具体实施方式
以下实施例详细说明发明的技术方案,但本发明的保护范围包括但不限于此。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定的。NMR位移的单位为10-6(ppm)。NMR测定的溶剂为氘代二甲基亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇等,内标为四甲基硅烷(TMS)。
本发明的缩写定义如下:
Ms:甲磺酰基;LPS:内毒素;PBMC:外周血单核细胞;TNFα:肿瘤坏死因子α;PBS:磷酸盐缓冲液;FBS:胎牛血清;“IC50”指半数抑制浓度,指达到最大抑制效果一半时的浓度。
实施例1:目标化合物001的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(pyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
目标化合物001的合成路线如下所示:
第一步:1-(吡啶-2-基)吡咯烷基-3-醇(001B)的合成
1-(pyridin-2-yl)pyrrolidin-3-ol
将2-溴吡啶(001A)(1g,6.3mmol)加入到10ml DMSO中,依次加入3-吡咯烷醇(767mg,7.6mmol),碘化亚铜(240mg,1.3mmol),L-脯氨酸(290mg,2.5mmol),碳酸钾(2.6g,18.9mmol),将反应液加热至90℃并在氮气保护下搅拌16h。冷却至室温,加入蒸馏水(100ml)稀释,用乙酸乙酯(40ml×3)萃取,合并有机相,有机相用饱和食盐水(30ml×2)洗涤,分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得淡黄色固体标题化合物1-(吡啶-2-基)吡咯烷基-3-醇(001B),(920mg,产率89%)。
LC-MS,M/Z(ESI):165(M+1)。
第二步:1-(吡啶-2-基)吡咯烷基-3-甲基磺酸酯(001C)的合成
1-(pyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl methanesulfonate
将1-(吡啶-2-基)吡咯烷基-3-醇(001B)(1g,6.1mmol)加入到10ml二氯甲烷中,加入三乙胺(1.9g,18mmol),冷却至0℃,加入甲基磺酰氯(1g,9.2mmol),自然升至室温搅拌2h。加入二氯甲烷(20ml)稀释,用水(10ml×3)洗涤,分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化((石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得淡黄色固体标题化合物1-(吡啶-2-基)吡咯烷基-3-甲基磺酸酯(001C)(900mg,产率61%)。
LC-MS,M/Z(ESI):243(M+1)。
第三步:((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)甲酮(001D)的合成((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(pyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)methanone
将((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)((3S,4S)(3-4-羟基-4-甲氧基苯基)-(3-(R)-1-羟乙基)-3-甲基吡咯烷-1-基)甲酮(化合物IV)(150mg,0.4mmol)溶入DMF(6ml),加入磷酸钾(340mg,1.6mmol),加热至90℃,搅拌0.5h,冷却至40℃,加入1-(吡啶-2-基)吡咯烷基-3-甲基磺酸酯(001C)(150mg,0.62mmol),加热至90℃,搅拌16h。冷却至室温,加入蒸馏水(40ml)稀释,用乙酸乙酯(30ml×3)萃取,合并有机相,有机相用饱和食盐水(30ml×2)洗涤,分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱纯化((石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得白色固体标题化合物(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮(001D)(150mg,产率72%)。
LC-MS,M/Z(ESI):526(M+1)。
第四步:(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮(目标化合物001)的合成
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(pyri din-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
将(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮(001D)(120mg,0.23mmol)溶于四氢呋喃(3ml),加入1N盐酸(1.5ml),室温搅拌16h。加入饱和碳酸氢钠水溶液,调节pH=8-9,用乙酸乙酯(5ml×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(纯乙酸乙酯),得白色固体化合物(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮(001)(60mg,46%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(t,1H),7.49(t,1H),6.91(m,3H),6.56(t,1H),6.48(d,1H),5.11(d,1H),4.89(m,2H),4.73(m,1H),4.24(d,1H),3.91(m,1H),3.73-3.62(m,5H),3.59-3.36(m,6H),2.18(d,2H),1.02(d,3H),0.64(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):486(M+1)。
实施例2:目标化合物002的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-甲基吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-methylpyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-甲基吡啶(002A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物002。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(s,1H),7.49(d,1H),6.92(m,3H),6.44(t,1H),5.09(s,1H),4.89(m,2H),4.71(m,1H),4.23(d,1H),3.93(m,1H),3.73(s,3H),3.72-3.62(m,2H),3.56-3.43(m,6H),3.55(m,1H),3.45(m,1H),2.19(m,2H),2.13(s,3H),1.01(d,3H),0.64(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):500(M+1).
