CN111330078A - 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用 - Google Patents

一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111330078A
CN111330078A CN202010190826.4A CN202010190826A CN111330078A CN 111330078 A CN111330078 A CN 111330078A CN 202010190826 A CN202010190826 A CN 202010190826A CN 111330078 A CN111330078 A CN 111330078A
Authority
CN
China
Prior art keywords
membrane
eggshell membrane
protein
preparing
mineralization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010190826.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111330078B (zh
Inventor
黄茜
赵前程
马美湖
金永国
付星
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202010190826.4A priority Critical patent/CN111330078B/zh
Publication of CN111330078A publication Critical patent/CN111330078A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111330078B publication Critical patent/CN111330078B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/365—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于医用仿生材料技术领域，特别涉及一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用，该制备方法包括如下步骤：S1，材料准备，包括制备蛋壳膜、制备酶解液和制备蛋白矿化液三部分，所述酶解液通过将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9制备得到，所述蛋白矿化液中通过将水溶性蛋白溶解于矿化液中制备得到；S2、制备仿生矿化膜，将所述内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中处理得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，可用作骨组织修复材料，制备过程具有矿化效率高、制备周期时间短、矿化效果好的特点。

Description

一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方 法及应用
技术领域
本发明属于医用仿生材料技术领域，特别涉及一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用。
背景技术
骨缺损一般由遗传疾病、交通事故、病理性骨折、感染等原因引起，骨缺损的修复问题是临床医学实践中的常见问题，每年数以万计的骨损伤患者需要治疗。
通常，骨缺损的治疗，包括使用自体或同种异体的骨移植物来完成。但是，自体骨移植会在供体部位引起疼痛和并发症，并且其大小和形状不易控制；异体骨移植物的来源有限，愈合能力无法预测，并且成骨能力低，无法满足实际需求。寻找具有良好生物相容性、可促进骨修复的材料近来受到了广泛的关注。
与骨膜的结构类似，蛋壳膜由外层膜、内层膜和限制膜三层膜组成，成分中含有大于80％的蛋白质、约3％的脂质体和约2％的糖，蛋壳膜独特的成分构造，保证了其具有良好的生物相容性。蛋壳膜中的胶原蛋白，主要包括I型、V型和X型，其中，外层蛋壳膜中主要分布I型胶原蛋白，而内层蛋壳膜中主要分布为I型和V型胶原蛋白。
仿生矿化是在底物表面上沉积羟基磷灰石涂层的一种自矿化行为，如今，已经成功地在不同材料表面上进行羟基磷灰石涂层矿化。其中，以胶原蛋白作为骨组织中的有机质经被常用于作为仿生矿化的模板，天然胶原纤维的结构在提取和重建过程中，难以维持其原本结构，且机械性能较差；
一些合成聚合物，如L-乳酸、聚乳酸-乙醇酸和碳纳米管电纺纤维等，也可以被用于仿生矿化模板，虽然弥补了天然胶原纤维机械性能差的缺陷，合成过程复杂，且，具有疏水性表面、缺乏生物活性基团等特性，不仅削弱了其矿化能力，还表现出较差的生物相容性；
蛋壳膜纤维由富含胶原蛋白的核，与富含糖蛋白的外壳组成。虽然，已有报道，可以用天然蛋壳膜作为模板，用来构建蛋壳膜/羟基磷灰石复合材料，但存制备周期长、矿化效果慢等缺点，制备工艺还需要进一步提高。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，以及其制备方法，该制备方法具有矿化效率高、制备周期时间短、矿化效果好的特点，以及在骨组织修复中的应用。
本发明采用以下技术方案来实现：
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备，包括制备制备蛋壳膜，制备酶解液和制备蛋白矿化液三部分；
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从气室部位分离得到内层蛋壳膜后，剩余部分浸泡于弱酸溶液中处理，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜和外层蛋壳膜分别用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；通过弱酸分离获得的内层蛋壳膜，具有均一、致密的纤维网络结构，且纤维中的胶原核心占比较大；优选的，所述弱酸溶液为乙酸的水溶液、柠檬酸的水溶液或苹果酸的水溶液，所述弱酸溶液的浓度为2～22％(v/v)，浸泡于弱酸溶液中处理时间为10～50min；本发明中，所述鲜蛋是指鸡、鸭、鹌鹑、鹅或鸵鸟等鸟类、禽类产生的蛋类，产蛋时间不超过60天；
制备酶解液，将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9，得到酶解液；优选的，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、角蛋白酶或胃蛋白酶；优选的，所述还原剂为亚硫酸钠、硫化钠或L-半胱氨酸；
