具体实施方式
以下实施例详细说明发明的技术方案,但本发明的保护范围包括但不限于此。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定的。NMR位移的单位为10-6(ppm)。NMR测定的溶剂为氘代二甲基亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇等,内标为四甲基硅烷(TMS)。
本发明的缩写定义如下:
Ms:甲磺酰基;LPS:内毒素;PBMC:外周血单核细胞;TNFα:肿瘤坏死因子α;PBS:磷酸盐缓冲液;FBS:胎牛血清;“IC50”指半数抑制浓度,指达到最大抑制效果一半时的浓度。
实施例1:目标化合物001的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(thiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
目标化合物001的合成路线如下所示:
第一步:1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-醇(001B)的合成
1-(thiazol-2-yl)azetidin-3-ol
将2-溴噻唑(001A)(1g,6.1mmol)加入到10ml DMSO中,依次加入氮杂环丁基-3-醇(700mg,9.5mmol),碘化亚铜(170mg,0.9mmol),L-脯氨酸(220mg,1.9mmol),碳酸钾(2.5g,18.1mmol),将反应液加热至90℃并在氮气保护下搅拌过夜。冷却至室温,加入蒸馏水(200ml)稀释,用乙酸乙酯(30ml×3)萃取,合并有机相,有机相用饱和食盐水(30ml×2)洗涤,分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得淡黄色固体标题化合物1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-醇(41B)(800mg,产率84%)。
LC-MS,M/Z(ESI):157(M+1)。
第二步:1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-甲基磺酸酯(001C)的合成
1-(thiazol-2-yl)azetidin-3-methanesulfonate
将1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-醇(001B)(800mg,5.1mmol),加入到10ml二氯甲烷中,加入三乙胺(1.1g,10.9mmol),冷却至0℃,加入甲基磺酰氯(863mg,7.5mmol),自然升至室温,搅拌2h。加入二氯甲烷(20ml)稀释,用水(30ml×3)洗涤,分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得淡黄色液体标题化合物1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-甲基磺酸酯(001C)(560mg,产率47%)。
第三步:((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)甲酮(001D)的合成
((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(thiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)methanone
将化合物IV,即化合物((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)((3S,4S)(3-4-羟基-4-甲氧基苯基)-(3-(R)-1-羟乙基)-3-甲基吡咯烷-1-基)甲酮(910mg,2.4mmol)溶入DMF(8ml),加入磷酸钾(850mg,4.2mmol),加热至90℃,搅拌0.5h,冷却至41℃,加入1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-甲基磺酸酯(001C)(560mg,2.4mmol),加热至90℃,搅拌过夜。冷却至室温,加入蒸馏水(50ml)稀释,用乙酸乙酯(30ml×3)萃取,合并有机相,有机相用饱和食盐水(30ml×2)洗涤,分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得白色固体标题化合物((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)甲酮(30mg,产率2.4%)。
LC-MS,M/Z(ESI):518(M+1)。
第四步:(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮(001)的合成
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(thiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
将((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)甲酮(001D)(30mg,0.058mmol)溶于四氢呋喃(2ml),加入1N盐酸(1ml),室温搅拌过夜。加入饱和碳酸氢钠水溶液,调节pH=8-9,用乙酸乙酯(5ml×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(纯乙酸乙酯),得白色固体标题化合物(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮(41E)(14mg,50%)
1H NMR(410MHz,DMSO-d6)δ7.16(s,1H),6.96(m,1H),6.93(m,2H),6.47(s,1H),5.16(d,1H),4.85(d,1H),4.73(m,1H),4.45(m,2H),4.24(m,1H),3.88(m,3H),3.76(s,3H),3.71-3.37(m,6H),1.01(d,3H),0.63(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):478(M+1)
实施例2:目标化合物002的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(1,3,4-噻二唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-1-((3S,4S)-4-(3-((1-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)-4-methoxyphenyl)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)-2,3-dihydroxypropan-1-one
以2-溴-1,3,4-噻二唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物002。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.83(s,1H),6.95(m,2H),6.67(d,1H),5.10(d,1H),4.88(m,2H),4.74(m,1H),4.50(m,2H),4.12(m,1H),4.08(m,2H),3.94-3.82(m,1H),3.76(s,3H),3.73-3.37(m,6H),2.01(m,1H),1.02(m,3H),0.63(t,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):479(M+1)。
