O2[M+H]+410.1869,found:410.1869.
实施例6、化合物93、94的合成
Figure BDA0002457983660000232
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛(92)
向25mL圆底烧瓶中加入0.20g 9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)甲醇(16,1.0mmol)，0.87gMnO2(10.0mmol)，10mL二氯甲烷作溶剂，回流搅拌反应4h。反应毕，硅藻土过滤，10mL二氯甲烷洗涤，滤液旋干，Flash柱分离纯化得0.168g白色固体，收率：86％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ12.19(s,1H),10.12(s,1H),9.08(s,1H),8.83(s,1H),8.43(d,J＝7.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.3Hz,1H),7.63(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.35(ddd,J＝8.0,7.0,1.1Hz,1H).
N-((9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)甲基)-3-苯氧基苯胺(93)
向25mL的圆底烧瓶中加入0.20g(1.0mmol)化合物92，0.20g(1.1mmol)间苯氧基苯胺，0.43g(1.5mmol)钛酸四异丙酯(Ti(iOPr)4)及0.1mLTHF，室温反应4h后，向体系中加入10mL乙醇，1.06g(5.0mmol)NaBH(OAc)3，继续反应5h。反应毕，搅拌下向反应体系中再加入15mL乙醇，1mL水淬灭过量的钛酸四异丙酯，硅藻土过滤，滤液旋干，柱层析分离得黄色固体93，收率：75％。M.P.152.6–153.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.55(s,1H),8.89–8.73(m,1H),8.17(d,J＝7.9Hz,1H),8.06(s,1H),7.65–7.46(m,2H),7.35–7.25(m,2H),7.22(ddd,J＝8.0,6.8,1.1Hz,1H),7.05(td,J＝7.7,5.2Hz,2H),6.97–6.85(m,2H),6.55(t,J＝5.8Hz,1H),6.46(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),6.30(t,J＝2.2Hz,1H),6.13(dd,J＝7.9,2.3Hz,1H),4.47(d,J＝5.7Hz,2H).HRMS-ESI:calcd for C24H20N3O[M+H]+366.1607,found:366.1603.
3-((3-苯氧基苯氧基)甲基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(94)
向10mL圆底烧瓶中加入0.22g3-(chloromethyl)-9H-pyrido[3,4-b]indole(17,1.0mmol)，0.21g(1.1mmol)间苯氧基苯酚，0.21g(1.5mmol)K2CO3，催化量的KI，2mL DMF，80℃下反应4h。反应毕，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸钠干燥，旋干，Flash柱分离纯化得0.274黄色固体94，收率75％。M.P.164.3–166.1℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.65(s,1H),8.86(s,1H),8.25(t,J＝4.0Hz,2H),7.60(d,J＝8.2Hz,1H),7.58–7.51(m,1H),7.41–7.33(m,2H),7.32–7.20(m,2H),7.14(t,J＝7.3Hz,1H),7.06–6.95(m,2H),6.87(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),6.72(t,J＝2.3Hz,1H),6.56(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),5.28(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ160.40,158.36,156.84,145.08,141.44,135.90,133.68,130.99,130.46,128.73,124.04,122.35,121.05,119.83,119.30,113.98,112.50,111.11,110.43,106.03,71.92.HRMS-ESI:calcd for C24H19N2O2[M+H]+367.1447,found:367.1448.
实施例7、化合物95、96的合成
Figure BDA0002457983660000241
向10mL圆底烧瓶中加入0.37g(1.0mmol)化合物9，0.31g(2.0mmol)碘乙烷，0.55g(3.0mmol)K2CO3，2mL DMF，80℃下反应4h。反应毕，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸钠干燥，旋干，Flash柱分离纯化得0.16g黄色固体95，收率40％,0.11g黄色液体96，收率：26％。
N-乙基-N-(3-苯氧基苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(95)
黄色固体，收率：40％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.90(s,1H),8.41(d,J＝1.0Hz,1H),8.07(d,J＝7.9Hz,1H),7.46–7.40(m,2H),7.34–7.26(m,3H),7.23(s,1H),7.11–7.03(m,3H),6.97–6.90(m,3H),6.83(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),4.79(s,2H),3.60(q,J＝7.0Hz,2H),1.14(t,J＝7.0Hz,3H).CalcdForC26H24N3O[M+H]+:394.1920,found:394.1917.
N,9-二乙基-N-(3-苯氧基苄基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-胺(96)
黄色液体，收率：26％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.53(d,J＝0.8Hz,1H),8.11(d,J＝7.8Hz,1H),7.56–7.47(m,2H),7.35–7.24(m,4H),7.14–7.03(m,3H),6.97–6.90(m,3H),6.83(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),4.81(s,2H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),3.61(q,J＝7.0Hz,2H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H),1.14(t,J＝7.0Hz,3H).CalcdForC28H28N3O[M+H]+:422.2233,found:422.2227.