制备蛋白矿化液，将水溶性蛋白溶解于矿化液中，得到蛋白矿化液；优选的，所述水溶性蛋白优选为卵黄高磷蛋白，浓度为0.1-0.5g/L，即每0.1-0.5g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的矿化液中，得到蛋白矿化液；所述矿化液优选为1倍模拟体液、1.5倍模拟体液或10倍模拟体液；所述1倍模拟体液购自上海源叶生物科技有限公司，货号为R24030；所述1.5倍模拟体液购自上海源叶生物科技有限公司，货号为R24029；所述10倍模拟体液配置方法为：将58.43g/L NaCl、0.373g/L KCl、3.675g/L CaCl2·2H2O、1.016g/L MgCl2·6H2O和1.420g/LNa2HPO4，按顺序溶解于800mL去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至4.3～4.35，然后加去离子水定容至1L，使用时加入0.84g/L Na2HCO3获得10倍模拟体液；
S2、制备仿生矿化膜：
将所述内层蛋壳膜膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，在30～70℃条件下处理5～50min后，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中混合，在35～39℃且优选为37℃恒温条件下，搅拌反应得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜；优选的，每1g改性蛋壳膜，与100～400mL蛋白矿化液混合；优选的，所述搅拌反应在恒温震荡箱中进行，搅拌速度为20～200rpm，反应时间为10～18h。
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，采用上述任意方法制备而成。
一种上述基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜在骨组织修复中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过对鲜蛋的处理，分离得到内层蛋壳膜和外层蛋壳膜，外层蛋壳膜纤维网络结构不规律，且纤维间隙较大；内层蛋壳膜具有均一、致密的纤维网络结构，且纤维中的胶原核心占比较大，有利于成骨细胞的黏附和增殖，内层蛋壳膜和外层蛋壳膜通过酶解液和蛋白矿化液处理后，在促进成骨细胞(MC3T3-E1)增殖和分化方面具有较好潜力，可应用于骨组织的修复。
2、本发明采用酶解液对内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜进行处理得到改性蛋壳膜，改性蛋壳膜可快速、高效地进行矿化，酶解液能够在短时间内最大程度地暴露壳膜纤维内部的活性物质，对蛋壳膜纤维表面矿化的同时，实现了壳膜纤维外壳结构中矿物生成的效果，有效提高了内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜的矿化潜质，即能够提高矿化效率、减少了矿化时间。
3、本发明利用卵黄高磷蛋白对改性蛋壳膜进行诱导矿化，其高度磷酸化基团，能够促进壳膜纤维表面和内部晶型的转变，促进矿物生成，引导小尺寸晶体均匀生成，且实现纤维内部的全矿化，极大地程度地缩短了有效矿化物的生成时间，并且，卵黄高磷蛋白具有生物兼容性、无毒性等优点，可以替代合成的化工材料，避免了毒性危害，具有良好的生物安全性。
4、采用本发明方法制备的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，实现了壳膜纤维的内部矿化；基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜中的蛋白质/羟基磷灰石复合物很好的模拟了人体内的骨环境，具有良好的生物兼容性，能够促进成骨细胞(MC3T3-E1)的增殖、ALP活性以及胶原蛋白分泌，有利于骨再生，可用做骨组织的修复材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例3、实施例4、实施例6、对比例2和对比例3中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜的微观形貌图。
图2是实施例3、实施例4、对比例1、对比例2和对比例3中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜的表面晶型分析图。
图3是实施例4、对比例1和对比例2中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜的纤维内矿化分析图。
图4是实施例3、实施例4、对比例1、对比例2和对比例3中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜表面的成骨细胞增殖活性分析图。
图5是实施例3、实施例4、对比例1、对比例2和对比例3中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜表面的成骨细胞ALP活性分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于17％(v/v)柠檬酸溶液中处理50min，得到外层蛋壳膜，将获得的外层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g胃蛋白酶和5g L-半胱氨酸，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至8；
制备蛋白矿化液，每0.3g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的1倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜
按比例，每1g外层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性外层蛋壳膜；按比例，每1g改性外层蛋壳膜浸泡于100mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、50rpm的条件下，搅拌反应12h得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
实施例2
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于17％(v/v)苹果酸溶液中处理50min，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g角蛋白酶和5g硫化钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至6；