实施例3:目标化合物003的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(6-甲基吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(6-methylpyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-6-甲基吡啶(003A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物003。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(t,1H),6.98(d,3H),6.49(d,1H),6.32(d,1H),5.15(s,1H),4.89(m,2H),4.78(m,1H),4.29(d,1H),3.98(m,1H),3.72(s,3H),3.69-3.51(m,2H),3.47-3.30(m,6H),2.29(s,3H),2.17(m,2H),1.05(d,3H),0.70(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):500(M+1)。
实施例4:目标化合物004的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-2-基)哌啶-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(pyridin-2-yl)piperidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴吡啶(004A)及3-哌啶醇为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物004。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07(t,1H),7.50(t,1H),6.90(m,3H),6.58(m,2H),4.86(m,2H),4.83(m,1H),4.23(d,1H),4.12(m,2H),3.74(m,2H),3.55(s,3H),3.53-3.45(m,6H),3.29-3.27(m,2H),2.52(m,1H),2.05-1.97(m,3H),1.97(m,1H),1.00(d,3H),0.63(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):500(M+1).
实施例5:目标化合物005的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-甲基吡啶-2-基)哌啶-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-methylpyridin-2-yl)piperidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-甲基-吡啶(005A)及3-哌啶醇为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物005。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H),7.36(d,1H),7.01(m,1H),6.82(m,2H),6.74(m,1H),4.83(m,2H),4.76(m,1H),4.36(m,1H),4.22(m,2H),3.87(m,2H),3.74(s,3H),3.62-3.41(m,5H),3.19-2.96(m,2H),2.11(s,3H),2.05-1.95(m,3H),0.96(d,3H),0.66(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):514(M+1).
实施例6:目标化合物006的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(4-甲基吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(4-methylpyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-4-甲基吡啶(006A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物006。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(m,1H),6.78(m,3H),6.34(d,1H),6.16(d,1H),5.09(s,1H),4.93(m,2H),4.75(m,1H),4.24(m,1H),3.91(m,1H),3.73(s,3H),3.70-3.43(m,8H),2.33(m,2H),2.19(s,3H),1.10(d,3H),0.65(d,3H)。
LC-MS,M/Z(ESI):500(M+1).
实施例7:目标化合物007的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-(((R)-1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-(((R)-1-(pyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴吡啶(007A)及(S)-3-吡咯烷醇为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物007。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(dd,1H),7.50(t,1H),6.90(m,3H),6.56(m,1H),6.47(d,1H),5.11(d,1H),4.88(m,2H),4.73(m,1H),4.23(td,1H),3.93(d,1H),3.71(m,4H),3.63(dd,3H),3.55(m,3H),3.47(m,1H),2.18(m,2H),1.01(d,3H),0.64(s,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):486(M+1).
实施例8:目标化合物008的制备
(S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-(((S)-1-(吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-(((S)-1-(pyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴吡啶(007A)及(R)-3-吡咯烷醇为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物008。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(dd,1H),7.49(t,1H),6.92(m,3H),6.55(m,1H),6.47(d,1H),5.11(d,1H),4.91(m,2H),4.76(m,1H),4.25(td,1H),3.92(d,1H),3.67(m,4H),3.58(dd,3H),3.52(m,3H),3.37(m,1H),2.18(m,2H),1.01(d,3H),0.65(s,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):486(M+1).
实施例9:目标化合物009的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(3-甲基吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(3-methylpyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-3-甲基吡啶(009A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物009。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(t,1H),7.36(d,1H),6.86(m,3H),6.64(d,1H),5.07(s,1H),4.84(m,2H),4.75(m,1H),4.25(m,1H),3.88(m,2H),3.73(m,2H),3.61(s,3H),3.60-3.43(m,8H),2.24(s,3H),1.01(d,3H),0.63(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):500(M+1)
实施例10:目标化合物010的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-氯吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-chloropyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-氯吡啶(010A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物010。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07(m,1H),7.57(m,1H),6.90(m,3H),6.51(d,1H),5.10(s,1H),4.86(m,2H),4.73(m,1H),4.23(d,1H),3.91(m,1H),3.69(s,3H),3.68-3.54(m,2H),3.53-3.42(m,6H),2.20(s,2H),1.00(d,3H),0.64(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):520(M+1).
实施例11:目标化合物011的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(5-氟吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(5-fluoropyridin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以2-溴-5-氟吡啶(011A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物011。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,1H),7.49(m,1H),6.89(m,3H),6.49(d,1H),5.10(s,1H),4.89(m,2H),4.23(m,1H),3.92(m,1H),3.66(s,3H),3.65-3.52(m,2H),3.513-3.39(m,8H),2.20(m,2H),1.01(t,3H),0.64(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):504(M+1).
