CN111321092A

CN111321092A - (r,s)-2,4-滴丙酸降解菌株及特异性降解其(s)-型异构体的双加氧酶基因

Info

Publication number: CN111321092A
Application number: CN202010095006.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋建东; 张龙; 陈凯; 胡顺利
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2040-02-17
Also published as: CN111321092B

Abstract

本发明公开了(R,S)‑2,4‑滴丙酸降解菌株及特异性降解其(S)‑型异构体的双加氧酶基因。一株(R,S)‑DCPP降解菌株Sphingopyxis sp.DBS4，菌种保藏号为CCTCC M 20191082。特异性降解(S)‑DCPP的双加氧酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。利用该基因构建的工程菌株能高效表达特异性降解(S)‑DCPP的双加氧酶，同时对苯氧羧酸类除草剂2,4‑D和(S)‑MCPP均有明显的降解效果。生产的酶制剂可用于(S)‑DCPP，2,4‑D及(S)‑MCPP等苯氧羧酸类除草剂残留的去除，也可用于手性苯氧羧酸类除草剂旋光异构体手性拆分。

Description

(R,S)-2,4-滴丙酸降解菌株及特异性降解其(S)-型异构体的双加氧酶基因

技术领域

本发明属于应用环境污染修复以及手性农药的酶学拆分领域，涉及(R,S)-2,4-滴丙酸降解菌株及特异性降解其(S)-型异构体的双加氧酶基因。

背景技术

我国目前正在使用的农药中具有手性结构的农药(手性农药)约占40％。与此同时，随着农药品种的不断发展，农药类手性化合物的数量显著增加。除草剂的使用量虽已居各大农用化合物之首，但相对于杀虫剂等其他手性农药，对除草剂手性(手性除草剂)问题的研究却相对较少。手性除草剂的使用虽然提高了农业的生产效率，但同时带来严重的环境问题。研究表明，具有手性结构的除草剂在药效、环境安全性等方面存在不可忽视的对映异构体差异。虽然手性化合物的对映异构体具有相同的理化性质，但其异构体间却可能具有不同的生物活性和生态毒理；而生物体对化合物的吸收、生物转化和新陈代谢等也可能存在立体选择性。手性化合物的不彻底认识已给人类带来了惨痛的教训(如沙利度胺)。由于大多数手性除草剂至今仍是以外消旋体(具有旋光性的手性分子与其对映体的等摩尔混合物)形式生产和施用，不可避免地导致手性除草剂的不同异构体同时进入到生物体、土壤和水体等环境体系中。

苯氧羧酸类除草剂是α-C结构带有取代基的羧酸类化合物，由于其成本低、速度快等优势被大规模生产和使用，是目前世界使用量第二的选择性除草剂，更是位居阔叶类杂草除草剂使用量榜首。2,4-滴丙酸(DCPP)是全世界广泛使用的典型苯氧羧酸类手性除草剂之一。DCPP的除草活性和生长激素药效几乎全部集中于R-型异构体[(R)-DCPP]，S-型异构体[(S)-DCPP]不具有除草活性且具有轻微地抗生长素活性。DCPP属于苗后除草剂，主要通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的合成，致使脂肪酸的合成停止，细胞的生长、分裂不能正常进行，从而抑制杂草生长。DCPP具有潜在的致癌和致突变性，其挥发性弱，可溶性大，且难以生物降解和直接光解，环境残留率较高。DCPP经施用后，只有少部分能被植物体吸收，其他大部分都会直接或间接进入到周边土壤中，由于其水溶性较大，易从土壤中随雨水或灌溉水进入水体环境。因此，对水生环境危害极大。许多国家都在地表水和地下水中检出DCPP含量超过规定的最大残留量。目前，虽然已经有商品化的(R)-DCPP出售，但出于成本的考虑，DCPP仍主要以外消旋体(R,S)-DCPP的形式施用。此外，DCPP的结构是不稳定的，在一定条件下它的对映体之间会发生相互转化。在单一活性对映体单体施用之后，还没完全发挥药效之前，可能已经外消旋化了。与此同时，(S)-型异构体虽然没有除草活性，但其对非靶标生物可能有更大的毒性。因此，DCPP的残留已经成为生态环境保护急需解决的问题。微生物修复除草剂污染的方法是一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比化学方法、物理方法修复农药污染具有更多优势。微生物修复除草剂残留污染的本质是微生物产生的酶对除草剂的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除除草剂残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。手性除草剂DCPP降解酶基因的获得在苯氧羧酸类除草剂污染的修复领域，甚至是DCPP不同手性异构体的拆分方面都有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供能同时降解手性除草剂(R,S)-DCPP两种异构体的降解菌株。

