CN111321098A

CN111321098A - 一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN111321098A
Application number: CN201811542774.1A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 吴桐; 张海波; 张鸽; 李兴; 王帆
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CN111321098B

Abstract

本发明公开了一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该基因工程菌是以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB。本发明还提供了该大肠杆菌基因工程菌的构建方法和其在构建产桧烯基因工程菌和发酵生产桧烯中的应用。本发明不仅在一定程度上能够解决当前大肠杆菌对桧烯耐受性差的问题，打破了桧烯的积累对菌体生长造成的限制，而且为提升桧烯产量提供了新的思路，新的方法。

Description

一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

桧烯是一种重要的化工原料，可作为先进生物燃料前体、制备调味品、香水添加剂、精细化学品和药物等。桧烯作为双环萜烯，密度达到0.89g/mL，而以链烷烃为主的航空煤油密度为0.78g/mL，而含大量环烷烃的火箭煤油密度则增加至0.83g/mL。飞行器的性能，例如航程、航速和载荷等，在很大程度上取决于燃料燃烧所释放的热量。因此，提高燃料的能量(或体积热值)是低成本提高航天航空飞行器的推进性能的重要方式。已知生产桧烯的方法主要是通过自然界植物精油的萃取，但这些方法需要高温、高压和复杂的贵重金属催化剂才能实现，不仅投资大、分离提纯困难，还会造成严重的环境污染。微生物合成是一种很有前途的合成桧烯的途径。在目前的研究中，研究人员已能指出桧烯的一般合成途径。

桧烯是由异戊二烯单元合成的。该途径的关键中间体是两种常见的C₅前体，异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP可由甲羟戊酸(MVA)途径或甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径产生。这种C₅骨架将会合成C₁₀的牻牛儿基二磷酸(GPP)，而GPP是桧烯合成的直接前体。在使用葡萄糖作为一般碳源的桧烯代谢途径中是重要的中间产物。

目前，两相发酵可用于通过从培养物中捕获产物来减轻桧烯对微生物的毒性。但是现在尚无成熟的桧烯工业发酵的技术，而且在实际发酵过程中，细胞生长受到底物和多种产物的协同抑制作用，这些方法并不能从根本上解决多种产物积累对细胞的毒害作用和对桧烯生产所带来的巨大负面影响。J.D.Keasling等人在工程大肠杆菌中异源表达了43个有机溶剂泵出蛋白，发现该类蛋白能够提高工程大肠杆菌对绝大多数有机溶剂的耐受性。甘油磷酸相关转运相关蛋白glpC的过表达也能够提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性。尽管上述工作都对大肠杆菌的有机溶剂耐受性有较大帮助，但没有从根本上解决微生物对有机溶剂耐受性的难题。综上，如何打破桧烯的积累对菌体生长造成的限制，解决当前大肠杆菌对桧烯耐受性差的问题以及如何解决桧烯产量低的问题是亟待解决的。

发明内容

为解决现有大肠杆菌对于桧烯的耐受性差的问题，本发明提供了一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，该基因工程菌以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB；其中：所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的GenBank序列登录号为ABJ00363.1；所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的GenBank序列登录号为AVJ11102.1。

优选地，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

本发明提供了一种上述具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的重组质粒；

2)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；

3)构建同时含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；

4)将步骤1至步骤3获得的三个重组质粒导入大肠杆菌中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。

优选地，包括如下步骤：

1)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabA连接到质粒pTrcHis-2B上，得到重组质粒pHB1；

2)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabB连接到质粒pTrcHis-2B上，得到重组质粒pHB2；

3)将不饱和脂肪酸合成酶基因fabB连接到重组质粒pHB1上或不饱和脂肪酸合成酶基因fabA连接到将重组质粒pHB2上，得到重组质粒pHB3；

4)将重组质粒pHB1、重组质粒pHB2和重组质粒pHB3导入E.coli BL21(DE3)中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。

更优选地，所述构建方法包括如下步骤：

1)从大肠杆菌中扩增获得不饱和脂肪酸合成酶基因fabA，对该片段进行Bam HI酶和Hind III酶双酶切处理，并将质粒pTrcHis-2B进行同样的双酶切处理，然后用T4连接酶连接，得到重组质粒pHB1；

2)从大肠杆菌中扩增获得不饱和脂肪酸合成酶基因fabB，对该片段进行Bam HI酶和Kpn I酶双酶切处理，并将质粒pTrcHis-2B进行同样的双酶切处理，然后用T4连接酶连接，得到重组质粒pHB2；

3)将重组质粒pHB1和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB进行Xba I和Sal I双酶切处理，然后用T4连接酶连接，或者是将重组质粒pHB2和不饱和脂肪酸合成酶基因fabA进行BamHI酶和Kpn I酶双酶切处理，然后用T4连接酶连接，可得到重组质粒pHB3；

优选地，步骤1)所述扩增所用的引物对如SEQ ID NO.1-2所示。

优选地，步骤2)所述扩增所用的引物对如SEQ ID NO.3-4所示。

本发明还提供了上述具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌在构建产桧烯基因工程菌中的应用。

本发明还提供了上述具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌在发酵生产桧烯中的应用。

在本发明所述的重组大肠杆菌构建方法中，相关质粒的构建以及感受态细胞的转化方法不受限制，可以采用本领域中已知的常规方法，即利用热激转化法将单个或两个重组质粒转移大肠杆菌感受态细胞中，采用抗生素筛选平板对阳性转化子进行筛选。

本发明有益效果：

有机溶剂与宿主细胞接触后，有机溶剂首先进入细胞膜，以细胞膜的磷脂双分子层结构为有机溶剂毒性作用的主要靶点，结合在细胞膜的磷脂双分子层上，对细胞开始起毒害作用。本发明首次以通过调节细胞膜组分的方式来增加大肠杆菌对桧烯的耐受性，具体是通过在大肠杆菌中过表达来自于大肠杆菌的内源基因不饱和脂肪酸合成酶基因fabA、fabB，过表达该两种基因可以使得细胞膜组分由饱和脂肪酸占多数转向不饱和脂肪酸比例增加，进而实现对大肠杆菌细胞膜组分调节，使得大肠杆菌细胞膜中的不饱和脂肪酸的含量得到提升、改变了细胞膜的脂肪酸比例分配，这种分子特性可以使得细胞膜变柔，韧性增加，使得大肠杆菌对桧烯的耐受性得到了明显提升，解决了当前大肠杆菌对桧烯耐受性差的问题。

本发明构建的大肠杆菌基因工程菌可耐受最高3g/L的桧烯，并且在2g/L和3g/L桧烯胁迫的条件下，对比野生型提高了3倍以上，打破了桧烯的积累对菌体生长造成的限制，为提升桧烯产量提供了新的思路，新的方法。

使用本发明名改造后的大肠杆菌基因工程菌生产桧烯可以使得桧烯产量得到提升，在过表达两种细胞膜脂肪酸调节基因后，利用MEP和MEP+MVA途径的产量都有所提升，达到了原产量的200％左右。

附图说明

图1为过表达fabA基因的pHB1质粒图谱。

图2为过表达fabB基因的pHB2质粒图谱。

图3为过表达fabA+fabB基因的pHB3质粒图谱。

图4为E.coli BL21(DE3)在不同浓度桧烯胁迫下的生长曲线；图中A为E.coliBL21(DE3)过表达fabA基因；B为E.coli BL21(DE3)过表达了fabB基因；C为E.coli BL21(DE3)过表达了fabA+fabB基因；D为野生型E.coli BL21(DE3)的生长曲线。

图5为桧烯产量对比图；图中A为利用MEP途径生产桧烯，对照组和分别过表达了fabA、fabB、fabA和fabB基因的四株菌株的桧烯产量；B为利用MEP+MVA途径生产桧烯，对照组和分别过表达了fabA、fabB、fabA和fabB基因的四株菌株的桧烯产量。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

以下实施例中，菌株E.coli BL21(DE3)和E.coli DH-5α购买自Invitrogen公司。其中限制性内切酶和T4DNA连接酶是从Takara试剂公司购买的。rTaq DNA聚合酶是从Takara购买的。用Bio-Rad的rTaqDNA聚合酶进行PCR。寡核苷酸引物购自北京基因组研究所(BGI)。纯化、凝胶回收等试剂盒均购自欧米伽试剂公司。饱和脂肪酸合酶(fabA)基因来源于大肠杆菌(K-12系列)，GenBank序列登录号为ABJ00363.1。鉴于E.coli BL21(DE3)是K-12系列诱变种，其基因组保持有较高的同源性，NCBI中没有对应E.coli BL21(DE3)单独的基因库。所以fabA、fabB两组基因设计引物时使用的E.coli K-12系列的引物，并且它们翻译出来的蛋白质保持一级结构一致。因此，K-12系列基因组是作为研究E.coli BL21(DE3)的一种工具，用来设计引物和蛋白质序列查询。本实验真正的目的是利用和改造E.coli BL21(DE3)菌株。