实施例12:目标化合物012的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(pyridin-3-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以3-溴吡啶(012A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物012。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.86(d,1H),7.18(m,1H),6.93(m,4H),6.48(d,1H),5.12(d,1H),4.88(m,2H),4.71(m,1H),4.06(m,3H),3.71(s,3H),3.65-3.32(m,7H),2.17(d,2H),1.03(d,3H),0.65(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):486(M+1).
实施例13:目标化合物013的制备
(2S)-2,3-二羟基-1-((3S,4S)-3-((R)-1-羟乙基)-4-(4-甲氧基-3-((1-(吡啶-4-基)吡咯烷-3-基)氧)苯基)-3-甲基吡咯烷-1-基)丙烷-1-酮
(2S)-2,3-dihydroxy-1-((3S,4S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-4-(4-methoxy-3-((1-(pyridin-4-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)phenyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)propan-1-one
以4-溴吡啶(013A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物013。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26(s,2H),6.94(m,5H),5.21(s,1H),4.02(d,2H),3.97-3.81(m,4H),3.76(s,3H),3.71-3.64(m,7H),3.49(d,1H),2.25(d,2H),1.02(d,3H),0.64(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):486(M+1).
实施例14:目标化合物014的制备
(2S)-1-((3S,4S)-4-(3-((1-(6-氯吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)氧)-4-甲氧苯基)-3-((R)-1-羟乙基)-3-甲基吡咯烷-1-基)-2,3-二羟基丙烷-1-酮
(2S)-1-((3S,4S)-4-(3-((1-(6-chloropyridin-3-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)-4-methoxyphenyl)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)-2,3-dihydroxypropan-1-one
以3-溴-6-氯-吡啶(014A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物014。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(t,1H),7.26(dd,1H),7.02(d,1H),6.92(m,3H),5.11(s,1H),6.48(d,1H),5.11(d,1H),4.88(m,2H),4.73(m,1H),4.23(d,1H),3.92(m,1H),3.70(s,3H),3.69-3.36(m,7H),2.23(d,2H),1.00(d,3H),0.65(d,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):520(M+1).
实施例15:目标化合物015的制备(2S)-1-((3S,4S)-4-(3-((1-(5-氯吡嗪-2-基)吡咯烷-3-基)氧)-4-甲氧苯基)-3-((R)-1-羟乙基)-3-甲基吡咯烷-1-基)-2,3-二羟基丙烷-1-酮
(2S)-1-((3S,4S)-4-(3-((1-(5-chloropyrazin-2-yl)pyrrolidin-3-yl)oxy)-4-methoxyphenyl)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-3-methylpyrrolidin-1-yl)-2,3-dihydroxypropan-1-one
以2,5-二氯吡嗪(015A)为起始原料,参照化合物001的制备方法制备得到目标化合物015。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),7.82(d,1H),6.95-6.88(m,3H),5.12(d,1H),4.90-4.74(m,3H),4.28-4.22(m,1H),3.93-3.91(m,1H),3.69(s,3H),3.69-3.44(m,10H),3.17-3.16(m,1H),2.24-2.20(m,2H),1.00(dd,3H),0.64-0.63(m,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):521.2(M+1).
实施例16:阳性对照组化合物及其制备
阳性对照组化合物
参考专利WO2014159012A1制备方法制备得到阳性对照组化合物。
LC-MS,M/Z(ESI):486[M+1]。
