CN111323570B - 基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血液检测技术领域，尤其涉及一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法。本发明的技术方案是：将待检抗凝血分别应用血栓弹力图普通杯测定血栓强度MACK和含有肝酯酶的血栓弹力图杯测定血栓强度MAAA，两者差值比较可代表阿司匹林药物疗效及残留情况，含有肝酯酶的血栓弹力图杯MAAA可以使血液中的阿司匹林水解为水杨酸，通过与不含肝酯酶分解阿司匹林血栓弹力图杯MACK对照，根据两者差值与含有肝酯酶的血栓弹力图杯MAAA比值计算血小板抑制率来评估其阿司匹林抵抗，具有操作简单，成本低，检测速度快，方法路径佳的特点，具有技术推广价值。

Description

基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法
技术领域
本发明涉及血液检测技术领域，尤其涉及一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法。
背景技术
阿司匹林(乙酰水杨酸)是由水杨酸(邻羟基苯甲酸)与醋酸酐进行酯化反应而得的，阿司匹林为抗血小板聚集药物，但是，在临床上口服阿司匹林患者仍然常会发生血栓栓塞事件，这被学术界称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)现象，阿司匹林被认为是世界上最广泛使用的抗血小板聚集药物之一，阿司匹林在心脑血管疾病的预防及治疗中发挥了极其重要的作用，并不是所有患者都能从服用阿司匹林中获得理想的治疗效果，服用阿司匹林的心脑血管患者或伴有心血管病变的高危患者中，约有25％～40％的病例出现失败，因而科学家们提出了“阿司匹林抵抗”(aspirin resistance，AR)的概念，实验室检测的血小板活性或聚集率未达到有效抑制，由于阿司匹林的半衰期不足15min，大部分阿司匹林被肝脏中广泛表达的阿司匹林酯酶快速水解成无抗血小板聚集作用的水杨酸。因此，大多数阿司匹林经由门脉循环到达全身循环后，阿司匹林的有效剂量相对不足，致使其在血液循环中难以达到抗血小板聚集的有效剂量，从而使其在全身的抗血小板聚集作用下降。
血栓弹力图仪监测血凝块的物理特性基于以下原理：一特制静止盛有血液的圆柱形杯，以4°45’的角度旋转，每一次转动持续9秒，通过一根由螺旋丝悬挂且浸泡在血样中的针来监测血样的运动，纤维蛋白血小板复合物将杯和针粘在一起后，杯旋转所产生的旋转力能传递至血样中的针，纤维蛋白-血小板复合物的强度能影响针运动的幅度，以致强硬的血凝块能使针的运动与杯的运动同步进行，因此，针的运动幅度与已形成的血凝块的强度有直接关系，当血凝块回缩或溶解时，针与血凝块的联结解除，杯的运动不再传递给针，针的旋转被机电传感器转换成电子信号，这一电子信号能用电脑来监测，反映出血液的凝固状态。
阿司匹林进入机体后，可迅速被胃肠道、红细胞和肝中广泛表达的阿司匹林酯酶快速水解，这些与阿司匹林水解相关的酯酶通常被称为阿司匹林酯酶(aspirin esterase，AE)，AE的活性升高可引起阿司匹林生物利用度降低，从而导致AR发生率增加。肝酯酶(PLE)可以水解阿司匹林，来源于猪肝脏的冻干酶粉，为多种同工酶的混合物，含三个亚基，分子量在162kDa左右，可以催化动力学拆分和去对称化前手性酯类化合物得到化学法难以得到的高光学活性酯、醇和羧酸，25℃，pH 8.0的水溶液中，每分钟催化水解1微摩尔酯的酶活性为1U。
临床实验室常用的阿司匹林抵抗检测方法为：血小板聚集率和血栓弹力图检测血小板抑制率检测，但目前的血栓弹力图检测阿司匹林抵抗需采用MACK(含有高岭土和氯化钙)和MAA(含有十三因子和巴曲酶)和MAAA(含有花生四烯酸)三个试剂杯进行实验，通过下列公式计算而得：
Figure GDA0003157542680000021
测定成本高、费时、工作复杂、增加工作误差。另外，由于国内阿司匹林药物质量参差不齐，个体对阿司匹林代谢水平不一致，造成测定结果误差大，因此，针对以上不足，本发明提供了一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法。
发明内容
本发明目的是提供一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法，以解决现有的检测中存在的成本高、费时、工作复杂、检测准确性差的问题。
本发明的的技术方案是：将抗凝血分别应用血栓弹力图普通杯测定血栓强度MACK和含有肝酯酶的血栓弹力图杯测定血栓强度MAAA，两者差值可代表阿司匹林药物疗效及残留情况，含有肝酯酶的血栓弹力图杯MAAA可以使血液中的阿司匹林水解为水杨酸，通过与不含肝酯酶分解阿司匹林血栓弹力图杯MACK对照，对比血栓强度状态便可以评估其阿司匹林效果，计算公式如下：
Figure GDA0003157542680000022
附图说明：
图1应用血栓弹力图普通杯和含有肝酯酶的血栓弹力图杯测定血栓强度图。
图中：1.普通杯弹力图MACK
2.含有肝酯酶杯弹力图MAAA
具体实施方式：
实施例1
1.缓冲液配制：121.1g Tris置于1L烧杯中，加入约200mL的去离子水，充分搅拌溶解，甘露醇4.0％，牛血清白蛋白2.0％，Proclin-3000.2uL，加盐酸5.0uL，蒸馏水稀至1000mL，即为1L 1M pH7.6(25℃)的Tris-盐酸缓冲液。
2.肝酯酶的血栓弹力图杯制作取上述配制的缓冲液10mL加入到肝酯酶工作液中混匀静置15分钟，取20uL加入到血栓弹力图杯，使血栓弹力图杯测定中肝酯酶浓度为50U/L，同时加入20uL缓冲液加入到血栓弹力图杯作对照。
也可将混合试剂包被于血栓弹力图杯中，经冷冻、抽真空处理形成肝酯酶的血栓弹力图杯，-25℃冰冻保存。
实施例2
实验测定：将杯子移至测试位置，测试杆拨至“测试”位，点击“开始”或“Start”，开始测试，加入肝酯酶的缓冲液血栓弹力图杯与血样充分混匀，分解阿司匹林产生水杨酸，破坏阿司匹林功能，产生血小板抵抗，所测得的血块强度值为血液中无阿司匹林血块强度MAAA，而不含肝酯酶的杯子与血样混合后不改变阿司匹林浓度和功能，所检测的血栓弹力图MA值为特异的患者血液中MACK值，若血液样本中存在阿司匹林，MACK值小于MAAA，阿司匹林有效，若两者相等，表示阿司匹林无效或抵抗。
阿司匹林化学名为2-乙酰氧基苯甲酸，在体内通过肝酯酶和粒细胞酯酶分解为水杨酸，在本发明中，碱性缓冲液可以中和水杨酸，利于阿司匹林降解反应方向进行，牛血清白蛋白和甘露醇利于保护酯酶活性，Proclin-300为高效抗菌剂。使用阿司匹林(AA)要求血小板抑制率在50％以上，才能达到血小板抑制作用；如果抑制率在50％与20％之间，则需加大药剂量，在服用一周后，再一次检查抑制率；当小于20％的情况下，说明患者存在阿司匹林抵抗，则需换药，应定期做血栓弹力图检测。
本发明的积极效果是：本发明提供的是基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法，将含有肝酯酶的弹力图杯和不含有肝酯酶的弹力图杯进行测定比较，通过血块强度MA计算血小板抑制率。当发生阿司匹林抵抗时，两种弹力图MA测定结果一致；当血液中含有阿司匹林时，两种弹力图杯子测定结果不一致，含有肝酯酶的杯子降解阿司匹林，MACK值小于MAAA，阿司匹林有效，也可以通过抑制率调节用药量达到最佳效果。
综上所述，本发明评估阿司匹林具有操作简单，成本低，检测速度快，方法路径佳的特点，具有技术推广价值。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均属本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (4)