实施例8、化合物99的合成
Figure BDA0002457983660000242
4-溴-N-(3-苯氧基苄基)吡啶-2-胺(98)的合成方法同89a的合成。白色固体，收率：90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ7.83(d,J＝5.4Hz,1H),7.43–7.25(m,4H),7.18–7.05(m,2H),7.01–6.90(m,3H),6.85(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.71(d,J＝1.5Hz,1H),6.68(dd,J＝5.4,1.7Hz,1H),4.46(d,J＝6.1Hz,2H).
4-(2-氨基苯基)-N-(3-苯氧基苄基)吡啶-2-胺(99)
向50mL的三口瓶中加入0.36g(1.0mmol)化合物98，0.14g(1.0mmol)邻氨基苯硼酸，0.22g(2.0mmol)Na2CO3，0.12g(0.05mmol)Pd(PPh3)4，20mL1,4-dioxane/H2O(4/1,v/v)，N2置换15min，在N2保护下置于85℃油浴中反应8h。反应毕，加入20mL乙酸乙酯，硅藻土过滤，10mL乙酸乙酯洗涤，滤液旋干，Flash柱分离纯化得0.25g黄色固体99，收率：69％。M.P.36.8–37.5℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ7.99(d,J＝5.2Hz,1H),7.42–7.26(m,3H),7.19–7.00(m,5H),7.02–6.90(m,3H),6.84(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),6.74(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),6.61(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),6.59–6.47(m,2H),4.84(s,2H),4.51(d,J＝6.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.56,157.09,157.04,148.43,148.37,145.43,143.68,130.44,130.22,129.77,129.28,124.28,123.78,122.79,118.96,117.83,117.09,117.05,115.82,112.70,107.89,44.41.HRMS-ESI:calcd for C24H22N3O[M+H]+368.1764,found:368.1761.
实施例9、化合物104的合成
Figure BDA0002457983660000251
(E)-3-(二甲基氨基)-1-(2-硝基苯基)丙-2-烯-1-酮(101)
在250mL的圆底烧瓶中加入8.3g(50.0mmol)邻硝基苯乙酮，13.2g(55.0mmol)N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(DMF-DMA)，20mL DMF,升温至100℃反应8h，反应毕，冷却至室温，将反应液倾倒入200mL冰水中，析出黄色固体，抽滤，真空干燥，9.7g化合物101，收率：88％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ7.91(d,J＝7.3Hz,1H),7.72(dd,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.62(td,J＝7.8,1.5Hz,2H),5.35(d,J＝11.8Hz,1H),3.11(s,3H),2.87(s,3H).
4-(2-硝基苯基)嘧啶-2-胺(102)
向250mL的圆底烧瓶中加入1.9g(20.0mmol)盐酸胍，5.52g(40.0mmol)K2CO3，80mL无水乙醇，搅拌下加入2.2g(10.0mmol)化合物101，回流搅拌反应16h，反应毕，旋干溶剂，加入100mL水，搅拌1h，抽滤，10mL冰水洗涤，真空干燥，得2.0g淡黄色固体102，收率：94％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.36(d,J＝5.0Hz,1H),7.99(dd,J＝8.4,1.3Hz,1H),7.84–7.76(m,1H),7.74–7.66(m,2H),6.81(d,J＝5.0Hz,1H),6.71(s,2H).
5H-嘧啶并[5,4-b]吲哚-2-胺(103)
向50mL圆底烧瓶中加入0.43g(2.0mmol)化合物102，1.05g(4.0mmol)PPh3，20mL邻二氯苯，体系用N2置换15分钟，然后升温至170℃反应24小时。反应毕，冷却至室温，蒸发浓缩溶剂，Flash柱分离纯化得0.30g黄色固体103，收率81％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.02(s,1H),8.61(s,1H),8.01(d,J＝7.9Hz,1H),7.50(d,J＝5.7Hz,2H),7.15(ddd,J＝7.9,5.9,1.9Hz,1H),6.13(s,2H).
N-(3-(苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基氧基)苄基)-5H-嘧啶并[5,4-b]吲哚-2-胺(104)
104的合成方法同89a的合成。黄色固体，收率：71％。M.P.59.6–60.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.03(s,1H),8.62(s,1H),7.99(d,J＝7.9Hz,1H),7.55–7.43(m,2H),7.31–7.20(m,2H),7.17–7.06(m,2H),6.99(t,J＝1.9Hz,1H),6.81(d,J＝8.4Hz,1H),6.76(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.64(d,J＝2.3Hz,1H),6.42(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),5.97(s,2H),4.56(d,J＝6.4Hz,2H).HRMS-ESI:calcd for C24H19N4O3[M+H]+411.1458,found:411.1458.