制备蛋白矿化液，每0.3g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的1.5倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g内层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性内层蛋壳膜；按比例，每1g改性内层蛋壳膜浸泡于500mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、100rpm的条件下，搅拌反应12h得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
实施例3
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于15％(v/v)乙酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g碱性蛋白酶和5g亚硫酸钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至8；
制备蛋白矿化液，每0.1g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的10倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g内层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性内层蛋壳膜；按比例，每1g改性内层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、150rpm的条件下，搅拌反应12h得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
实施例4
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于15％(v/v)苹果酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g碱性蛋白酶和5g亚硫酸钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至8；
制备蛋白矿化液，每0.2g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的10倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g内层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性内层蛋壳膜；按比例，每1g改性内层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、150rpm的条件下，搅拌反应12h得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
实施例5
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于10％(v/v)乙酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g碱性蛋白酶和5g亚硫酸钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至6；
制备蛋白矿化液，每0.3g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的10倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g内层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性内层蛋壳膜；按比例，每1g改性内层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、100rpm的条件下，搅拌反应6h得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
实施例6
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于15％(v/v)柠檬酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜和外层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g碱性蛋白酶和5g亚硫酸钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至8；
制备蛋白矿化液，每0.5g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的10倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g外层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性外层蛋壳膜；按比例，每1g改性外层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、50rpm的条件下，搅拌反应12h得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
对比例1
一种仿生矿化膜的制备方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于15％(v/v)乙酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的外层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备蛋白矿化液，每0.5g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的10倍模拟体液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g外层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、150rpm的条件下，搅拌反应12h得到仿生矿化膜。
对比例2
一种仿生矿化膜的制备方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于15％(v/v)乙酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g碱性蛋白酶和5g亚硫酸钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至8；