本发明的另一目的是提供从该降解菌株中克隆到的特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因。

本发明的又一目的是提供该菌株、基因或基因编码蛋白的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株(R,S)-DCPP降解菌DBS4,分类命名为Sphingopyxis sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 20191082，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址为中国-武汉，武汉大学。

由本发明所述的(R,S)-DCPP降解菌制备的菌剂。

本发明所述的降解菌或所述的菌剂在降解手性除草剂的外消旋体(R,S)-DCPP或其两种手性异构单体(R)-DCPP和(S)-DCPP中的应用。

特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为891bp，G+C含量为59.3％，编码296个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

本发明所述的双加氧酶基因编码的双加氧酶蛋白质，氨基酸序列为：SEQ IDNO.2。

含所述的双加氧酶基因的重组质粒。

作为本发明的一种优选方式，双加氧酶基因片段与酶切好的pET-28a(+)进行酶连，获得含有特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因的pET-28a(+)重组质粒。

含本发明所述的重组质粒的基因工程菌。

所述的基因工程菌为含本发明所述的重组质粒的重组微生物E.coli BL21(DE3)。

本发明所述的双加氧酶基因在降解土壤、水体或农作物的苯氧羧酸类除草剂残留方面的应用；优选在去除土壤、水体或农作物中的(S)-DCPP，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)及(S)-2-甲基-4-氯苯氧丙酸[(S)-MCPP]残留方面的基因工程应用。

本发明所述的双加氧酶基因在抗(S)-DCPP，2,4-D及(S)-MCPP苯氧羧酸类除草剂转基因作物培育中的应用。

本发明所述的双加氧酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的(S)-DCPP，2,4-D及(S)-MCPP苯氧羧酸类除草剂残留方面和/或在手性拆分(R,S)-DCPP的旋光异构体获得(R)-DCPP中的应用。

有益效果

1.本发明利用细菌全基因组测序技术结合野生菌株蛋白纯化技术成功的从菌株DBS4(CCTCC M 20191082)中克隆出特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因。

2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为891bp，G+C含量为59.3％，编码296个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含NdeⅠ和HindⅢ酶切位点的完整的特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-28a(+)(购自Novegen公司)的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点上，转化至表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。本发明对特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的降解(S)-DCPP。

4.本发明对特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因的表达产物进行了底物谱研究，发现该双加氧酶可以降解大多数的苯氧羧酸类除草剂，包括2,4-D和(S)-MCPP等，为广谱的苯氧羧酸类除草剂双加氧酶。

5.利用该基因构建的工程菌株能高效表达特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的(S)-DCPP的降解或去除。甚至包括用于针对(R,S)-DCPP外消旋体中(R)-型异构体的拆分。

附图说明

图1菌株DBS4在固体培养基上的菌落图和电镜图。

图2菌株DBS4降解手性除草剂DCPP外消旋体[(R,S)-DCPP]、R-型异构体[(R)-DCPP]和S-型异构体[(S)-DCPP]的降解及菌株生长曲线。图A为菌株DBS4对(S)-DCPP的降解及菌株生长曲线，图B为菌株DBS4对(R,S)-DCPP的降解及菌株生长曲线；图C为菌株DBS4对(R)-DCPP的降解及菌株生长曲线。

图3菌株DBS4降解手性除草剂DCPP外消旋体不同时间点取样的液相检测图。

图4本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶蛋白质及其编码基因来源的菌株DBS4细胞粗酶的硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析蛋白电泳图。图A为硫酸铵分级沉淀后不同梯度的蛋白电泳图。图B为阴离子交换层析后不同盐离子梯度的蛋白电泳图。

图5LC-MS/MS鉴定到的特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶。

图6本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因功能验证的策略图。

图7本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因在E.coli DH5α(pBBR1-MCS2)中表达的细胞粗酶降解(S)-DCPP的高效液相色谱检测图。

图8本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因在E.coli DH5α(pBBR1-MCS2)中表达的细胞粗酶降解(R)-DCPP的高效液相色谱检测图。

图9本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因在E.coli BL21(pET-28a(+))中高效表达实验方案图。

图10本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因在表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)中表达的并纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳图。

图11本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶蛋白质在标准酶活体系中降解(S)-DCPP的高效液相色谱图和质谱检测图。