药效学试验部分
以下代表性实验(不限于此)用于分析本发明化合物的生物活性。
1、化合物的体外抗肿瘤活性试验
考察了化合物在MCF-7(人乳腺癌)，HeLa(宫颈癌)，Raji(淋巴瘤)，H460(肺癌)和A2780S(人卵巢癌)这5个肿瘤细胞株上的抗肿瘤活性，以秋水仙碱和9(
Figure BDA0002457983660000252
a指的是咔啉环)作为阳性药物。实验方法如下：选用对数生长期的肿瘤细胞MCF-7，HeLa，H460，Raji，A2780S，用胰酶消化后，用完全培养基配成浓度为5×103个/mL的细胞悬液接种到96孔板中，每孔200μL，培养过夜后加入不同浓度梯度的候选化合物，处理72h，小心其取上清，每孔加入200μL新鲜配置的含有0.2mg/mL的MTT无血清培养基继续培养4h，小心弃去上清，并加入200mL DMSO，待完全溶解后酶标仪检测570nm处的吸光度值。重复三次取平均值。并用软件计算IC50值。结果如表1所。
表1、化合物的体外抗肿瘤活性
Figure BDA0002457983660000261
Figure BDA0002457983660000271
从表1可以看出，脂肪链(89a-d)或脂肪环(89e-f)替代b环会导致抗肿瘤活性显著下降。当用较大的芳香环(89k-q)取代b环时，抗肿瘤活性同样大幅下降(>500nM)。但用相对苯环较小的杂环(89g-j，除89i外)替代b环，对MCF-7、HeLa、Raji、H460和A2780S细胞的增殖抑制作用与9和秋水仙碱相似，特别以化合物89h(IC50＝73、93、43、87和63nM)的活性最佳。但相较苯环来说要大得多的1-芘基89q的IC50值更是大于20μM。因此，对b环的改构表明脂肪链、脂肪环和较苯环更大的芳香环替代b环不利于活性的提高，较苯环更小的杂环3-噻吩和3-呋喃环替代b环不会造成活性下降，但也不会使活性提高。所以影响活性的可能并不是b环与Tyr200之间弱的π-π相互作用，影响活性的可能是空间位阻。
在c环上引入小的、疏水性的取代基大体上能够保证其活性能与9相当(90a-n)，即使部分化合物活性有所下降，也不会低于1μM。对比90j和90m我们发现，在c环2位上引入体积稍大的-OCH3和-NHCOCH3,活性会下降。在c环3位上引入疏水基团能够使活性保持(90b,90e,90h,90k,90n)。对比90a-r的结构特点和抗肿瘤活性，c环4位不管是供电子取代基(90c,90f,90i,90l,90o)还是吸电子取代基(90r)，活性都不会降低，部分化合物较9更优。当然这些取代基都有一个共同点，都是体积小且疏水的。于是我们在c环4位又引入了体积较小的强吸电子的-CF3(90s)，体积较大的-SCH3(90t)，体积很大的苯基(90u)，苯氧基(90v)，4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)(90w)，只有90s活性能够保持。4位上体积较大的取代基的引入都会导致活性明显下降。由于c环3位引入小的取代基不会导致活性损失太明显，我们在c环的3,4位同时引入体积较小的疏水的-OCH3(90x)，同时在3,4,5位引入-OCH3(90y)，考察c环上的多取代对活性的影响。结果表明90x活性下降不是特别明显，但是90y活性下降非常明显。总的来说，c环与疏水中心I(见图1)之间的疏水相互作用对活性影响很大，c环4位上小的疏水的取代基有利于活性的保持和提高，取代基体积太大导致整个分子因为空间位阻太大进不到结合口袋内致使活性丧失。
为了验证c环与疏水中心I之间确实存在疏水相互作用，我们将c环的苯环换成了相对更亲水的吡啶环，合成了91a,结果91a的细胞活性下降了4-6倍，由此证明了c环确实与疏水中心I之间存在疏水相互作用。90x活性下降不是十分明显，可能的原因是3,4位的-OCH3空间位阻对活性的负影响和疏水相互作用对活性的正影响的叠加结果。而90y活性下降明显是因为3,4,5位三个-OCH3空间位阻对活性的影响大大超过疏水相互作用对活性的影响，或者三个-OCH3的空间位阻大到让整个分子进不到微管蛋白结合口袋内从而失去活性。基于此分析，我们将90x3,4位的-OCH3环合成一个二氧戊环或者二氧六环，在维持取代基的疏水作用的同时减小空间位阻，于是合成了化合物91b和91c。结果表明91b的细胞活性较9提高了5倍左右，而91c的细胞活性则下降了，这证明了c环与疏水中心I之间存在疏水相互作用的同时还受到空间位阻的影响。