1.一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法，其技术方案为：将抗凝血分别应用血栓弹力图普通杯测定血栓强度MACK和含有肝酯酶的血栓弹力图杯测定血栓强度MAAA，两者差值可代表阿司匹林药物疗效及残留情况，含有肝酯酶的血栓弹力图杯MAAA可以使血液中的阿司匹林水解为水杨酸，通过与不含肝酯酶分解阿司匹林血栓弹力图杯MACK对照，对比血栓强度状态便可以评估其阿司匹林效果，计算公式如下：
Figure FDA0003157542670000011
2.根据权利要求1所述的一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法，其特征在于使用的一种为血栓弹力图普通杯，另一种为含有肝酯酶的血栓弹力图杯，通过血栓弹力图测定的MACK和MAAA计算血小板抑制率来评估阿司匹林抵抗。
3.根据权利要求2所述的一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法，其特征在于肝酯酶缓冲液配置方法为：121.1g Tris置于1L烧杯中，加入约200mL的去离子水，充分搅拌溶解，甘露醇4.0％，牛血清白蛋白2.0％，Proclin-3000.2uL，稀盐酸5.0uL，加蒸馏水至1000mL，即为1L 1M pH7.625℃的Tris-盐酸缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种基于血栓弹力图的阿司匹林药物抵抗检测方法，其特征在于含有肝酯酶血栓弹力图杯制作方法为：取配制的缓冲液5mL加入到肝酯酶工作液中混匀静置15分钟，取20uL加入到血栓弹力图杯，使血栓弹力图杯测定中肝酯酶浓度为10～90U/L，同时加入20uL缓冲液加入到血栓弹力图杯作对照。
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