制备蛋白矿化液，10倍模拟体液即为蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g内层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性内层蛋壳膜；按比例，每1g改性内层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、150rpm的条件下，搅拌反应16h得到仿生矿化膜。
对比例3
一种仿生矿化膜的制备方法，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从钝端的气室部位，机械分离获得内层蛋壳膜，剩余部分浸泡于15％(v/v)乙酸溶液中处理45min，得到外层蛋壳膜，将获得的外层蛋壳膜用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，按比例，每3g碱性蛋白酶和5g亚硫酸钠，溶解于1L去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至8；
制备蛋白矿化液，1倍模拟体液即为蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
按比例，每1g外层蛋壳膜，浸泡于50mL酶解液中，在55℃条件下反应20min，获得改性外层蛋壳膜；按比例，每1g改性外层蛋壳膜浸泡于300mL蛋白矿化液中，置于恒温震荡箱中，在37℃、150rpm的条件下，搅拌反应12h得到仿生矿化膜。
测试
将通过实施例1～6，对比例1～3的方法制得的仿生矿化膜进行测试，验证制得的仿生矿化膜中，表面晶体生成形貌、对MC3T3-E1细胞的增殖、ALP活性和胶原蛋白分泌能力。
测试实验1：仿生矿化膜表面晶型XRD分析，按如下步骤进行：
使用Bruker-D8-Advance衍射仪对矿化膜样品表面进行检测。设置使用LynxEye阵列探测器、Ni滤波片、Bragg-Brentano衍射几何、CuK-α射线，工作电压、电流分别为40KV、40mA，扫描范围为5～60°，扫描速度为6°/min。
测试实验2：测定仿生矿化膜表面细胞增殖活性，按如下步骤进行：
使用CCK-8法测定膜样品表面上的细胞增殖。膜样品置于75％的酒精溶液中浸泡过夜后取出防止紫外灯下灭菌30min待用。处理好的膜样品置于24孔板中，每孔加入1ml新鲜完全培养基，待培养基充分浸润膜样品后每孔中加入1ml细胞培养液，使得每孔中细胞数约为5000个/mL。将孔板置于培养箱中培养至3d，每隔24h更换一次培养基。根据CCK-8试剂盒说明书，去除24孔板中培养基，并使用PBS洗涤样品两次。然后加入1mL含有10％(v/v)CCK-8溶液的新鲜培养基，并将样品在培养箱中培养4小时。接下来，取100μL新鲜完全培养基添加至96孔培养板的三个平行孔中。使用多功能酶标仪在λmax＝450nm下测量96孔培养板的光密度(OD)值。
测试实验3：测定仿生矿化膜表面细胞ALP活性，按如下步骤进行：
S1、细胞培养及收集：培养好的细胞悬液接种至含膜材料以及1mL新鲜完全培养基的24孔板中，至每孔细胞数为5000个/mL，培养24h后待细胞贴壁换成分化培养基(含有50ug/mL L-抗坏血酸以及10mMβ-甘油磷酸钠的完全培养基)继续培养至14d，每隔1d更换一次分化培养基。取培养7、14d时的细胞去除培养基，使用PBS清洗1遍，使用含有0.1％Tritonx-100的10mM Tris-HCl(PH＝8)充分覆盖孔板底部，裂解30～40min，细胞裂解液转移至1.5ml离心管中，冰水浴超声3min，在12000rpm 4℃下离心20min后取上清备用。
S2、膜材料的前处理方法同测试2中，按照ALP含量测定试剂盒的说明书，将30uL裂解液上清加入缓冲液、基质液中，在37℃条件下水浴15min后加入显色剂，充分混匀后，在波长520nm处测定各孔吸光度的OD值。
测试实验4：仿生矿化膜表面细胞胶原蛋白分泌能力测定，按如下步骤进行：
S1、MC3T3-E1细胞的培养方法以及膜材料的前处理同测试2，将对数生长期的细胞接种至24孔板中，使得每孔中细胞个数为2×104个/孔。待培养24h后细胞贴壁，更换成分化培养基继续培养3d，期间不更换培养液。分别取分化培养第1d、2d、3d时测定细胞内以及细胞培养液中胶原蛋白含量，细胞中胶原蛋白含量使用羟脯氨酸含量(胶原蛋白特征氨基酸)来表示。
S2、按照羟脯氨酸(HYP)测定试剂盒说明书，在550nm处测定吸光值，吸光值大表示胶原蛋白含量多。
测试实验5：仿生矿化膜微观形貌分析(SEM)，按如下步骤进行：
将充分干燥的仿生矿化膜，裁剪成合适大小的小块后，粘贴在样品台表面的银导电胶上，在60s喷金后，使用扫描电子显微镜对样品表面及横截面结构晶型观察，观察距离为17nm。
测试结果：
如图1所示，对实施例3、4、6和对比例2、对比例3中制备的仿生矿化膜表面微观形貌分析，实施例3、实施例4、实施例6中小尺寸晶体包裹纤维生长，且实施例4中纤维表面晶体含量高于其他两者，而对比例2、对比例3中晶体结构较大，且对比例3中仍有大部分壳膜纤维表面无晶体覆盖，对比例2中晶体占据了大部分壳膜纤维表面，且包裹纤维生长。因此可以证明卵黄高磷蛋白的加入可以促进小尺寸晶体的均匀生长，且对内层蛋壳膜的矿化效果比对外层蛋壳膜的矿化效果好。
如图2所示，使用X射线衍射对实施例3、4和对比例1、2、3中的仿生矿化膜表面的晶型进行分析，其中实施例3在这项指标中显示处最多的羟基磷灰石衍射峰，且峰值强度较高，实施例4表现其次。对比例2中的仿生矿化膜表面也呈现出较多羟基磷灰石衍射峰，而对比例1中只存在无定形磷酸钙对应峰值。说明组合酶解的方法可以很好的促进内层蛋壳膜表面羟基磷灰石的形成，卵黄高磷蛋白可以促进内层和外层蛋壳膜表面晶体的快速形成和晶型的转变。
如图3所示，壳膜纤维呈核/壳包裹结构，将对比例1、2和实施例4中制备的仿生矿化膜切片处理后用于TEM观察，部分测试结果显示对比例1中矿物的只存在于纤维表面，且含量很少，对比例2中矿物浸入壳膜纤维外壳结构中，而实施例4中矿物浸入壳膜纤维内部。因此可以证明组合酶解有利于矿物在纤维壳结构中生成，而卵黄高磷蛋白可以促进纤维内部矿化，实现壳膜纤维中有机/无机混合物的形成，这种矿物纤维存在的方式类似人骨。
将制备的仿生矿化膜用于细胞培养，分别对其表面细胞增殖活性、细胞ALP活性、胶原蛋白分泌能力进行测定，部分测试结果如图4、图5和表1中所示。结果显示实施例4中制备的仿生矿化膜在三种测定中均表现出最强活性，实施例3在细胞ALP活性测定中表现出与实施例4相似的结果。对比例1、对比例2和对比例3在促进细胞增殖和ALP活性方面相对实施例3和实施例4而言较差。表1中统计了所有实施例和对比例的促进细胞分泌胶原蛋白的能力，与前两项指标相似实施例4、6表现出更强的活性。由此可知，制备的仿生矿化膜在促进成骨细胞(MC3T3-E1)增殖和分化方面具有较好潜力，可应用于骨组织的修复。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。
表1仿生矿化膜表面成骨细胞胶原蛋白分泌分析结果
