CN115970067B - 一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高分子材料技术领域，具体公开了一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用。方法包括：提取蛋壳膜；利用EDC.HCl及NHS的MES缓冲液配制聚乙烯亚胺溶液a或聚乙烯亚胺溶液，聚乙烯亚胺溶液的分子量为2KDa～25KDa，制备过程中还加入单宁酸，获得混合溶液；将蛋壳膜置于聚乙烯亚胺溶液a或混合溶液中混合，漂洗，烘干，制得智能化引导骨组织再生膜。智能化引导骨组织再生膜具有抗污、防感染以及诱导自矿化促进骨再生等优点，智能化引导骨组织再生膜易于制备、成本低廉、突破了原有的技术瓶颈和应用缺陷；本发明将环境保护、农林废弃物再利用与高精生物材料制备有机结合，为废弃蛋壳膜提供绿色环保的处理方案。

Description

一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域，尤其是涉及一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用。
背景技术
目前利用组织再生技术恢复牙周炎或种植体周围炎所致的软硬组织缺损，是口腔科常见的治疗策略，也是口腔医学中最常见、最有前景的技术之一。引导组织再生(Guidedtissue regeneration，GTR)最早在20世纪50年代由Hurley提出，80年代被引入牙周组织再生，随后广泛应用于种植体周围生成新骨而被定义为引导骨再生(Guided boneregeneration,GBR)。GBR/GTR的原理为：使用一种特殊的屏障膜来阻隔迁移速率较快的结缔上皮组织细胞进入缺损区，从而为骨、牙骨质和牙周韧带再生提供足够的时间、空间。
目前常用的屏障膜大致分为两种类型：不可吸收膜和可吸收膜。其中，不可吸收膜包括：聚四氟乙烯衍生物、钛膜等；可吸收膜包括：天然胶原膜、聚酯合成膜等。不可吸收膜因其机械稳定性及生物相容性等性能，而被公认为科研及临床研究的金标准。但是，不可吸收膜也存在着机械强度过大易导致暴露感染、膜不可吸收需二次手术移除、膜结构过致密而无法输送成骨相关因子等局限。而可吸收膜的研发，极大地克服了不可吸收膜的局限，广泛应用于临床多年，如Bio-Gide等；但可吸收膜存在降解速度过快，与组织形成速度不匹配，生物活性不足导致骨整合欠佳及无法抵抗口腔复杂微生物环境所带来的创口感染等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用。本发明制备的智能化引导骨组织再生膜具有抗污、防感染以及诱导自矿化促进骨再生等优点，相较目前临床GBR膜生产工艺复杂、成本高昂、易暴露感染以及生物活性不足的问题，制备的智能化引导骨组织再生膜易于制备、成本低廉、突破了原有的技术瓶颈和应用缺陷；将环境保护、农林废弃物再利用与高精生物材料制备有机结合，为废弃蛋壳膜提供绿色环保的处理方案且有巨大的潜在医疗和经济效益。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种智能化引导骨组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：
1)提取蛋壳膜；
2)利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的MES缓冲液配制摩尔浓度为2.5mmol/L～7.5mmol/L的聚乙烯亚胺溶液a，所述聚乙烯亚胺溶液a的分子量为2KDa～25KDa；
或者，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的MES缓冲液配制质量浓度为20～40mg/ml的聚乙烯亚胺溶液b，所述聚乙烯亚胺溶液b的分子量为2KDa～25KDa，再加入单宁酸，获得混合溶液；
3)将蛋壳膜置于聚乙烯亚胺溶液a或步骤2)获得的混合溶液中混合，漂洗，烘干，制得智能化引导骨组织再生膜。
构建新型GBR膜用于修复骨缺损一直是研究的热点和难点。目前常用胶原膜改性、高分子聚合物合成基膜再改性等方式构建，但人工合成材料无法再现天然材料或组织固有的精妙有序“设计”，存在系列短板。