考虑到91c的二氧六环基团体积较大，不利于活性的提高，我们将二氧六环换成刚性的吡啶环，体积较二氧六环要小，于是合成了91d。91d的细胞活性较9略有下降，再次说明c环与疏水中心I的氨基酸残基之间存在空间相互作用。既然c环4位较小的疏水性的取代基利于化合物细胞活性的保持，我们也尝试了在c环1位引入亚甲基，试图让c环进入β-tubulin更深的位置，与疏水中心I更好的发挥疏水相互作用，于是合成了91e和91f。结果表明91e和91f活性下降非常明显，可能的原因是亚甲基的引入改变了c环的构象，c环构象的改变直接影响其与疏水中心I的相互作用，构象的改变同时可能引起更多的空间相互影响。
对c环的修饰和改构结果表明，在c环3位和4位引入体积较小的疏水性的取代基有利于活性的保持和提高。同时在3,4位引入体积较小的疏水性的二氧戊环基团的化合物91b活性最佳(IC50＝9±3,5±1,13±1,14±2,8±0.2nM)。c环与疏水中心I除了疏水相互作用外，还存在着空间相互作用，二者同时对活性构成影响。
14和15的细胞活性较9下降了近200倍，说明a环与疏水中心II之间的疏水相互作用对化合物的细胞活性影响也非常大。于是我们将化合物9的a环开环，合成了化合物99。结果表明，99的细胞活性(IC50＞20μM)较9下降了400多倍。
2、化合物的微管蛋白降解试验
考察了化合物(89b、89f、14、15、19、24)在HeLa细胞内对β-微管蛋白水平的影响，实验方法如下：选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用完全培养基配成浓度为5×105个/mL的细胞悬液接种到6孔板中，每孔2mL，培养过夜后加入不同浓度梯度的候选化合物，处理不同时间。收集细胞，提取总蛋白后进行western实验考察化合物对α-微管蛋白和β-微管蛋白表达水平的影响。结果见图2。
从图2发现，在较高浓度下，只有24不能下调细胞内β-微管蛋白的表达，其它化合物都能下调细胞内β-微管蛋白的表达，在100μM浓度下，下调效果非常明显。
把a环(咔啉环)替换成吡啶环(14)和异喹啉环(15)，以讨论a环是否是化合物促进微管蛋白降解的关键因素。14和15同样能促进微管蛋白降解，但是细胞活性较9下降了近200倍，说明a环与疏水中心II之间的疏水相互作用对化合物的细胞活性影响也非常大。于是我们将化合物9的a环开环，合成了化合物99。结果表明，99的细胞活性较48下降了400多倍(IC50＞20μM)。咔啉环开环以后，剩下的两个环不再共平面，空间构型较a环发生了很大的改变。这说明咔啉环特定的三环共平面大π共轭结构首先能够保证吡啶环2位的N原子能够与Glu198产生LBHB相互作用，其次能够保证其与疏水中心II之间产生很好的疏水相互作用。另外，咔啉环开环以后暴露出一个极性较大的氨基，这与疏水中心II的疏水作用是不相容的。以上三点证明了a环对化合物促进微管蛋白降解能力和细胞活性的重要性。
3、EBI实验
为了验证91b是否直接靶向秋水仙碱位点，用竞争性实验的方法在A2780S细胞上对其进行了考察。EBI(N,N′-ethylene-bis(iodoacetamide),EBI)是一种烷基化试剂，能与秋水仙碱结合位点上的β-微管蛋白的Cys239和Cys354残基产生特异性交联作用。EBI竞争性实验的原理是：EBI与β-微管蛋白形成的加合物的迁移速度快于β-微管蛋白本身，可作为第二种免疫反应的β-微管蛋白条带被Western blot检测到。抗有丝分裂药物占据秋水仙碱结合位点以后可抑制EBI与β-微管蛋白加合物的形成，Western blot就检测不到第二条带。实验方法如下：将HeLa细胞或纯化的微管蛋白与不同浓度的化合物共同孵育2h,再与100μMEBI孵育2h,提取总蛋白，用负载缓冲液孵育，然后在沸水中变性10min。用β-微管蛋白抗体免疫印迹法检测β-微管蛋白带和EBI-β-微管蛋白带。实验结果如图3所示。
通过EBI竞争性实验发现，用5和25μM的长春新碱及100μM EBI处理过的A2780S细胞，只检测到移动较快的EBI和β-tubulin加和物的条带。用5μM的秋水仙碱及100μMEBI处理过的A2780S细胞只检测到移动较慢的β-tubulin native条带。但是用0.1,0.5,2.5μM和12.5μM的91b及100μM EBI处理过的A2780S细胞只检测到EBI和β-tubulin加和物的条带，说明91b确实是靶向秋水仙碱位点的，且随着浓度的升高加和物条带变细，说明随着91b浓度的升高促进微管蛋白降解的能力逐渐增强。当91b浓度增加到12.5μM时，β-tubulin native条带几乎完全消失。