羟脯氨酸含量(OD值)
实施例1 2.15±0.06
实施例2 3.13±0.02
实施例3 5.14±0.07
实施例4 5.47±0.07
实施例5 4.05±0.13
实施例6 5.03±0.07
对比例1 1.89±0.06
对比例2 3.06±0.09
对比例3 2.37±0.03

Claims (10)

1.一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从气室部位分离得到内层蛋壳膜后，剩余部分浸泡于弱酸溶液中处理，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜和外层蛋壳膜分别用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9，得到酶解液；
制备蛋白矿化液，将水溶性蛋白溶解于矿化液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
将所述内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，在30～70℃条件下处理5～50min后，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中混合，在35～39℃恒温条件下，搅拌反应得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。
2.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述弱酸溶液为乙酸的水溶液、柠檬酸的水溶液或苹果酸的水溶液，所述弱酸溶液的浓度为2～22％(v/v)，浸泡于弱酸溶液中处理时间为10～50min。
3.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、角蛋白酶或胃蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述还原剂为亚硫酸钠、硫化钠或L-半胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述水溶性蛋白为卵黄高磷蛋白，浓度为0.1～0.5g/L。
6.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述矿化液为1倍模拟体液、1.5倍模拟体液或10倍模拟体液。
7.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S2中，每1g改性蛋壳膜，与100～400mL蛋白矿化液混合。
8.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S2中，所述搅拌反应在恒温震荡箱中进行，搅拌速度为20～200rpm，反应时间为10～18h。
9.一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，其特征在于，采用如权利要求1～8中任意一种方法制备而成。
10.一种如权利要求9所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜在骨组织修复中的应用。
CN202010190826.4A 2020-03-18 2020-03-18 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用 Active CN111330078B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010190826.4A CN111330078B (zh) 2020-03-18 2020-03-18 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010190826.4A CN111330078B (zh) 2020-03-18 2020-03-18 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111330078A true CN111330078A (zh) 2020-06-26
CN111330078B CN111330078B (zh) 2020-12-22

Family

ID=71176553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010190826.4A Active CN111330078B (zh) 2020-03-18 2020-03-18 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111330078B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795906A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 四川德博尔制药有限公司 用于水解蛋壳膜的复合酶、蛋壳膜的水解方法、蛋壳膜水解产物及其提取方法
CN112263710A (zh) * 2020-09-23 2021-01-26 同济大学 一种兼具抗炎和骨-软骨修复功能的生物陶瓷支架及其制备方法与应用
CN115970067A (zh) * 2023-01-17 2023-04-18 中山大学附属口腔医院 一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用
CN116084089A (zh) * 2022-12-07 2023-05-09 江南大学 以废弃蛋壳内膜为原料的纳米纤维膜制备方法
TWI840978B (zh) 2021-09-30 2024-05-01 中央研究院 生產蛋殼膜水解物的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012029529A1 (ja) * 2010-08-31 2012-03-08 天野エンザイム株式会社 酵素を用いた卵殻膜の可溶化方法
CN108114318A (zh) * 2018-01-16 2018-06-05 暨南大学 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用
CN108795906A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 四川德博尔制药有限公司 用于水解蛋壳膜的复合酶、蛋壳膜的水解方法、蛋壳膜水解产物及其提取方法