在本发明的技术方案中，本发明利用蛋壳膜和骨膜细胞外基质的结构成分相似性，并在此基础上进行功能修饰和改进，可极大程度达到骨再生效能，为今后研发GBR生物材料提供新的思路。
本发明的发明人经过大量研究及试验发现，设计聚乙烯亚胺溶液的分子量为2KDa～25KDa和摩尔浓度为2.5mmol/L～7.5mmol/L，可以实现一步法接枝蛋壳膜(ESM)的改性，制备获得的智能化引导骨组织再生膜具有较好的生物相容性和多功能生物活性，同时还具有阻挡细胞及细菌等异物穿透的能力和良好的抗污抗菌性，并且，使用特定浓度和分子量的聚乙烯亚胺溶液对蛋壳膜改性，可以有效减慢蛋壳膜的降解，降解率由9.39％±0.4％下降至7.58％±0.3％，差异有统计学意义。经过实验的记载，制备的智能化引导骨组织再生膜具备仿生自矿化的性能、促进BMSCs成骨分化的性能和诱导成血管的性能。
当设计聚乙烯亚胺溶液的分子量为2KDa～25KDa和质量浓度为20～40mg/ml时，且加入单宁酸，与聚乙烯亚胺溶液复配，可以有效减慢蛋壳膜的降解，降解率由9.39％±0.4％下降至7.3％±0.3％，差异有统计学意义(P<0.05)。经过单宁酸与聚乙烯亚胺溶液复配的技术方案改性蛋壳膜获得的智能化引导骨组织再生膜具有更佳优异的亲水性、屏障性、生物相容性和抗菌抗污性；并且，智能化引导骨组织再生膜在自矿化性能、诱导成骨等方面性能也较佳，可用于引导骨组织再生。
当聚乙烯亚胺分子量及浓度不再上述范围内，不能同时获得生物相容性和抗菌性能均较佳的智能化引导骨组织再生膜。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述聚乙烯亚胺溶液a或聚乙烯亚胺溶液b的分子量为2KDa或25KDa。优选地，所述聚乙烯亚胺溶液a或聚乙烯亚胺溶液b的分子量为2KDa。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述聚乙烯亚胺溶液a的摩尔浓度为5mmol/L。
当聚乙烯亚胺溶液的分子量为2KDa，摩尔浓度为5mmol/L时，获得的智能化引导骨组织再生膜综合性能均较优。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述单宁酸的质量浓度为20mg/ml。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述蛋壳膜来源于禽蛋壳。本发明所涉及的蛋壳膜的来源不仅仅包括上述禽蛋壳，还包括本领域中农林废弃物所提取出的蛋壳膜，均在本发明的保护范围之内。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述智能化引导骨组织再生膜的孔径为5～100nm。
智能化引导骨组织再生膜的孔径为5～100nm，表明智能化引导骨组织再生膜具有大孔、介孔结构，具备阻挡细胞及细菌等异物穿透的能力。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量百分比为2.5～5％；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量百分比为3.75～7.5％。
作为本发明所述智能化引导骨组织再生膜的制备方法的优选实施方式，所述蛋壳膜提取方法具体步骤为：将禽蛋壳置于质量浓度为8g/L的乙酸中提取蛋壳膜。
第二目的，本发明提供了上述智能化引导骨组织再生膜的制备方法制备获得的智能化引导骨组织再生膜。
第三目的，本发明提供了上述智能化引导骨组织再生膜在制备防污抗菌材料中的应用。
第四目的，本发明提供了上述智能化引导骨组织再生膜在制备用于引导骨组织再生材料中的应用。