4、91b通过泛素化-蛋白酶体途径促进微管蛋白降解
考察了蛋白酶体抑制剂MG132对91b促进的微管蛋白降解的影响。实验方法如下：选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用完全培养基配成浓度为5×105个/mL的细胞悬液接种到6孔板中，每孔2mL，培养过夜后加入不同浓度梯度的候选化合物，处理不同时间。并根据实验需要，在不同组别种加入蛋白酶体抑制剂MG132。收集细胞，提取总蛋白后进行western实验考察化合物对α-微管蛋白和β-微管蛋白表达水平的影响。实验结果如图4所示。
实验结果表明，化合物91b在1和10μM浓度下都能明显的促进微管蛋白降解，当加入100μM的MG132以后，αβ-tubulin完全不降解了。说明MG132能够抑制91b促进的微管蛋白降解，而蛋白酶体在泛素化途径过程中发挥着极其关键的作用，由此证明91b是通过蛋白酶体途径促进微管蛋白降解的。
5、免疫荧光实验证明91b能够清除微管蛋白
微管在细胞有丝分裂过程中发挥着重要作用，微管靶向剂能够干扰细胞有丝分裂活动，使有丝分裂被阻滞在某一个特定的时期从而诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。而诸如紫杉醇这类微管稳定剂会促使微管在有丝分裂过程中聚合，长春新碱和秋水仙碱这类微管去稳定剂会促使微管在有丝分裂过程中解聚，微管的形态在这些微管靶向剂的干扰下产生的形态变化可以通过免疫荧光实验清晰直观的观察到。因此我们又考察了不同浓度的91b在A2780S细胞上对微管形态变化的影响。
实验方法：细胞接种于6孔平板显微镜下24h后，用不同的化合物进行预处理，然后用PBS洗涤2min，再用50％甲醇/50％丙酮孵育3min。细胞经3％BSA缓冲液稀释后用一抗(3％BSA缓冲液)孵育4h,用PBS(4×10min)洗涤，用10％DAPI与荧光结合二抗体(10％DAPI)孵育1h,再用PBS(4×10min)冲洗。最后，用少量甘油将盖玻璃安装在显微镜下的玻片上。样品用荧光显微镜拍摄。不用任何微管抑制剂处理的A2780S细胞作为空白对照，实验组用91b(10，100，和1000nM)，紫杉醇taxol(100nM)，和秋水仙碱colchicine(100nM)处理A2780S细胞24h；绿色表示微管及未装配的微管，蓝色表示细胞核。实验结果如图5所示。
实验结果表明，空白对照组中正常的微管呈丝状，秋水仙碱处理过的细胞微管变得散乱，可以观察到明显的微管解聚现象，紫杉醇处理过的细胞微管聚合成团并向细胞核靠拢，跟以往报道过的现象相同。10nM的91b处理过的A2780S细胞微管看不出有降解的效果，但微管的形态跟空白对照和秋水仙碱处理过的又不太一样。随着91b浓度的升高，微管的形态和数量都发生了明显的变化，特别是91b的浓度到了1μM时，微管的形态完全发生了变化，且微管的数量明显减少，说明91b在细胞内促进了微管蛋白的降解。通过免疫荧光实验，我们更加直观的观察到91b是一个很好的微管蛋白清除剂。
6、91b能够克服β-tubulin III和P-gp过表达引起的耐药
目前化疗过程中产生的多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是导致一线化疗药物的失败的主要原因。临床前或临床研究中确定的共同耐药机制包括两大类：一类是被称作P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的细胞膜蛋白的过渡表达；另一类是由β-Ⅲ基因控制的不同类型的β-微管蛋白表达水平的改变。众所周知，紫杉醇对P-gp过表的A549/T(人肺癌细胞株)耐药，长春碱对P-gp过表的HCT-8/V(人结肠癌细胞株)耐药，阿霉素对P-gp过表的MCF-7/ADR(人乳腺癌细胞株)耐药；紫杉醇对β-tubulin III过表达的A2780/T(人卵巢癌细胞株)耐药11-13。91b在非耐药肿瘤细胞株上已经展现出良好的活性(IC50＝9±3(MCF-7),5±1(HeLa),13±1(Raji),14±2(H460),8±0.2(A2780S)nM)，我们对优选出的化合物91b是否能够克服耐药进行了进一步考察。实验方法如下：选用对数生长期的肿瘤细胞A2780S,A2780T,A549,A549T,MCF-7,MCF-7/ADR,用胰酶消化后，用完全培养基配成浓度为5×103个/mL的细胞悬液接种到96孔板中，每孔200μL,培养过夜后加入不同浓度梯度的候选化合物，处理72h,小心其取上清，每孔加入200μL新鲜配置的含有0.2mg/mL的MTT无血清培养基继续培养4h,小心弃去上清，并加入200mL DMSO,待完全溶解后酶标仪检测570nm处的吸光度值。重复三次取平均值。并用软件计算IC50值。考察结果如表2所示。