实施例1

本实施例提供了一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，该基因工程菌是以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB；其中：所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的GenBank序列登录号为ABJ00363.1；所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的GenBank序列登录号为AVJ11102.1。该基因工程菌按照如下方法构建：

使用由BGI合成的一对引物fabA-F和fabA-R(具体核苷酸序列见表1和SEQ IDNO.1-2所示)和BL21(DE3)野生型的破壁菌液作为模板扩增，之后用Bam HI和HindⅢ限制性内切酶处理，具体步骤参照《分子克隆实验指南第三版》，并使用纯化试剂盒纯化后用T4连接酶将其连接到同用Bam HI和HindⅢ克隆位点T7-启动子下的线性化载体pTrcHis-2B中，构建得到重组质粒pHB1。

然后，将大肠杆菌不饱和脂肪酸合成酶基因(fabB)利用引物对fabB-F和fabB-R扩增(具体核苷酸序列见表1和SEQ ID NO.3-4所示)，对该片段进行Bam HI和Kpn I双酶切处理，并将质粒pTrcHis-2B进行同样的双酶切处理，然后用T4连接酶连接入线性化载体pTrcHis2B的Bam HI和KpnⅠ位点(分子克隆实验指南第三版)，构建重组质粒pHB 2。

然后将fabB基因和pHB 1载体用Xba I和Sal I酶切处理，之后用T4连接酶连接，构建重组质粒pHB 3。此步骤也可以采用“将重组质粒pHB2和不饱和脂肪酸合成酶基因fabA进行Bam HI酶和Kpn I酶双酶切处理，然后用T4连接酶连接”来构建重组质粒pHB3，同样可以构建出具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌。

将重组质粒pHB1、重组质粒pHB2和重组质粒pHB3转化入E.coli BL21(DE3)中，得到具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌HB3。

转化步骤按照一般实验流程《分子克隆实验指南第三版》。在构建过程中所用的fabA-F、fabA-R、fabB-F和fabB-R的具体核苷酸序列如表1所示。

表1引物序列

通过如下实验说明本发明所能取得的有益效果：

1、通过外部添加桧烯检验菌体耐受性

本实验分别通过将pHB1转化入E.coli BL21(DE3)中构建过表达fabA基因的基因工程菌HB1、通过将pHB2转化入E.coli BL21(DE3)中构建过表达fabB基因的基因工程菌HB2，并将上述基因改造菌株HB1、HB2和野生型E.coli BL21(DE3)作为实施例1构建的基因工程菌HB3的对照组，将上述全部菌株分别在添加了不同浓度(1g/L、2g/L、3g/L)的桧烯进行连续培养，培养方法为：首先将HB1、HB2、HB3和野生型E.coli BL21(DE3)分别按照1％的接种量接种至3mL LB液体培养基中进行预培养，预培养过程中HB1、HB2、HB3中加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林抗生素，在37℃和180rpm条件下孵育以筛选或维持质粒；第二天，将预培养的种子液转入终浓度为100μg/mL的氨苄西林抗生素的50mL LB液体培养基，在培养至约2h时加入浓度为0.5mM的异丙基β-D-1-硫代氨基葡萄糖苷(IPTG)诱导培养，然后将瓶子密封。用180rpm摇床培养，温度为30℃，加入不同浓度的工业用桧烯sabinene(1.0g/L；2.0g/L；3.0g/L)。实验分三组进行。同时，用分光度计(Cary 50UV-Vis，Varian)分别在培养2h、9h、11h、13h、15h、17h、19h、21h和23h测定培养样品在OD₆₀₀(600nm处的光密度)下的光吸收值，监测细菌的生长情况。所绘制生长曲线如图4所示。

由图4可知：A为fabA过表达对不同浓度桧烯耐受性示意图；B为fabB过表达对菌株耐受性的影响；C为fabA、fabB过表达对菌株耐受性的影响；D为野生型菌株对桧烯的耐受性生长曲线。由ACD对比可看出过表达fabA基因后，可以明显的看出在高浓度桧烯(2g/L，3g/L)胁迫下，过表达了fabA或fabA+fabB的菌株可以提前进入对数生长期，而野生型菌株在高浓度桧烯(2g/L，3g/L)胁迫下生长迟滞严重，对数生长期推迟。

2、桧烯发酵检测

桧烯在自然界有两种合成途径，分别是MEP和MVA途径。后者大多出现在植物体中。为了对比MEP途径和MVA途径产量的不同，将MVA途径的下游基因，包括基因和启动子，在pstS和glmS基因之间的位点被整合到大肠杆菌BL 21(DE3)的染色体上。编码MK(甲丙戊酸激酶)、PMK(磷酸戊酸激酶)、PMD(甲丙戊酸焦磷酸脱羧酶)、IDI(IPP异构酶)的四种基因，分别编码MK、PMD、IDI四种酶。由北京基因组研究所化学合成了噬菌体(lambde)修饰的PL(PL*)启动子。利用λRed重组系统，建立了大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，glmS-pstS::PL*MK_MMPMK_SCPMD_SCIDI_SC菌株，命名为HB11。基因敲除菌株和突变菌株的构建是决定其功能的重要步骤。基因重组是指一个核酸分子被断裂，然后连接到一个不同的DNA分子上的过程。获得突变体的方法有cre重组酶、噬菌体λ裂解酶、Red重组酶等(方法见文章1)。本研究采用噬菌体λ裂解法构建突变体。用卡那霉素的抗生素和引物(Kan-F和Kan-R)对进突变结果行检测。在构建过程中所用的Kan-F，Kan-R，glmS-F，glmS-R，pstS-F，pstS-R，PL*-F，MK-F，MK-R，PMK-F，PMK-R，PMD-F，PMD-R，IDI-F和IDI-R的具体核苷酸序列如表1所示。

MEP途径：HB4(桧烯合酶GPPS2-SabS1)、HB5(过表达fabA和桧烯合酶GPPS2-SabS1)、HB6(过表达fabB和桧烯合酶GPPS2-SabS1)、HB7(过表达fabA，fabB和桧烯合酶GPPS2-SabS1)。

MEP+MVA途径：HB12(过表达MVA途径mvaE-mvaS和桧烯合酶GPPS2-SabS1)、HB13(过表达fabA，MVA途径mvaE-mvaS-和桧烯合酶GPPS2-SabS1)、HB14(过表达fabB，MVA途径mvaE-mvaS-和桧烯合酶GPPS2-SabS1)、HB15(过表达fabA，fabB，MVA途径mvaE-mvaS-和桧烯合酶GPPS2-SabS1)。

通过转化pHB1，pHB2，pHB3种质粒到不同菌株中得到如下菌株：HB4、HB5、HB6、HB7和HB12、HB13、HB14、HB15。转化步骤按照一般实验流程《分子克隆实验指南第三版》。pHB11是利用(Effect of Genomic Integration Location on Heterologous ProteinExpression and Metabolic Engineering in E.coli,2017文章中的方法将E.coliBL21(DE3)的基因组中整合glmS-pstS::PL*MK_MMPMK_SCPMD_SCIDI_SC。所有的菌株和质粒和其特点列在表2中。

表2

表2中(Zhang et al，2014)为Microbial production of sabinene--a newterpene-based precursor f advanced biofuel.Microbial cell factories。

HB11的构建方法参照Use of the lambda Red recombinase system to rapidlygenerate mutants in Pseudomonas aeruginosa.BMC molecular biology。

用气相色谱法定量比较了HB4、HB5、HB6、HB7和HB12、HB13、HB14、HB15分别在MEP(图5A)途径和MVA(图5B)途径中的桧烯产量。在MEP途径中，工程菌(HB5，HB6，HB7)和对照组(HB4)在3mL LB液体培养基中进行预培养，在37℃和180rpm条件下，在必要时与抗生素(氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL)共同孵育，以筛选或维持质粒。第二天，将优化浓度的预培养转入含适当抗生素的LB液体培养基50mL，培养至约2h时OD₆₀₀＝0.6-0.9时加入终浓度为0.5mM的异丙基β-D-1-硫代氨基葡萄糖苷(IPTG)。然后将瓶子密封，在30℃下培养，转速为180rpm。24小时后，从顶空采集尾气样品，用气相色谱法进行检测。MVA通路除工程菌(HB13、HB14、HB15)和对照组(HB12)外，其余操作步骤与MEP通路相同。在Agilent 7890A上进行了气相色谱分析，该仪器配有火焰离子化检测器(FID)。采用HPINNOWAX色谱柱(25m×250μm×0.2μm)分离sabinene。以N2为载气，线性速度为1mL/min。烘箱温度最初在50℃保温1min，5℃/min上升到100℃-250℃，最后在250℃保温5min。注射器和检测器的温度分别为250℃和260℃。记录峰面积。在桧烯浓度标准曲线上找出对应值，做产量对比图(图5)。

从图5中可以看出在过表达两种细胞膜脂肪酸调节基因后，利用MEP和MEP+MVA途径的产量都有所提升，都达到了原产量的200％左右，由此可以证明通过本发明对细胞膜调控的方法对大肠杆菌进行改造来提升大肠杆菌产量是有效的。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

<130> 1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> fabA-F

<400> 1

cgcggatcct gtagataaac gcgaat 26

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> fabA-R

<400> 2

cccaagcttt cagaaggcag acgtatcc 28

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> fabB-F

<400> 3

cgcggatcct aaacgtgcag tgattactg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> fabB-R

<400> 4

cggggtacct taatctttca gcttgcgca 29

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Kan-F

<400> 5

atgaacatga atggacctat tcacg 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Kan-R

<400> 6

ttaaaatggg attcgttgtg agttcat 27

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> glmS-F

<400> 7

agctttgttt aaacgctacg tacccaatcg cgctggaagg c 41

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> glmS-R

<400> 8

ggaccatggc taattcccat gaaaaatttt cattctgtga cag 43

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> pstS-F

<400> 9

gcgggccctg tcatctcttc gttattaatg 30

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> pstS-R

<400> 10

gcgggcccgc tacgtagatg tcgccgaggg ttttac 36

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> PL*-F

<400> 11

ccgctcgaga attcatataa aaaacataca gataaccatc tgcggtg 47

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> PL*-R

<400> 12

gtttttttac ctcctttgca c 21

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> MK-F

<400> 13

tgcaaaggag gtaaaaaaac atggtatcct gttctgcgcc 40

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> MK-R

<400> 14

gtgcaggcct atcgcaaatt agcttaatct actttcagac cttgctcg 48

<210> 15

<211> 65

<212> DNA

<213> PMK-F

<400> 15

gctaatttgc gataggcctg cacccttaag gaggaaaaaa acatgtcaga gttgagagcc 60

ttcag 65

<210> 16

<211> 70

<212> DNA

<213> PMK-R

<400> 16

ttttttttcc tccttaaggg cgaattctgc atgcagctac cttaagttat ttatcaagat 60

aagtttccgg 70

<210> 17

<211> 68

<212> DNA

<213> PMD-F

<400> 17

cttaaggtag ctgcatgcag aattcgccct taaggaggaa aaaaaaatga ccgtttacac 60

agcatccg 68

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> PMD-R

<400> 18

ttttttttac ctcctaaggg cgatgcagcg aattgatctt attcctttgc tagaccagtc 60

<210> 19

<211> 63

<212> DNA

<213> IDI-F

<400> 19

gatcaattcg ctgcatcgcc cttaggaggt aaaaaaaaat gactgccgac aacaatagta 60

tgc 63

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> IDI-R

<400> 20

gcgggccctt atagcattct atgaatttgc c 31

Claims

1.一种具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中过表达不饱和脂肪酸合成酶基因fabA和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB；其中：所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的GenBank序列登录号为ABJ00363.1；所述不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的GenBank序列登录号为AVJ11102.1。

2.根据权利要求1所述的具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

3.一种如权利要求1所述的具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabA的重组质粒；

2)构建含有不饱和脂肪酸合成酶基因fabB的重组质粒；

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)从大肠杆菌中扩增获得不饱和脂肪酸合成酶基因fabB，对该片段进行Bam HI和KpnI双酶切处理，并将质粒pTrcHis-2B进行同样的双酶切处理，然后用T4连接酶连接，得到重组质粒pHB2；

3)将重组质粒pHB1和不饱和脂肪酸合成酶基因fabB进行Xba I和Sal I双酶切处理，然后用T4连接酶连接，或者是将重组质粒pHB2和不饱和脂肪酸合成酶基因fabA进行Bam HI酶和Kpn I酶双酶切处理，然后用T4连接酶连接，得到重组质粒pHB3；

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述扩增所用的引物对如SEQID NO.1-2所示。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述扩增所用的引物对如SEQID NO.3-4所示。

8.如权利要求1或2所述的具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌在构建产桧烯基因工程菌中的应用。

9.如权利要求1或2所述的具有桧烯高耐受能力的大肠杆菌基因工程菌在发酵生产桧烯中的应用。