本发明制备的智能化引导骨组织再生膜具有仿生自矿化的性能、具备促进BMSCs成骨分化功能，并且当单宁酸与特定的浓度和分子量的聚乙烯亚胺溶液复配获得的智能化引导骨组织再生膜的外膜相对于内膜的成骨诱导效果更优。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种智能化引导骨组织再生膜及其制备方法和应用。本发明制备的智能化引导骨组织再生膜具有抗污、防感染以及诱导自矿化促进骨再生等优点，相较目前临床GBR膜生产工艺复杂、成本高昂、易暴露感染以及生物活性不足的问题，制备的智能化引导骨组织再生膜易于制备、成本低廉、突破了原有的技术瓶颈和应用缺陷；其中，限定了特定浓度和分子量的聚乙烯亚胺溶液，实现了一步法接枝蛋壳膜(ESM)的改性，或者将聚乙烯亚胺溶液和单宁酸复配，制备获得的智能化引导骨组织再生膜均具有较好的生物相容性和多功能生物活性，同时还具有阻挡细胞及细菌等异物穿透的能力、良好的抗污抗菌性和有效减慢蛋壳膜的降解等优点。本发明将环境保护、农林废弃物再利用与高精生物材料制备有机结合，为废弃蛋壳膜提供绿色环保的处理方案且有巨大的潜在医疗和经济效益。
附图说明
图1为ATR-FTIR检测ESM经不同分子量(2KDa、25KDa)BPEI处理前后内外表面官能团的变化结果图I；
图2为ATR-FTIR检测ESM经不同分子量(2KDa、25KDa)BPEI处理前后内外表面官能团的变化结果图II；
图3为ATR-FTIR检测ESM经BPEI-TA处理前后表面官能团的变化结果图；
图4为2KDaBPEI-ESM及25KDaBPEI-ESM的水接触角统计图(***P＜0.001)；
图5为ESM、临床用商品化HAIAO膜、BPEI-TA-ESM的完全湿润时间比较结果图(*：P＜0.05，***：P＜0.001)；
图6为实施例1制备的BPEI-ESM的氮气吸附和脱附等温线(图6-A)和孔径分布(图6-B)结果图；
图7为空白对照组、ESM及实施例5的BPEI-TA-ESM与mBMSCs共培养5天的transwell实验结果图(×20)；
图8为HAIAO膜、ESM及实施例1的BPEI-ESM浸泡在I型胶原酶中36h后的失重百分比结果图(***P＜0.001；**P＜0.05)；
图9为HAIAO膜、ESM及实施例5的BPEI-TA-ESM浸泡在I型胶原酶中36h后的失重百分比结果图(***P＜0.001；**P＜0.05)；
图10为ESM、HAIAO膜、2KDaBPEI-ESM(实施例1的BPEI-ESM)及25KDaBPEI-ESM(实施例4的BPEI-ESM)与L-929小鼠成纤维细胞共培养7d的CCK-8结果图(***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.005)；
图11为实施例1-3制备的BPEI-ESM的CCK8结果图；
图12为ESM、临床用商品化HAIAO膜及实施例5的BPEI-TA-ESM的在L929小鼠成纤维细胞中培养7天的CCK-8结果图；
图13为ESM及实施例1的BPEI-ESM在钙磷溶液中矿化2周的扫描电镜、透射电镜及电子衍射图结果图(该图存在系统自带的部分，部分字体不清楚，不影响本发明的实质内容)；
图14为2kDaPEI-TA-ESM及25kDaPEI-TA-ESM在钙磷溶液中矿化2周的内表面、外表面及横截面的扫描电镜图(该图存在系统自带的部分，部分字体不清楚，不影响本发明的实质内容)；
图15为2kDaPEI-TA-ESM及25kDaPEI-TA-ESM的能谱元素图；
图16为观察实施例1的BPEI-TA-ESM在钙磷溶液中形成自矿化结果图(该图存在系统自带的部分，部分字体不清楚，不影响本发明的实质内容)；
图17为BMSCs培养7d后HAIAO膜、ESM及实施例1的BPEI-ESM的茜素红染色的宏观及显微图；
图18为BMSCs培养7d后HAIAO膜、ESM及实施例1的BPEI-ESM的茜素红染色定量分析图(***P<0.001)；
图19为BMSCs培养7d后HAIAO膜、ESM及实施例4的BPEI-TA-ESM的茜素红染色的宏观及显微图(×10)；
图20为BMSCs培养7d后HAIAO膜、ESM及实施例4的BPEI-TA-ESM的茜素红染色定量分析图(***P<0.001)；
图21为BMSCs培养7d后实施例4的BPEI-TA-ESM内外膜的茜素红染色定量分析图(*P<0.01)；
图22为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM与HUVECs共培养3d的细胞增殖显微图；