表2 化合物91b在耐药细胞株上的活性
Figure BDA0002457983660000301
aIC50＝抑制50％的肿瘤细胞增殖时的化合物浓度。数据是至少三次实验的平均值±标准差，用平均数±标准差表示。bDRI(Drug Resistant Index,耐药指数):(化合物在耐药细胞上的IC50值)/(化合物在亲代细胞上的IC50值).cND:未测。
药耐药考察结果表明，91b在敏感和耐药细胞株上都表现出了较好的细胞活性。在A2780T(β-tubulin III过表达),A549T(P-gp过表)和MCF-7/ADR(P-gp过表)三中耐药细胞株上的IC50值分别为13.1±0.5,63.8±1.3和13.5±1.4nM。91b的耐药指数分别为0.8(A2780S/T组),1.1(A549/T组),1.2(MCF-7/ADR组),较紫杉醇的974.4(A2780S/T组),33.1(A549/T组),289.0(MCF-7/ADR组)和阿霉素的320.9(MCF-7/ADR组)要小得多。这些结果表明91b能够克服β-tubulinIII和P-gp过表达引起的耐药。
7、91b导致A2780S/T细胞G2/M期阻滞并诱导细胞凋亡
为了探究91b对肿瘤细胞的抑制是否是因为其对细胞周期的阻滞或者诱导细胞凋亡而产生的，通过流式细胞术考察了不同浓度的91b对紫杉醇敏感的卵巢癌细胞株A2780S和对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞株A2780T14细胞周期和凋亡的影响。考察结果如图6所示。
细胞周期实验：将含有EDTA的胰酶加入A2780S细胞培养皿中，消化细胞，用离心管收集消化好的细胞，置于离心机中，用DMEM完全培养基重悬细胞并进行细胞记数，按106个/孔的密度铺板于6孔板中，每孔2mL体积，置于细胞孵箱中培养过夜。吸出每孔培养基，加入2mL含有不同浓度的91b的DMEM完全培养基，溶剂对照孔加入2mL体积不含药物的DMEM完全培养基。18小时后，取出6孔板，吸出每孔培养基，用灭菌PBS清洗细胞，按体积500μL/每孔加入胰蛋白酶消化。收集固定细胞，流式细胞仪进行检测。
细胞凋亡实验：将含有EDTA的胰酶加入A2780S细胞培养皿中，消化细胞，用离心管收集消化好的细胞，置于离心机中，用DMEM完全培养基重悬细胞并进行细胞记数，按106个/孔的密度铺板于6孔板中，每孔2mL体积，置于细胞孵箱中培养过夜。吸出每孔培养基，加入2mL含有不同浓度的91b的DMEM完全培养基，溶剂对照孔加入2mL体积不含药物的DMEM完全培养基。48h后，取出6孔板，吸出每孔培养基，用灭菌PBS清洗细胞，按体积500μL/每孔加入胰蛋白酶消化。收集固定细胞，每个流式管加入AnnexinV和PI的混合染液，吹打混匀。室温下避光染色10min，流式细胞仪进行检测。
细胞周期实验结果表明，91b对A2780S和A2780T细胞存在很明显的周期阻滞，当91b的浓度为30nM时开始显现出明显的G2/M期阻滞(图6A)，A2780S和A2780T细胞在此浓度下的百分数分别为58.88％,59.91％。当91b的浓度从30nM逐渐升高到300nM的过程中，A2780S和A2780T细胞S期的百分比有所增加，除了A2780T的G2/M期细胞比S期细胞少以外，绝大部分细胞都处于G2/M期(图6B、C)。
细胞凋亡实验结果表明，低浓度下(3,10nM)，91b诱导细胞凋亡效果不明显(图6D)。91b浓度从30nM开始，后期凋亡(annexin-V+/PI+)的细胞数量开始增加。A2780S后期凋亡细胞的百分数在30,100,300nM时分别为17.4％,29.0％,30.9％,而空白对照组的后期凋亡细胞的百分数仅为2.2％。91b处理过的A2780T细胞可以观察到类似的结果。以上实验结果表明91b能够促进A2780S和A2780T细胞凋亡。