实施例3:目标化合物003的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-甲基-1,3,4-噻二唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物003。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.92(m,2H),6.66(s,1H),5.17(d,1H),4.91(m,2H),4.73(m,1H),4.45(m,2H),4.24(m,1H),4.02(m,2H),3.88(m,1H),3.76(s,3H),3.65-3.40(m,6H),2.52(s,3H),1.02(d,3H),0.62(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):493(M+1)。
实施例4:目标化合物004的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-甲基-1,3,4-噁二唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物004。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.94(m,2H),6.64(s,1H),5.11(d,1H),4.88(m,2H),4.71(m,1H),4.50(m,2H),4.25(m,1H),4.05(m,2H),3.88(m,1H),3.76(s,3H),3.68-3.43(m,6H),2.47(s,3H),2.00(m,1H),1.01(d,3H),0.62(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):477(M+1)。
实施例5:目标化合物005的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(2-甲基噻唑-5-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(2-methylthiazol-5-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以5-溴-2-甲基噻唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物005。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.02(m,1H),6.98(m,1H),6.91(m,1H),6.67(m,1H),5.16(d,1H),4.71(m,1H),4.50(m,2H),4.28(m,2H),4.11(m,2H),3.84(m,1H),3.76(s,3H),3.57-3.35(m,6H),2.27(d,3H),1.01(d,3H),0.62(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):492(M+1)。
实施例6:目标化合物006的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-甲基噻吩-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-methylthiophen-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-甲基噻吩为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物006。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.95(m,1H),6.88(m,1H),6.68(m,1H),6.41(m,1H),5.76(d,1H),5.07(d,1H),4.89(m,2H),4.76(m,1H),4.24(m,3H),3.90(m,1H),3.75(s,3H),3.71-3.42(m,7H),2.26(d,3H),1.02(d,3H),0.62(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):491(M+1)。
实施例7:目标化合物007的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-甲基噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-methylthiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-甲基噻唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物007。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.02(m,3H),6.67(s,1H),5.18(m,1H),4.51(m,2H),4.25(m,1H),4.10(m,2H),3.91(m,1H),3.65(s,3H),3.58-3.47(m,7H),2.28(s,3H),1.01(d,3H),0.64(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):492(M+1)。
实施例8:目标化合物008的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(4-甲基噻唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(4-methylthiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-4-甲基噻唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物008。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.91(m,2H),6.66(s,1H),6.45(s,1H),5.17(d,1H),4.84(d,1H),4.72(s,1H),4.40(m,2H),4.22(m,1H),3.91(m,3H),3.75(s,3H),3.70-3.41(m,6H),2.16(s,3H),1.01(d,3H),0.63(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):492(M+1)。
实施例9:目标化合物009的制备