图23为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM与HUVECs共培养第1、2及3d的CCK-8结果图(***P<0.001)；
图24为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM对HUVECs迁移的影响(×4)；
图25为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM组在1、21h的划痕愈合面结果图(***P<0.001)；
图26为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM对HUVECs的血管生成的影响图(×10)；
图27为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM在变性链球菌悬液中培养24h后的活死染色荧光显微图；
图28为ESM、HAIAO膜及实施例1的BPEI-ESM在变性链球菌悬液中培养24h后的稀释涂布平板图；
图29为ESM、HAIAO膜及BPEI-TA-ESM在变性链球菌悬液中培养24h后的活死染色荧光显微图；
图30为2kDaPEI-TA-ESM及25kDaPEI-TA-ESM在5mg/ml牛血清白蛋白中培养24hr后的蛋白吸附效果图(***P＜0.001)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)及其制备方法
本实施例提供了一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)的制备方法，包括以下步骤：
将禽蛋壳置于8g/L乙酸以提取蛋壳膜(Eggshell membrane，ESM)；利用含有质量浓度分别为2.5％及3.75％的交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的MES缓冲液配制摩尔浓度为5mmol/L的BPEI溶液(分子量为2KDa)；ESM置于BPEI溶液中避光室温反应24h，后双蒸水漂洗并烘干，制得智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)。
实施例2、一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)及其制备方法
与实施例1相比，区别在于，BPEI溶液的摩尔浓度为2.5mmol/L，其余制备方法及参数与实施例1相同。
实施例3、一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)及其制备方法
与实施例1相比，区别在于，BPEI溶液的摩尔浓度为7.5mmol/L，其余制备方法及参数与实施例1相同。
实施例4、一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)及其制备方法
与实施例1相比，区别在于，BPEI溶液的分子量为25KDa，其余制备方法及参数与实施例1相同。
实施例5、一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-TA-ESM)及其制备方法
本实施例提供了一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-TA-ESM)的制备方法，包括以下步骤：
将禽蛋壳置于8g/L乙酸以提取蛋壳膜(Eggshell membrane，ESM)；利用含有质量浓度分别为2.5％及3.75％的交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的MES缓冲液配制质量浓度为20mg/ml的BPEI溶液(分子量为2KDa)；将BPEI溶液和质量浓度为20mg/ml的单宁酸(TA)溶液后共混，ESM置于BPEI溶液中避光室温反应2h，后双蒸水漂洗并烘干，制得智能化引导骨组织再生膜(BPEI-TA-ESM)。
实施例6、一种智能化引导骨组织再生膜(BPEI-TA-ESM)及其制备方法
与实施例5相比，区别在于，BPEI溶液的分子量为25KDa，其余制备方法及参数与实施例5相同。