8、91b抑制HUVECs的迁移
大多数微管抑制剂都具有破坏微管动力学，导致内皮细胞形态改变，从而抑制血管的生成。由于内皮细胞的迁移是生成新血管的关键步骤，因此我们采用创面愈合迁移试验，通过评估HUVECs的迁移间接考察不同时间(24h,48h)和不同浓度的91b(1.25,2.5,5and10nM)对血管生成的影响。实验方法如下：在超净台中将含有EDTA的胰酶加入HUVEC细胞培养皿中，消化细胞，用离心管收集消化好的细胞，置于离心机中，1000rpm离心3min，用DMEM完全培养基重悬并进行细胞记数，按107个/孔的密度铺板于6孔板中，每孔2mL体积，置于细胞孵箱中培养过夜。当细胞均匀布满6孔板，密度长至约95％时，用移液抢的枪尖(100-200μL规格)在每个孔相同位置处，借助尺板或6孔板的盖子划一道笔直的线，弃去孔内培养基，用PBS清洗被划起的细胞。弃去PBS，每孔加入2mL体积不含FBS的DMEM培养基配制的不同浓度的91b，溶剂对照孔只加2mL体积不含FBS的DMEM培养基，继续置于37℃孵箱培养。24h后置于荧光显微镜下观察划痕部位愈合情况，拍照记录。考察结果如图7所示。
实验结果表明，没经过91b处理过的HUVECs随着时间的推移，逐渐向划痕区迁移靠拢(图7A)。极小浓度的91b(1.25nM)处理过的HUVECs都向划痕区迁移的数量明显变少(图7B)，说明91b能够明显抑制HUVECs的迁移，且91b的浓度越大，抑制活性越强，超过5nM以后，细胞迁移基本被完全抑制。91b在较低浓度下(1.25,2.5nM)，随着时间的延长，细胞向划痕区迁移的数量逐渐增多(图7B、C)。但较高浓度下(5,10nM)，细胞的迁移不再随时间的变化而变化。总之，划痕实验证明了91b能够明显抑制HUVECs的迁移。
9、91b的体内药代动力学性质研究
体内药代动力学研究在取血实验操作12h前对SD大鼠进行颈静脉插管手术。在进行颈静脉插管手术之前，将SD大鼠于标准化温度(25℃)下适应环境1周和12小时光照/黑暗循环环境，在此期间自由进食、饮水。手术中以10％水合氯醛的0.9％氯化钠注射液对SD大鼠进行麻醉，麻醉给药剂量为100g腹腔注射0.3mL的10％水合氯醛的0.9％氯化钠注射液，待大鼠苏醒之后禁食，自由饮水。5只SD大鼠以5mg·kg-1剂量通过单剂量尾静脉注射91b化合物溶液，5只大鼠以5mg·kg-1剂量通过口服给药91b。分别于给药前0min和给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和10h进行取血，采集约0.2mL血液。将收集的血液于3500rpm离心15min，收集上清血浆，装进样瓶，进行UFLC-MS/MS分析。采用DAS2.0软件对测定的血浆样本浓度与采样时间点进行拟合，计算药代动力学参数。
表3 91b的体内药代动力学研究。
Figure BDA0002457983660000311
a小鼠数目；b半衰期；c系统清除率；d静脉注射分布体积；e药时曲线下面积；f最大血药浓度；g口服生物利用度。
药代动力学研究结果表明，91b尾静脉注射和口服时的半衰期(t1/2)分别为3.57±1.10,4.42±1.90h,清除率(clerancerate,CL)分别为1.52±0.39,5.06±1.70h/kg。众所周知，t1/2或CL太短生物利用度不高，太长药物会在体内富集，毒副作用大，因此91b的半衰期是十分理想的。尾静脉和口服的药时曲线下面积及最大血浆浓度值相对也还比较大，说明两种给药方式都能让91b顺利的到达血液中。且基于数据计算出的口服生物利用度(F)达到了30.19％，预示口服给药也是可行的。
10、91b的体内抗肿瘤活性研究
91b的药代动力学研究表明可以口服给药，但对其脂水分配系数(logP)的考察发现，91b的脂溶性极好，即水溶性较差，因此相对口服给药来说，尾静脉给药效果可能会更好。因此我们在A2780S模型上考察不同剂量的91b(30,60mg/kg)的抗肿瘤活性时优先选择了尾静脉注射的给药方式。实验方法如下：SPF级Balbc雄性裸鼠，鼠龄6-8周，体重16–22g，建立卵巢癌A2780S细胞株荷瘤小鼠模型考察其抗肿瘤效果，A2780S肿瘤细胞系经传代培养后，收集生长状态良好的细胞，无血清培养基洗涤1次，计数，无血清培养基调整细胞浓度，将计数的肿瘤细胞接种于裸鼠右侧后肢皮下，当肿瘤体积达到一定体积时，随机分组。尾静脉给予30、60mg/kg的化合物91b，每周3次，对照组紫杉醇以24mg/kg尾静脉注射给药，每周1次，并测量肿瘤体积，制作肿瘤生长曲线，连续给药后处死小鼠，肿瘤称重，统计，抑瘤率＝(未治疗组小鼠肿瘤体积-治疗组小鼠肿瘤体积)/未治疗组小鼠肿瘤体积×100％。考察结果如图8所示。
图8A表明，30mg/kg的91b抑瘤率为62.84％，表现出了一定的肿瘤抑制活性，但比24mg/kg的紫杉醇(抑瘤率68.31％)一周给药一次相比要差一些。60mg/kg的91b(抑瘤率66.23％)与紫杉醇的抗肿瘤效果相当。从图8B可以看出，紫杉醇给药后得小鼠体重减轻了很多，两个剂量的91b在尾静脉注射后也观察到一定的体重减轻现象，说明91b的毒性相对较小。从图8C,D可以直观的看到两个剂量下，91b对肿瘤的体积和重量较空白对照有明显的抑制作用，可能是因为91b不能很好的到达肿瘤组织中，其体内抗肿瘤效果跟临床一线药物紫杉醇相比还存在不小的差距。

Claims (10)

1.式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002457983650000011
X1、X2选自N或CH；
Y选自CH2或NR3；
Z选自NH、CH2或O；
R1、R3选自H或C1～C3烷基；
R2选自C1～C6烷基、C2～C6烯基、5～6元环烷基、取代或未取代的5～14元芳基，所述芳基含有0～1个杂原子，杂原子为N、O或S；
X1为N、X2为CH、Y为NH、Z为CH2以及R1为H时，R2不为苯和二苯醚。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R2选自C1～C3烷基、C2～C4烯基、5～6元环烷基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的芘基、取代或未取代的苯基；
优选的，R2选自甲基、乙基、异丁烯、环戊烷、环己烷、噻吩基、吡咯基、甲基取代的吡咯基、呋喃基、吡啶基、甲氧基取代的吡啶基、萘基、喹啉基、吲哚基、芘基、苯基取代的苯基、-O(CH2)nR4取代的苯基，n＝0或1；
R4选自苯基、取代的苯基、吡啶基、喹啉基、苯并二恶茂基或苯并二恶烷基；
更优选的，R2选自甲基、乙基、异丁烯、环戊烷、环己烷、噻吩基、吡咯基、甲基取代的吡咯基、呋喃基、吡啶基、甲氧基取代的吡啶基、萘基、喹啉基、吲哚基、芘基、苯基取代的苯基、-O(CH2)nR4取代的苯基，n＝0或1；
R4选自苯基、卤素取代的苯基、甲基取代的苯基、甲氧基取代的苯基、乙酰胺基取代的苯基、氰基取代的苯基、三氟甲基取代的苯基、甲硫基取代的苯基、苯基取代的苯基、二苯醚基、异辛烷基取代的苯基、吡啶基、喹啉基、苯并二恶茂基或苯并二恶烷基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，结构式如下：
Figure FDA0002457983650000012
Figure FDA0002457983650000021
Figure FDA0002457983650000031
4.权利要求1～3任一项所述化合物的类似物，其特征在于，结构如下：
Figure FDA0002457983650000032
5.药物组合物，由权利要求1～3任一项所述化合物或其药学上可接受的盐、权利要求4所述的类似物为活性成分，添加药学上可接受的辅助性成分组成。
6.权利要求1～3任一项所述化合物或其药学上可接受的盐、权利要求4所述的类似物、权利要求5所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肺癌或卵巢癌。
8.权利要求1～3任一项所述化合物或其药学上可接受的盐、权利要求4所述的类似物、权利要求5所述的药物组合物在制备微管抑制剂中的用途；优选的，所述微管抑制剂为微管蛋白降解剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述微管蛋白降解剂在降解微管蛋白时是通过泛素-蛋白酶体途径进行。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述微管蛋白降解剂结合位点为秋水仙碱位点。
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