S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-ethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-乙基-1,3,4-噻二唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物009。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.93(m,2H),6.66(s,1H),5.18(d,1H),4.91(m,2H),4.74(m,1H),4.47(m,2H),4.24(m,1H),4.03(m,2H),3.88(m,1H),3.76(s,3H),3.65-3.40(m,6H),2.89(q,2H),1.25(t,3H),1.02(d,3H),0.62(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):507(M+1)。
实施例10:目标化合物010的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-异丙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-isopropyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-异丙基-1,3,4-噻二唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物010。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.99(m,2H),6.75(d,1H),5.23(d,1H),4.82(m,2H),4.59(m,1H),4.27(m,2H),4.02(m,1H),3.86(s,3H),3.86-3.49(m,8H),2.05(m,1H),1.39(m,6H),1.17(d,3H),0.77(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):521(M+1)。
实施例11:目标化合物011的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-环丙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氮杂环丁烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-1-((3S,4S)-4-(3-((1-(5-cyclopropyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)azetidin-3-yl)oxy)-4-methoxyphenyl)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)-2,3-dihydroxypropan-1-one
以2-溴-5-环丙基-1,3,4-噻二唑为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物011。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.96(m,2H),6.65(d,1H),5.16(d,1H),4.90(m,2H),4.76(m,1H),4.44(m,2H),4.01(m,2H),3.75(s,3H),3.73-3.36(m,6H),2.29(m,1H),1.09(m,2H),1.05(d,3H),0.86(m,2H),0.61(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):519(M+1)。
实施例12:阳性对照组化合物及其制备
以2-溴-5-甲基吡啶为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到阳性对照组化合物。
LC-MS,M/Z(ESI):486[M+1]。
生物学活性及相关性质测试例
测试例1:PDE4B和PDE4D酶活试验
化合物对PDE4B和PDE4D的抑制活性可以用PDE-Glo Phosphodiesterase AssayKit(promega,V1361)进行检测。简单来说,首先将待检测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的浓储液,随后以试剂盒提供的Reaction buffer稀释成10x的工作液。以Reaction buffer在冰上操作将PDE4B酶(Enzo Life Sciences,BML-SE522-0020)稀释至浓度为1ng/ul,PDE4D酶(Enzo Life Sciences,BML-SE523-0020)稀释至浓度为4ng/ul。在384孔板(Corning,CLS3707)的孔中加入1.5ul PDE4B(PDE4D)工作液和1ul化合物工作液,室温震荡孵育5分钟,随后加入2.5ul/孔cAMP(2μM in Reaction buffer),继续室温震荡孵育20分钟,加入2.5ul/孔1×Termination Buffer,随后加入2.5ul/孔1×Detection Buffer,继续室温震荡20分钟。最后加入10ul/孔1×Kinase-Glo,室温震荡孵育10分钟,以PheraStar仪器检测生物发光。实验结果输入GraphPad Prism软件,经拟合计算得到各化合物的IC50。
表1 测试化合物对PDE4B和PDE4D受体的抑制活性结果
测试化合物 |
PDE4B受体IC<sub>50</sub>(nM) |
PDE4D受体IC<sub>50</sub>(nM) |
阳性对照组 |
2.10 |
0.41 |
001 |
2.94 |
1.04 |
002 |
2.78 |
5.51 |
003 |
1.41 |
0.74 |
004 |
2.56 |
1.14 |
005 |
10.5 |
N/A |
006 |
13.6 |
N/A |
007 |
4.07 |
8.62 |
008 |
14.8 |
N/A |
009 |
2.88 |
128 |
010 |
4.14 |
66.6 |
011 |
2.31 |
371 |
实验结果表明,本发明化合物对PDE4受体均具有良好的抑制活性,获得了结构新颖、药效优良、成药性好的PDE4抑制剂;另外,在抑制PDE4B/PDE4D受体的活性对比试验中发现,与最接近的现有技术相比(阳性对照组化合物),本发明化合物(如化合物001~004,007,009-011)表现出更好的PDE4B选择性抑制作用,能有效改善呕吐等副作用的发生。
测试例2:药代动力学试验
大鼠药代动力学试验,采用雄性SD大鼠3只,180-240g,禁食过夜,口服灌胃给药10mg/kg。在给药前和在给药后15、30分钟以及1、2、4、8、24小时采血。血液样品8000转/分钟4℃离心6分钟,收集血浆,于-20℃保存。取各时间点血浆,加入3-5倍量含内标的乙腈溶液混合,涡旋混合1分钟,13000转/分钟4℃离心10分钟,取上清液加入3倍量水混合,取适量混合液进行LC-MS/MS分析。主要药代动力学参数用WinNonlin 7.0软件非房室模型分析。
小鼠药代动力学试验,使用雄性CD-1小鼠9只,20-25g,禁食过夜,口服灌胃给药10mg/kg,每个采血时间点3只小鼠,共9只小鼠交替采血。犬药代动力学试验,使用雄性比格犬3只,8-10kg,禁食过夜,口服灌胃给药5mg/kg。其余操作同大鼠药代动力学试验。实验结果表明,与阳性对照组相比,本发明化合物表现出更为优良的药代动力学性质。