试验例一、物理性能测定
检测实施例1-5制备的智能化引导骨组织再生膜(BPEI-ESM)和实施例5-6制备的智能化引导骨组织再生膜(BPEI-TA-ESM)的的理化性能，检测项目包括：ATR-FTIR表征化学键改变，SEM及原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)表征形貌和纳米机械性能，热重分析(Thermogravimetric analysis，TGA)测空隙率和热稳定性，屏障功能测膜屏障效能，水接触角测试测定亲水性，酶降解试验测定降解性能。
1.热重分析：用Thermo Hake TG/DTA 320仪器对样品进行热分析。
将大约5mg的智能化引导骨组织再生膜放置在铂锅中，在空气中以5℃/min至1000℃的速度加热。
数据表示为体重损失与温度的关系和导数重量损失与温度的关系；
2.屏障功能检测：将智能化引导骨组织再生膜完全覆盖transwell小室的可渗透聚碳酸酯膜。将2×104/ml个mBMSCs放置在24孔transwell的上腔室中，并将500mlDulbecco氏改良Eagle氏培养基置于下室中。培养5天后，在室温下用4％多聚甲醛固定下室细胞30分钟，并用0.1％结晶紫溶液染色。然后，在20倍放大光学显微镜下观察是否有细胞迁移到底室。
3.水接触角检测：静态水接触角是使用固定液滴法从DSA-XROLL接触角测量系统获得的。每次将水滴以2.00μL/s的速率从注射器中滴至智能化引导骨组织再生膜的表面上，并记录静态接触角；
4.酶降解试验：将5mg冻干的智能化引导骨组织再生膜加入到1ml含有400U mL-1I型胶原酶的PBS溶液中。之后，将试管在37℃下以200rpm的转速孵育36小时。随后用蒸馏水冲洗残留样品，并在30℃的真空烘箱中干燥72小时。根据以下公式，使用初始和最终干重计算样品剩余重量的百分比。
降解度(％)＝[(Wt–W0)]/W0*100其中，W0和Wt分别为降解前后样品的重量。
结果：
1、交联结果：
如图1-2所示，ESM经BPEI处理(即采用实施例1、实施例4的制备方法)获得的BPEI-ESM，在3078、1394、1063和843cm-1处出现4个新峰，分别对应于烯烃的＝C-H伸展、烷烃的-C-H弯曲、脂肪族伯胺和仲胺的C-N伸展和N-H波峰，提示BPEI成功接枝于ESM。
如图3所示，ESM经BPEI和单宁酸处理(即采用实施例5、实施例6的制备方法)获得的BPEI-TA-ESM，1720cm-1和3392cm-1处的峰值显示TA的C＝O和OH基团，2960cm-1和3371cm-1处峰值显示PEI的CH2和NH2基团，提示BPEI-TA成功一步法接枝于ESM内外。
2、亲水性能：
参考图4所示，ESM经不同分子量的BPEI处理(实施例1、4)后，25KDa PEI组的内膜的水接触角为44.67±1.5°，外膜的接触角为75.33±2.0°；2KDa PEI组的内膜的水接触角为26±3.0°，外膜的接触角为52±2.0°；各组的内外膜水接触角均有明显的统计学差异(***P＜0.001)，表明2K组的亲水性更佳。
参考图5所示，将实施例5制备的BPEI-TA-ESM与不经处理的ESM、临床用商品化HAIAO膜进行对比，与ESM和HAIAO相比，BPEI-TA-ESM完全润湿时间大大缩短；ESM修饰前后，内膜的完全湿润时间均较外膜短。其中，完全湿润时间为在干燥情况下从水滴接触样品表面至水滴完全润湿样品的总时间，反映样品亲水性，完全湿润时间越短，亲水性越高。
3、屏障性能：
参考图6所示，实施例1的BPEI-ESM的孔径范围为5-100nm，平均孔径为10.74nm，表明BPEI-ESM具有大孔、介孔结构，具备阻挡细胞及细菌等异物穿透的能力(图6-A，图6-B)。
参考图7所示，将ESM及实施例5的BPEI-TA-ESM完全覆盖transwell小室底层的通透性聚碳酸酯膜，与mBMSCs共培养5天后，结晶紫染色transwell下室底板，可见空白对照组有细胞分布，ESM及BPEI-TA-ESM组未见细胞形态。
4、降解性能：