JP2019198260A (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 株式会社モトイ 卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法及び卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012029529A1 (ja) * 2010-08-31 2012-03-08 天野エンザイム株式会社 酵素を用いた卵殻膜の可溶化方法
CN108114318A (zh) * 2018-01-16 2018-06-05 暨南大学 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用
JP2019198260A (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 株式会社モトイ 卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法及び卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物
CN108795906A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 四川德博尔制药有限公司 用于水解蛋壳膜的复合酶、蛋壳膜的水解方法、蛋壳膜水解产物及其提取方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795906A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 四川德博尔制药有限公司 用于水解蛋壳膜的复合酶、蛋壳膜的水解方法、蛋壳膜水解产物及其提取方法
CN112263710A (zh) * 2020-09-23 2021-01-26 同济大学 一种兼具抗炎和骨-软骨修复功能的生物陶瓷支架及其制备方法与应用
TWI840978B (zh) 2021-09-30 2024-05-01 中央研究院 生產蛋殼膜水解物的方法
CN116084089A (zh) * 2022-12-07 2023-05-09 江南大学 以废弃蛋壳内膜为原料的纳米纤维膜制备方法
CN115970067A (zh) * 2023-01-17 2023-04-18 中山大学附属口腔医院 一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用
CN115970067B (zh) * 2023-01-17 2023-10-17 中山大学附属口腔医院 一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111330078B (zh) 2020-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111330078B (zh) 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用
Fang et al. Biomimetic gelatin methacrylamide hydrogel scaffolds for bone tissue engineering
US9272045B2 (en) Method of tissue repair using a composite material
CN102266585B (zh) 一种用于女性盆底的生物复合补片及其制造方法
CN105408361B (zh) 硫酸乙酰肝素
Li et al. Effect of silanization on chitosan porous scaffolds for peripheral nerve regeneration
CN108114318B (zh) 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用
CN108066816B (zh) 一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用
CN105412987B (zh) 一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法
Gupta et al. Pathway-driven peptide–bioglass nanocomposites as the dynamic and self-healable matrix
Yang et al. Biomineralization of natural collagenous nanofibrous membranes and their potential use in bone tissue engineering
CN109758606A (zh) 一种rgd多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法
CN101954123A (zh) 一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法
CN110478528A (zh) 一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用
US20220411592A1 (en) Method for inducing gelation and biomimetic mineralization of silk fibroin solution by alkaline phosphatase
CN102100927B (zh) 多孔羟基磷酸钙纳米颗粒修饰的钛基钛酸盐纳米线生物支架材料及其制备方法
Chen et al. Collagen membrane derived from fish scales for application in bone tissue engineering
CN104758981A (zh) 一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜及其制备方法
CN1846793B (zh) 一种组织工程骨及其构建与应用
CN109453430A (zh) 一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料及其制备方法
CN102971019B (zh) 用于复杂组织工程化的方法
CN113975460B (zh) 一种可介导神经化的骨修复支架材料及其制备方法、应用
CN115216441A (zh) 一种用于干细胞三维培养的复合支架及其制备方法
Iandolo et al. Preclinical safety study of nacre powder in an intraosseous sheep model
CN1241879C (zh) 磷酸钙陶瓷表面形成类骨磷灰石层的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant