CN111321173A

CN111321173A - 甘露聚糖酶在发酵酒精中的应用

Info

Publication number: CN111321173A
Application number: CN201811532506.1A
Authority: CN
Inventors: 许宏贤; 彭辉; 白挨玺
Original assignee: Nanjing Bestzyme Bio Engineering Co ltd
Current assignee: Nanjing Bestzyme Bio Engineering Co ltd
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN111321173B; WO2020119778A1

Abstract

本发明属于发酵领域，具体涉及一种甘露聚糖酶在发酵生产中的应用，特别是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的甘露聚糖酶在酒精发酵过程中的应用。

Description

甘露聚糖酶在发酵酒精中的应用

技术领域

本发明涉及生产发酵领域，具体涉及甘露聚糖酶在发酵酒精中的应用。

背景技术

木薯是热带和亚热带广泛种植的粮食和经济作物，适应性很强，耐旱、耐瘠、耐水，对土质要求不高，是可在任何土质中生长的作物。我国南方盛产木薯，产量高淀粉含量高，木薯的块根淀粉含量达25-30％左右，木薯干淀粉含量达70％左右，是被誉为“淀粉之王”。在发酵工业上，木薯淀粉或干片可制酒精、柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸、葡萄糖、果糖等，这些产品在食品、饮料、医药、纺织(染布)、造纸等方面均有重要用途。然而在生产中，木薯中大部分裸露的淀粉很容易被人们使用，而纤维素和半纤维素、木质素和少量的蛋白质以及外层的果胶所缠绕包裹着的一部分淀粉颗粒却难以被利用。在传统工艺中，物料在蒸煮阶段添加液化酶，在发酵阶段添加酸性蛋白酶，酶制剂作用时间晚、作用时间短、不能将物料中的半纤维素切断将里边的淀粉释放出来，也不能利用木薯中的纤维素。对于某些物料，例如红薯、木薯等，在做酒精发酵配醪过程中，物料吸水性大，再加上受热淀粉膨胀，物料黏度增大，流动性差，物料浓度难以再增加，并且物料含有一定的半纤维素，半纤维素缠绕的一部分淀粉不能被释放出来，不但能耗高，而且设备容易损坏，原料中淀粉利用率低。近年来，随着木薯原料用于生产酒精逐渐受到人们的重视，但生产过程中也遇到原料转化率低，醪液黏度较大等问题，以至于经济效益较差。

甘露聚糖酶(mannanase)是一类能够水解含有甘露糖苷键的甘露聚糖(包括异甘露聚糖)的半纤维素酶类，其主要水解产物为单糖、二糖、三糖、四糖等。目前，甘露聚糖酶在发酵酒精中的应用的报道还较少，其应用于酒精发酵的方法也有待研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高淀粉含量原料发酵生产酒精的方法，所述方法包括高淀粉含量的原料在适于酒精发酵的条件下发酵生产酒精，其特征在于，在生产过程中存在和/或添加具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少95％一致性的甘露聚糖酶活性的多肽。

在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少96％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少97％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有与SEQID NO:1所示氨基酸序列至少98％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少99％一致性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列衍生的具有甘露聚糖酶活性的多肽。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加两个、三个或四个氨基酸序列衍生的具有甘露聚糖酶活性的多肽。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加五个六个或七个氨基酸序列衍生的具有甘露聚糖酶活性的多肽。优选地，所述氨基酸的取代为保守的氨基酸取代。在一个优选的实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代一个或多个保守氨基酸衍生的具有甘露聚糖酶活性的多肽。

在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽的添加量为0.1-20U/g DS，优选为1-10U/g DS，更优选为10U/g DS。在一些实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽的添加量为约2U/g DS、约3U/g DS、约4U/g DS、约5U/g DS、约6U/g DS、约7U/g DS、约8U/g DS、约9U/g DS、约10U/g DS、约11U/g DS、约12U/g DS、约13U/g DS、约14U/g DS或约15U/g DS。在一些优选地实施方案中，所述甘露聚糖酶活性的多肽的添加量为约8U/g DS、约9U/g DS、约10U/g DS、约11U/g DS、约12U/g DS或约13U/g DS。

本发明所述高淀粉含量原料发酵生产酒精的方法，所述适于酒精发酵的条件下发酵生产酒精包括如下步骤：

(a)加入淀粉酶使高淀粉含量原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的原料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入发酵生物进行发酵；

(d)收获发酵液。

所述步骤(b)和步骤(c)顺序地进行或步骤(b)和步骤(c)同时进行；优选为步骤(b)和步骤(c)同时进行。

在一些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序地进行，先进行步骤(b)操作，使包含高淀粉含量的原料接受糖化酶的作用而进行糖化，再进行步骤(c)的操作。

在一些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行，即采用同时的糖化和发酵(SSF)过程，意味着糖化酶和发酵生物是基本上一起加入的。

所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为0.1～200U/g DS，优选为1～100U/g DS，更优选为10-100U/g。所述步骤(a)中高淀粉含量原料的料液比为1:1-1:10，优选地料液比为1:3-1:4。所述步骤(a)中液化作用在pH4-7范围内进行，优选在pH4.5-6范围内，和在温度80℃-120℃，优选地约85℃下进行液化。

所述步骤(b)中包括加入糖化酶，所述糖化酶的加入量为10-1000U/g DS，优选为20-600U/g DS，更优选为50-500U/g DS。

所述步骤(c)中发酵生物是酵母，优选酿酒酵母的菌株。进一步，所述步骤(c)还包括加入氮源。

所述步骤(c)中酵母加入量为0.01％-0.3％，优选为0.05％-0.2％，更优选为0.1％；所述氮源为尿素，加入量为0-1000ppm，优选为600ppm。

在一些实施方案中，步骤(b)的糖化和步骤(c)的发酵均在例如pH 3.0-6.0，特别是约pH4.3下进行。在一些实施例中，步骤(b)糖化在30℃-65℃下进行。在一些实施例中，所述发酵步骤(c)温度为20℃-35℃，优选的32℃下进行。

所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为1～100U/g DS；所述步骤(b)中糖化酶加入量为20-600U/g DS；所述步骤(c)中酵母加入量为0.05％-0.2％；所述氮源为尿素，加入量为0-1000ppm。

本发明所述高淀粉含量的原料发酵生产酒精的方法，可存在和/或添加甘露聚糖酶活性多肽的生产步骤选自：

高淀粉含量原料的液化步骤(a)；

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵步骤；或

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤。

在一个实施方案中，所述存在和/或添加甘露聚糖酶的步骤为糖化步骤(b)、发酵步骤(c)以及同时的糖化和发酵步骤。在一个优选实施方案中，所述添加甘露聚糖的步骤为同时的糖化和发酵的步骤。

在一个实施方案中，所述步骤(a)加入0.1～200U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量的原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，原料液化液调节pH3.0-6.0，添加20-600U/gDS糖化酶、0.05％-0.2％活性酵母、600ppm氮源尿素及1-10U/g DS甘露聚糖酶，在20℃-35℃条件下发酵48-96h。

在另一个实施方案中，所述步骤(a)加入1～100U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，原料液化液调节pH4.3，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性干酵母、600ppm氮源尿素以及10U/g DS甘露聚糖酶，在32℃条件下发酵72h。

本发明另一方面提供一种高淀粉含量原料生产发酵酒精的方法，所述发酵步骤包括：

(a)加入淀粉酶使高淀粉含量的原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的原料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入酵母进行发酵；

(d)收获发酵液；

其中，所述方法包括在下述步骤中存在和/或添加甘露聚糖酶：

高淀粉含量原料的液化步骤(a)；

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵；

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤；

其中，所述甘露聚糖酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

其中，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶；所述步骤(b)中加入糖化酶；所述步骤(c)中加入氮源尿素。

在一些实施方案中，所述步骤(a)加入0.1～200U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同时进行，将原料液化液调节pH 3.0-6.0，添加20-600U/g DS糖化酶、0.05％-0.2％活性酵母、600ppm氮源尿素以及1-10U/g DS甘露聚糖酶，在20℃-35℃，发酵48-96h。

在另一些实施方案中，所述步骤(a)加入1～100U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同时进行，原料液化液调节pH4.3，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性干酵母、600ppm氮源尿素以及10U/g DS甘露聚糖酶，在32℃，发酵72h。

甘露聚糖酶表达质粒的构建：选择质粒载体，示例的质粒为pUC19、pUC57；编码酶的核酸能够可操作地连接至合适的启动子，从而允许在宿主细胞中转录，表达载体还可包含合适的转录终止子；载体还可包含选择性标记，例如其产物补充分离的宿主细胞中的缺陷的基因，载体可包含曲霉属选择标记诸如amdS、argB。载体还可包含使得载体在宿主细胞中复制的DNA序列，此类序列的示例序列为质粒pUC19、pUC57或pUB110的复制起点。

甘露聚糖酶的表达：将甘露聚糖酶表达质粒导入表达菌株，如黑曲霉菌株，包括酶切线性化后转化入原生质体，原生质体的制备及转化过程为本领域技术人员所公知的技术；筛选得到阳性重组表达菌株；发酵培养重组表达菌株获得发酵液，常规提纯获得甘露聚糖酶。

本发明的有益技术效果包括：(1)本发明利用甘露聚糖酶将木薯的细胞壁及其他部位中的甘露聚糖水解，使细胞壁很快有效分解或崩溃，淀粉完全释放，从而提高酒精产出；(2)在另一方面甘露聚糖等非淀粉多糖造成醪液黏度较高，而通过水解甘露聚糖可以大幅降低醪液粘度，降低泵送粘度，节约能耗。

术语解释

术语“甘露聚糖酶”是指一类能够水解含有甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚精、葡甘聚糖等)的水解内切酶，它属于半纤维素酶类。其酶活定义为1g固体酶粉(1ml液体酶)，于37℃、pH 5.5的酶活力测定条件下，1min催化洋槐豆粉生成1μmol还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量定义为一个酶活力单位，以U/g(或U/mL)表示。

术语“淀粉酶”是指能水解淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精和少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉黏度迅速下降，其酶活定义为1g固体酶粉(或1mL液体酶),于70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。本发明涉及的淀粉酶包括但不限于具有该活力的淀粉酶。

术语“糖化酶”是指以淀粉为底物，在一定条件下从淀粉的非还原性末端开始水解α-1,4、α-1,6、α-1,3葡萄糖苷键产生葡萄糖的淀粉葡萄糖苷酶，其酶活定义1mL酶液或1g酶粉在40℃、pH4.6的条件下,1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位,以U/mL(或U/g)表示。本发明涉及的糖化酶包括但不限于具有该活力的淀粉酶。

术语“序列一致性”是指两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。当以预设参数使用CLUSTALW算法比对时，具体序列具有与指定参考序列的氨基酸残基至少一定百分比相同的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680。CLUSTALW算法的预设参数为：缺失计数为与参考序列相比不相同的残基。包括在任何末端发生的缺失。例如，缺失C末端的五个氨基酸残基的变体500个氨基酸残基多肽具有相对于亲本多肽的99％(495/500个相同残基×100)的序列一致性百分比。此类变体由语言“具有与亲本至少99％序列一致性的变体”涵盖。

术语“高淀粉含量的原料”是指基于期望的发酵产物(酒精即乙醇)来选择起始材料。适用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，高淀粉含量原料可为玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。在一个实施方案中，高淀粉含量原料为木薯。

术语“预糖化”指在糖化步骤之前，可以在任何合适的加工条件下进行的步骤，优选的预糖化持续时间为1-4小时，保持温度为30℃-60℃，和在例如pH4-5下进行。

术语“边糖化边发酵(SSF)”是指产生生物化学品的过程，其中在相同处理步骤期间存在微生物有机体诸如产乙醇微生物和至少一种酶诸如淀粉酶。SSF包括将淀粉底物(颗粒状的、液化的或增溶的)同期水解成糖类包括葡萄糖，并且在相同反应器容器中将糖类发酵成醇或其它生物化学品或生物材料。

术语“氨基酸取代”，指在预先确定的(初始)氨基酸序列中，用不同的氨基酸残基代替现有的氨基酸残基。相对于含初始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽，修饰一般优选会产生变体多肽的至少一种生理生化活性的改变。“保守氨基酸取代”指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular Biology ofthe Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/CummingsPub.Co.，第224页(第四版，1987))。这样的例示性取代优选依照以下所示的取代来进行：

例示性保守氨基酸取代

原残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
		Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu

术语“干固体含量(DS)”是指以干重百分比计，浆液的总固体。

术语“约”指引用值的±10％。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例在发酵步骤添加甘露聚糖酶对酒精发酵的影响

1.本发明的实验方法

原料液化：取一定量的木薯粉(购自某酒精厂)配制料水比为1：3-1：4的料液。配制完成后调节pH为4.5-6.0左右，添加适量的高温淀粉酶(如

X5，添加量10～100U/g DS)进行液化。液化条件：温度85℃，时间120min。

发酵：将液化好的料液及时降至室温并调节pH为4.3，将其均匀分装至摇瓶中，添加适量糖化酶(如糖化酶50～500U/g DS)、10U/g DS甘露聚糖酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，例如参照专利申请CN10643439A的构建、表达方法制备得到的甘露聚糖酶)以及活性干酵母0.1％(购自安琪酵母股份有限公司)与氮源尿素600ppm。发酵条件：温度32℃，时间72h。

醪液pH调节方式：用1mol/L的盐酸或3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH。

结果检测：发酵结束的料液，取部分离心获取上清液用于高效液相色谱分析与残还原糖、过滤总糖分析；另取部分料液直接用于黏度测量以及总糖测量。

2.对照组实验方法

原料液化：取一定量的木薯粉(购自某酒精厂)配制料水比为1：3-1：4的料液。配制完成后调节pH为4.5-6.0左右，添加适量的高温淀粉酶((如

发酵：将液化好的料液及时降至室温并调节pH为4.3，将其均匀分装至摇瓶添加适量糖化酶(如糖化酶50～500U/g DS)以及活性干酵母0.1％(购自安琪酵母股份有限公司)与氮源尿素600ppm。发酵条件：温度32℃，时间72h。

结果检测：发酵结束的料液，取部分离心获取上清液用于高效液相色谱分析与残还原糖、过滤总糖分析；另取部分料液直接用于黏度测量以及总糖测量

3.分析方法：

高效液相色谱分析方法：仪器：岛津LC-20A，色谱柱：Aminex HPX-87H柱子，流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.6ml/min，检测器为RID-20A。

黏度测定方法：仪器为HAAKE^TMViscotester^TMiQ Air，测量杯型号为CCB DIN/SS，测量转子型号为FL26 2B/SS。测量程序为Rot旋转时间扫描，其中转速为30S^-1，测量温度为30℃，测量时间为5min。

残余碳水化合物(残还原糖、残糊精、残淀粉)的测定：菲林定糖法

(1)还原糖测定

量取发酵液50毫升定容到250毫升，用脱脂棉过滤，取滤液10毫升，加入盛有斐林氏甲、乙液各5毫升和水20毫升的三角瓶中，按一般定糖法测糖，再用0.25％葡萄糖按同样条件做空白试验。

结果计算：

式中：A-滴入10毫升斐林氏液所用葡萄糖液毫升数

B-滴定加10毫升试液后耗用的葡萄糖液毫升数

50-吸取样品毫升数

(2)总糖的测定

量取发酵液50毫升，加入水40毫升，加20％盐酸10毫升，塞口具有1.0米长玻璃管的橡胶塞，在沸水浴中转化60分钟，取出冷却，以20％氢氧化钠中和至微酸性，转移250毫升容量瓶中加水至刻度，摇匀后，用脱脂棉过滤，吸取滤液10毫升加入盛有斐林氏甲、乙液各5毫升和水20毫升的三角瓶中，以0.25％的葡萄糖液滴定，然后以0.25葡萄糖滴定10毫升斐林氏液做空白试验。

结果计算：

式中：A-空白试验用葡萄糖液毫升数

B-滴定加10毫升试液后耗用葡萄糖液毫升数

(3)过滤总糖的测定

取测还原糖的发酵醪稀释过滤液100毫升，加20％盐酸10毫升，塞口具有1.0米长玻璃管的橡胶塞，在沸水浴中转化60分钟，取出冷却，以20％氢氧化钠中和至微酸性，转移250毫升容量瓶中加水至刻度，摇匀后，用脱脂棉过滤，吸取滤液10毫升加入盛有斐林氏甲、乙液各5毫升和水20毫升的三角瓶中，以0.25％的葡萄糖液滴定，然后以0.25葡萄糖滴定10毫升斐林氏液做空白试验。

(4)糊精及残余淀粉的计算

残糊精＝(过滤总糖-还原糖)×0.9克糊精/100毫升

残淀粉＝(残总糖-过滤总糖)×0.9克糊精/100毫升

4.实验结果

在酒精发酵初始添加具有甘露聚糖酶活性多肽。发酵结束后，利用高效液相色谱分析发酵液中的成分，检测醪液的残还原糖、过滤总糖、残总糖。结果如表1所示，根据高效液相色谱结果分析，添加甘露聚糖酶可以提高发酵液中酒精含量，酒精含量提高了近1％，每吨木薯可以多产出4.3L酒精。以年产10万吨酒精厂为例，每年可以多产出965吨酒精，一年可以增加产出579万元(以每吨酒精0.6万元计)；发酵液中四糖与三糖略有降低。从表2可看出，添加甘露聚糖酶可以降低发酵醪液的黏度。残糖结果分析如表3所示，添加甘露聚糖酶可以降低醪液中残总糖以及残淀粉含量。

表1高效液相色谱分析结果

表2添加甘露聚糖酶下醪液黏度结果

表3添加甘露聚糖酶下醪液残还原糖、过滤总糖、残总糖结果

本实验也尝试用传统的预糖化再发酵步骤，在发酵的预糖化过程中(开始，中间，结束)添加甘露聚糖酶，在酵母发酵的过程中(开始，中间，结束)或在边糖化边发酵的过程中(开始，中间，结束)添加甘露聚糖酶都能达提高酒精产率，降低发酵醪液粘度且降低发酵结束时残总糖及残淀粉浓度的效果。

序列表

<110> 南京百斯杰生物工程有限公司

<120> 甘露聚糖酶在发酵酒精中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 362

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu

20 25 30

Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr

35 40 45

Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro

65 70 75 80

Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr

85 90 95

Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser

100 105 110

Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr

115 120 125

Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr

145 150 155 160

Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala

165 170 175

Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp

180 185 190

Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys

195 200 205

Gly Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly

210 215 220

Leu Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly

225 230 235 240

Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr

245 250 255

Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn

260 265 270

Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro

275 280 285

Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu

290 295 300

Gly Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp

305 310 315 320

Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp

325 330 335

Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val

340 345 350

Thr Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala

355 360

Claims

1.一种高淀粉含量原料发酵生产酒精的方法，所述方法包括高淀粉含量原料在适于酒精发酵的条件下发酵生产酒精，其特征在于，在生产过程中存在和/或添加具有与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列至少95％一致性的甘露聚糖酶活性的多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，所述甘露聚糖酶活性的多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述甘露聚糖酶活性的多肽的添加量为0.1-20U/gDS，优选为1-10U/g DS，更优选为10U/g DS。

4.根据权利要求1-3任一项所述方法，所述适于酒精发酵的条件下发酵生产酒精包括如下步骤：

(a)加入淀粉酶使高淀粉含量原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的原料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入发酵生物进行发酵；

(d)收获发酵液。

5.根据权利要求4所述的方法，所述步骤(b)和步骤(c)顺序地进行或步骤(b)和步骤(c)同时进行；优选为步骤(b)和步骤(c)同时进行。

6.根据权利要求4或5所述的方法，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为0.1～200U/g DS，优选为1～100U/g DS，更优选10-100U/g DS。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，所述步骤(a)中高淀粉含量原料的料液比为1:1-1:10，优选地料液比为1:3-1:4；所述液化作用在pH4-7范围内进行，优选在pH4.5-6范围内，和在温度80℃-120℃，优选地约85℃下进行液化。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，所述步骤(b)中包括加入糖化酶，所述糖化酶的加入量为10-1000U/g DS，优选为20-600U/g DS，更优选为50-500U/g DS。

9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，所述步骤(c)中发酵生物是酵母，进一步，所述步骤(c)还包括加入氮源。

10.根据权利要求9所述的方法，所述步骤(c)中酵母加入量为0.01％-0.3％，优选为0.05％-0.2％，更优选为0.1％；所述氮源为尿素，加入量为0-1000ppm，优选为600ppm。

11.根据权利要求4-10任一项所述的方法，所述存在和/或添加甘露聚糖酶活性多肽的生产步骤选自：

高淀粉含量原料的液化步骤(a)；

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵步骤；或

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，所述步骤(a)加入0.1～200U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同时进行，将原料液化液调节pH 3.0-6.0，添加20-600U/g DS糖化酶、0.05％-0.2％活性酵母、600ppm氮源尿素以及1-10U/g DS甘露聚糖酶，在20℃-35℃，发酵48-96h。

13.根据权利要求11或12所述的方法，所述步骤(a)加入1～100U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同时进行，原料液化液调节pH4.3，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性干酵母、600ppm氮源尿素以及10U/g DS甘露聚糖酶，在32℃，发酵72h。

14.一种高淀粉含量原料发酵生产酒精的方法，所述发酵步骤包括：

(a)加入淀粉酶使高淀粉含量原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的原料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入酵母进行发酵；

(d)收获发酵液；

高淀粉含量原料的液化步骤(a)

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵；

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤；

其中，所述甘露聚糖酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

15.根据权利要求14所述的方法，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶；所述步骤(b)中加入糖化酶；所述步骤(c)中加入氮源尿素。

16.根据权利要求15所述的方法，所述步骤(a)加入0.1～200U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同时进行，将原料液化液调节pH 3.0-6.0，添加20-600U/g DS糖化酶、0.05％-0.2％活性酵母、600ppm氮源尿素以及1-10U/g DS甘露聚糖酶，在20℃-35℃，发酵48-96h。

17.根据权利要求15所述的方法，所述步骤(a)加入1～100U/g DS高温淀粉酶对高淀粉含量原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同时进行，原料液化液调节pH4.3，添加50-500U/gDS糖化酶、0.1％活性干酵母、600ppm氮源尿素以及10U/g DS甘露聚糖酶，在32℃，发酵72h。