参考图8所示，HAIAO膜、ESM、实施例1的BPEI-ESM经过I型胶原酶浸泡36h后，HAIAO膜的降解率最高，达79％±2％，与ESM、实施例1的BPEI-ESM有明显统计学差异(P<0.001)；蛋壳膜经BPEI处理9(即实施例1的方法)后，降解率由9.39％±0.4％下降至7.58％±0.3％，差异有统计学意义(P<0.05)，说明BPEI改性可有效减慢ESM降解，显著优于HAIAO膜。
参考图9所示，HAIAO膜、ESM、实施例5的BPEI-TA-ESM经过I型胶原酶浸泡36h后，HAIAO膜的降解率最高，达98％±2％，与ESM、实施例5的BPEI-TA-ESM有明显统计学差异(P<0.001)；蛋壳膜经BPEI-TA处理(即实施例5的方法)后，降解率由9.39％±0.4％下降至7.3％±0.3％，差异有统计学意义(P<0.05)，说明BPEI-TA改性可有效减慢ESM降解，显著优于HAIAO膜。
5、生物相容性：
参考图10所示，将ESM、HAIAO膜、2KDaBPEI-ESM(实施例1制备的BPEI-ESM)及25KDaBPEI-ESM(实施例4制备的BPEI-ESM)与L-929小鼠成纤维细胞共培养7d，25KDaBPEI-ESM与HAIAO组无明显统计学差异(P＜0.05)，2KDaBPEI-ESM与HAIAO组在第1、3、5及7天均出现明显的统计学差异(P＜0.05)，并且2KDaBPEI-ESM的OD值与25KDaBPEI-ESM有明显的统计学差异，表明2KDaBPEI-ESM的细胞增殖能力更强，生物相容性更高。
参考图11所示，不同摩尔浓度的25KDaBPEI-ESM(实施例1-3制备的BPEI-ESM)的生物相容性对比，5mmol/l的OD值更高，生物相容性更好。
参考图12所示，将ESM、HAIAO膜、实施例4的BPEI-TA-ESM在L929小鼠成纤维细胞中培养7天，由双因素重复测量方差分析表明，除了第3、5天，BPEI-TA-ESM与HAIAO膜结果有明显的统计学意义(p<0.05)；除了第3天，BPEI-TA-ESM与ESM结果无明显统计学差异(p<0.05)。故从细胞周期培养而言，BPEI-TA-ESM的生物相容性较临床常用的HAIAO膜有更好的生物相容性；同时，对比改性前后的ESM，其生物相容性无明显差异。
试验例二、生化性能测定
1、自矿化性能：
参考图13，通过扫描及透射电镜观察，钙磷溶液中矿化2周的ESM表面及纤维内未见矿化物质沉积(图13-A、图13-C、图13-E)；实施例1制备的BPEI-ESM表面及纤维内有矿化物质均匀沉积(图13-B、图13-D)，透射电镜显示BPEI-ESM纤维芯(橙色箭头)及纤维被套层(蓝色箭头)中均有矿物质，电子衍射显示有羟基磷灰石特征性衍射环出现(图13-F右下角)，说明改性后ESM具备仿生自矿化的性能。
参考图14-15所示，通过扫描及透射电镜观察，钙磷溶液中矿化2周的2kDaPEI-TA-ESM(实施例4)及25kDaPEI-TA-ESM(实施例5)内外表面均匀沉积钙磷矿化物，钙磷溶液中矿化2周的ESM表面及纤维内未见矿化物质沉积；但横截面显示2kDaPEI-TA-ESM矿物质沉积效果更佳(黄色箭头)。ESM内膜、外膜见大量矿化结构，呈球状均匀分布，未见裸露的ESM纤维结构，其中外膜比内膜的矿物分布更致密；膜截面处钙磷矿化物呈花瓣状交错沉积。说明BPEI-TA改性后ESM具备仿生自矿化的性能。
参考图16，观察实施例4的BPEI-TA-ESM在钙磷溶液中形成自矿化，胶原内有碳(图16-A)、磷(图16-B)、氮(图16-D)以及钙(图16-E)元素沉积，钙磷在外膜沉积比内膜多，截面处钙磷均匀分布(图16-F)，而且位于纤维内部；提示纤维内仿生矿化。
2、诱导成骨：
参考图17-18所示，茜素红染色定量分析实施例1的BPEI-ESM形成的矿化结节明显多于HAIAO膜及ESM，表明BPEI-ESM具备促进BMSCs成骨分化功能。
参考图19-20所示，茜素红染色定量分析实施例4的BPEI-TA-ESM形成的矿化结节明显多于HAIAO膜及ESM，表明BPEI-ESM具备促进BMSCs成骨分化功能，并且BPEI-TA-ESM外膜相对于内膜的成骨诱导效果更优(图21)。
3、诱导成血管：