图12本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶蛋白质的最适反应温度的研究结果图。

图13本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶蛋白质的最适反应pH值的研究结果图。

图14金属离子对本发明特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶蛋白质酶活影响的研究结果图。

生物材料保藏信息

DBS4，分类命名为Sphingopyxis sp.DBS4，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 20191082，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址为中国-武汉，武汉大学。

具体实施方式

实施例1菌株DBS4降解(R,S)-DCPP的效果评估和代谢产物分析

1.1种子液制备

将菌株DBS4(CCTCC M 20191082)(图1)接入含30mg L^-1(R,S)-DCPP的100mL LB培养基中，30℃、160rpm摇床培养，48h后6,000rpm离心收集菌体，使用灭菌的MM洗涤菌体两次，最后用10mL MM重悬，作为种子液备用。

1.2菌株DBS4对手性除草剂(R,S)-DCPP外消旋体及其两种异构单体的降解

将菌株DBS4种子液按5％的接种量分别接至含有30mg L^-1(R,S)-DCPP，(R)-DCPP和(S)-DCPP的100mL MM中，30℃、160rpm摇床培养。每隔12h，取3mL培养液，加入25％的盐酸，将pH调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2mL二氯甲烷相吹干，然后0.5mL甲醇复溶，用滤膜(孔径0.22μm)过滤，采用高效液相色谱进行检测。液相色谱检测条件：仪器，Shimadzu LC-20A(Shimadzu corporation)；手性色谱柱，Superchiral S-AS(Chiralway Biotech Co.,ltd.),0.46cm I.D.*15cm Length,5μm；柱温设定为25℃；流动相，正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝96:04:0.05(v/v/v)，流速设定为0.8mL min^-1；紫外检测器检测波长，220nm和235nm；进样量，6μL。根据标曲的锋面积计算含量。

实验结果表明，所述菌株DBS4能够完全降解手性除草剂的外消旋体(R,S)-DCPP及其两种手性异构单体(R)-DCPP和(S)-DCPP(图2)，培养72h后，所述菌株DBS4对(R,S)-DCPP的降解率高达90％以上。HPLC检测48h的取样结果表明，(R,S)-DCPP被降解为中间产物2,4-二氯苯酚(图3)。

实施例2特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因的克隆

2.1细菌基因组总DNA的提取

保藏号为CCTCC M 20191082的菌株DBS4(Sphingopyxis sp.DBS4)为分离自苯氧羧酸类除草剂污染土壤的(R,S)-DCPP高效降解菌株。大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的Sphingopyxis sp.DBS4的基因组总DNA，溶于TE(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

2.2细菌基因组完成图测序

将检测合格的Sphingopyxis sp.DBS4基因组DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司进行细菌全基因组完成图测序。基因组测序结果表明，所述菌株Sphingopyxissp.DBS4的基因组由一个染色体DNA和四个环状质粒DNA组成。其中，染色体基因(Chr.)大小为4,357,663bp；质粒1(pDB1)大小为200,350bp；质粒2(pDB2)大小为227,036bp；质粒3(pDB3)大小为36,803bp；质粒4(pDB4)大小为84,199bp。通过de novo一共预测出4869个开放阅读框(ORF)。

2.3测序结果分析

根据细菌全基因组草图扫描结果，结合已经报道的苯氧羧酸类除草剂降解相关基因，运用生物学软件OMIGA3.0与菌株DBS4全基因组序列进行本地比对分析，获得负责苯氧羧酸类除草剂降解基因的疑似序列。

2.4野生菌株DBS4细胞粗酶的分级纯化

2.4.1硫酸铵分级沉淀

首先在研钵中将硫酸铵颗粒研磨至面粉颗粒级别的粉末状，放入烘箱烘干水分。然后将菌株DBS4的细胞进行超声破碎，破碎后离心(12,000rpm,4℃)，上清液即为菌株DBS4的蛋白粗酶。将蛋白粗酶液倒入周围包裹碎冰块的小烧杯中，将小烧杯置于磁力搅拌器上并使转子不停搅拌粗酶液；最后分别收集≤30％、30-40％、40-50％、50-60％、≥60％这几个梯度的粗酶液。将所有梯度下收集到的粗酶液分别倒入透析袋，并置于20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，4℃过夜透析。然后，建立如下酶促反应体系：

35℃水浴反应30min，加入30μL HCl(25％)和等体积的二氯甲烷萃取终止反应。HPLC检测酶促反应效果，从而确定有降解(S)-DCPP酶活的梯度。然后结合SDS-PAGE电泳分析不同梯度中的蛋白浓度(图4A)，最后选取合适的硫酸铵沉淀梯度收集菌株DBS4的蛋白粗酶，准备进行阴离子交换层析。