生物学活性及相关性质测试例
测试例1:PDE4B和PDE4D酶活试验
化合物对PDE4B和PDE4D的抑制活性可以用PDE-Glo Phosphodiesterase AssayKit(promega,V1361)进行检测。简单来说,首先将待检测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的浓储液,随后以试剂盒提供的Reaction buffer稀释成10x的工作液。以Reaction buffer在冰上操作将PDE4B酶(Enzo Life Sciences,BML-SE522-0020)稀释至浓度为1ng/ul,PDE4D酶(Enzo Life Sciences,BML-SE523-0020)稀释至浓度为4ng/ul。在384孔板(Corning,CLS3707)的孔中加入1.5ul PDE4B(PDE4D)工作液和1ul化合物工作液,室温震荡孵育5分钟,随后加入2.5ul/孔cAMP(2μM in Reaction buffer),继续室温震荡孵育20分钟,加入2.5ul/孔1×Termination Buffer,随后加入2.5ul/孔1×Detection Buffer,继续室温震荡20分钟。最后加入10ul/孔1×Kinase-Glo,室温震荡孵育10分钟,以PheraStar仪器检测生物发光。实验结果输入GraphPad Prism软件,经拟合计算得到各化合物的IC50。
表1测试化合物对PDE4B和PDE4D的抑制活性结果
实验结果表明,本发明化合物(如化合物001~006、008~015)对PDE4均具有良好的抑制活性;另外,在抑制PDE4B/PDE4D的活性对比试验中发现,与最接近的现有技术相比(阳性对照组化合物),本发明化合物(如化合物001、002、004、005,008、014和015)表现出更好的PDE4B选择性抑制作用,能有效改善呕吐等副作用的发生。
测试例2:LPS诱导人PBMC分泌TNFα的抑制活性试验
PBMC提取过程:将新鲜人外周浓缩血,吸取1单位人外周浓缩血(浓缩自200cc外周血),定量加入0.9%生理盐水至总体积为120ml,混匀。取50ml离心管,分别加入15mlLymphoprepTM,手持离心管,约斜45度角,吸取30ml稀释后的浓缩血,小心而缓慢地贴壁加入,使稀释血液重叠于分层液上,避免将稀释血液混入分离液或冲破分离液液面。LymphoprepTM与稀释血液的比例为1:2。将离心管配平放置入水平离心机(eppendorf,5810R),20℃,800g离心20min,升速设为1,降速设为0。小心取出离心管。直接将巴氏吸管深入白膜层,吸取PBMC。加3倍体积0.9%生理盐水或PBS(不含钙镁),轻轻吹打混匀。混匀后20℃,250g离心10min,去除细胞悬液中留存的血小板,去上清液,将细胞沉淀以20ml PBS悬起,台盼蓝染色计数。
PBMC筛选过程:将步骤1取得的PBMC离心,去除PBS,然后用完全培养基(RPMI1640+10%FBS+1%P/S)重悬计数。按照5×104/孔,100μl/孔接入细胞。将待筛选的化合物配制成终浓度的4×。按照50μl/孔加入到细胞中。提前预孵育30min。同时设定对照孔,不加化合物。LPS的刺激终浓度为10ng/ml,配制成4×,按照50μl/孔加入到细胞中。同时设定对照孔,不加LPS孔。细胞继续孵育,在24h收集上清10%进行检测。收集的上清按照Invitrogen公司的Human TNF-α试剂盒检测(REF:88-7346-88)。
表2测试化合物对LPS诱导人PBMC分泌TNFα的抑制活性结果
测试化合物 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
阳性对照组 |
3.32 |
010 |
1.12 |
014 |
0.61 |
015 |
1.50 |
实验结果表明,与阳性对照组相比,本发明化合物010、014和015能更好地抑制人PBMC分泌TNFα炎症因子,表现出更为突出的抗炎效果。
测试例3:LPS刺激的小鼠体内释放TNF-α的测定
取18只Balb/c小鼠,周龄:6-8周,随机分配为空白组、模型组和给药组,每组6只小鼠,口服灌胃给予溶媒(空白组、模型组)或50mg/kg的化合物(给药组,其中阳性对照组给药剂量为100mg/kg)。灌胃给药30分钟后,腹腔注射PBS(空白组)或1mg/kg的LPS(模型组和给药组)。腹腔注射后90分钟后,取小鼠心脏采血,2-8℃静置4h后5000rpm离心10分钟收集血清,血清-80℃保存待测。
用小鼠TNF-α检测试剂盒(Mouse TNFa ELISA试剂盒:Biolegend,Cat:430904)检测血清中TNF-α水平。根据血清TNF-α水平计算化合物对TNF-α的释放抑制活性。
化合物抑制活性%={1-(给药组TNFα浓度-空白组TNFα浓度)/(模型组TNFα浓度-空白组TNFα浓度)}×100
表3 LPS刺激的小鼠体内释放TNF-α的测定
实验结果表明,与阳性对照组相比,本发明化合物能够更好的抑制小鼠体内LPS刺激的TNF-α的释放,抑制活性显著优于阳性对照组,具有更为突出的抗炎效果。
测试例4:药代动力学试验
小鼠药代动力学试验,使用雄性CD-1小鼠9只,20-25g,禁食过夜,口服灌胃给药10mg/kg,每个采血时间点3只小鼠,共9只小鼠交替采血。试验在给药前和在给药后15、30分钟以及1、2、4、8、24小时采血。血液样品8000转/分钟4℃离心6分钟,收集血浆,于-20℃保存。取各时间点血浆,加入3-5倍量含内标的乙腈溶液混合,涡旋混合1分钟,13000转/分钟4℃离心10分钟,取上清液加入3倍量水混合,取适量混合液进行LC-MS/MS分析。主要药代动力学参数用WinNonlin 7.0软件非房室模型分析。
表4小鼠药代动力学试验结果
实验结果表明,与阳性对照组相比,本发明化合物表现出更为优良的药代动力学性质。