参考图22所示，结晶紫染色法评估材料直接接触对HUVECs增殖的影响。共培养60hr后，各组细胞形态良好，呈纺锤状。ESM及实施例1的BPEI-ESM的细胞铺满皿底，相较HAIAO膜的细胞贴壁面积约皿底的1/10，有显著差异。参考图23所示，CCK-8结果亦对应图22细胞增殖情况，ESM与实施例1的BPEI-ESM的OD值差异无统计学意义；ESM、实施例1的BPEI-ESM组均与HAIAO膜的OD值差异有明显的统计学意义(P<0.001)。参考图24所示，组间初始划痕宽度一致。7h时，HAIAO膜划痕面积未见变化，ESM及实施例1的BEPI-ESM划痕面积略有减少，为初始划痕面积的44±2.1％、68±2.3％(图25)，两者有明显统计学差异(P<0.001)；24h时，HAIAO膜划痕面积未见变化，ESM及实施例1的BEPI-ESM划痕完全愈合。图26示，3h时，ESM、实施例1的BPEI-ESM均表现出明显的成管效果；21h时，两组成管趋于稳定，成管效果无显著差异。
4抗菌抗污性能：
参考图27-28所示，活死染色荧光显微图像显示实施例1的BPEI-ESM细菌杀伤能力显着增加(图27-A、图27-B、图27-C)，稀释涂布平板亦显示BPEI-ESM的良好抗菌活性(图28-D、图28-E、图28-F)。
参考图29所示，将ESM、HAIAO膜及BPEI-TA-ESM在变性链球菌悬液中培养24h，活死染色荧光显微图像显示实施例4的BPEI-TA-ESM细菌杀伤能力显着增加。
参考图30所示，将2kDaPEI-TA-ESM及25kDaPEI-TA-ESM在5mg/ml牛血清白蛋白中培养24h，25kDaPEI-TA-ESM的OD值为0.560±0.003，2KDaBPEI-TA-ESM的OD值为0.268±0.02，差异有明显的统计学意义(***P＜0.001)，其抗蛋白吸附性能更佳。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种智能化引导骨组织再生膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取蛋壳膜；
2)利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的MES缓冲液配制摩尔浓度为2.5mmol/L～7.5mmol/L的聚乙烯亚胺溶液a，所述聚乙烯亚胺溶液a的分子量为2KDa或25KDa；
或者，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的MES缓冲液配制质量浓度为20～40mg/ml的聚乙烯亚胺溶液b，所述聚乙烯亚胺溶液b的分子量为2KDa或25KDa，再加入单宁酸，获得混合溶液；
3)将蛋壳膜置于聚乙烯亚胺溶液a或步骤2)获得的混合溶液中混合，漂洗，烘干，制得智能化引导骨组织再生膜；所述智能化引导骨组织再生膜的孔径为5～100nm。
2.如权利要求1所述的智能化引导骨组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺溶液a的摩尔浓度为5mmol/L。
3.如权利要求1所述的智能化引导骨组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述单宁酸的质量浓度为20mg/ml。
4.如权利要求1所述的智能化引导骨组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述蛋壳膜来源于禽蛋壳。
5.如权利要求1所述的智能化引导骨组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量百分比为2.5～5％；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量百分比为3.75～7.5％。
6.如权利要求1～5任一项所述的智能化引导骨组织再生膜的制备方法制备获得的智能化引导骨组织再生膜。
7.如权利要求6所述的智能化引导骨组织再生膜在制备防污抗菌材料中的应用。
8.如权利要求6所述的智能化引导骨组织再生膜在制备用于引导骨组织再生材料中的应用。
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