2.4.2阴离子交换层析

阴离子柱填料为Q Sepharose Fast Flow，体积为1mL。具体的使用方法为：

1)平衡，首先用10mL 20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)充分洗涤阴离子交换柱；

2)上样，将上一步硫酸铵沉淀且透析后有酶活的粗酶液全部加入阴离子交换柱，然后收集穿过液；

3)梯度洗脱，依次用NaCl浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)冲洗阴离子交换柱，每一个梯度用6mL对应洗脱液冲洗并收集相应梯度的酶液；

4)清洗柱子，将梯度洗脱过后的阴离子交换柱用10mL 20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)充分洗净，4℃保存待用。

以上操作均在4℃条件下完成。

将收集到的所有不同梯度的粗酶液分别倒入透析袋中，并置于20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中4℃过夜透析。透析过后测定各个梯度的酶活(酶活测定体系及条件同2.4.1)，最后对有酶活的粗酶进行SDS-PAGE电泳(图4B)。然后根据已报道的(S)-DCPP起始降解关键酶的大小进行切胶，准备进行LC-MS/MS鉴定。

2.4.3LC-MS/MS蛋白鉴定

据已报道的目的蛋白的大小从SDS-PAGE电泳的凝胶上对应的位置切取目的蛋白条带。LC-MS/MS鉴定交由上海鹿明生物科技有限公司进行。数据处理采用Mascot 2.3软件(Matrix Science)进行，数据库为菌株DBS4的基因组测序结果数据。根据比对结果，确定菌株DBS4基因组中疑似的ORF(图5)，然后进行异源表达验证。

2.5疑似序列验证

将获得的特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因疑似序列定向克隆到广宿主载体pBBR1MCS-2上(图6)，以(S)-DCPP为底物，验证疑似序列是否有功能。

2.6疑似序列的PCR扩增

以正向引物F1:5’-ATACTCGAGGCTCACTATCTCAAAGACG-3’(SEQ ID NO.3)和反向引物R1:5’-ATTACTAGTGCATGGGGAACGAGCCTGT-3’(SEQ ID NO.4)为引物，用PCR从Sphingopyxis sp.DBS4基因组中扩增出特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因片段(SEQ IDNO.1)。

扩增体系：

PCR扩增程序：

2.7PCR产物及载体用Xho I和Spe I分步酶切。

酶切体系：

酶切产物用纯化回收试剂盒纯化回收。

酶连

建立如下反应体系:

4℃温育24小时。

2.8制备大肠杆菌DH5α高效感受态细胞

具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P 22-23。

2.9转化

取10μL酶连产物至100μL的感受态细胞中，混匀。具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P 23。细胞复苏后，涂布于含有50mg L^-1卡那霉素的LB平板，37℃培养16h后挑取阳性克隆子。

2.10验证阳性转化子表达的粗酶对(S)-DCPP的降解功能

将阳性转化子在LB培养基中培养OD₆₀₀至0.6-0.8之间，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清粗酶。以(S)-DCPP为底物建立粗酶的酶促反应体系(3mL)：

设置不加上清液及宿主菌中不含目的基因的空载为对照，35℃水浴反应30min，加入30μL HCl(25％)和等体积的二氯甲烷萃取终止反应。去除上清水相，用无水硫酸钠除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用高效液相色谱进行检测。液相色谱检测条件：仪器，Shimadzu LC-20A(Shimadzu corporation)；手性色谱柱，Superchiral S-AS(Chiralway Biotech Co.,ltd.),0.46cm I.D.*15cm Length,5μm；柱温设定为25℃；流动相，正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝96:04:0.05(v/v/v)，流速设定为0.8mL min^-1；紫外检测器检测波长，220nm和235nm；进样量，6μL。根据标曲的锋面积计算含量。

高效液相色谱检测结果显示，该阳性转化子表达的细胞粗酶能够将(S)-DCPP转化为2,4-二氯苯酚(图7)，而该细胞粗酶对(R)-DCPP无降解活性(图8)。因此，实验结果表明该核苷酸序列所编码的蛋白即为特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶。

实施例3特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因在大肠杆菌BL21[pET-28a(+)]中的高效表达及纯化

3.1特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因的PCR扩增

以正向引物F2:5’-CTACATATGGCTCACTATCTCAAAGACGA-3’(SEQ ID NO.5)和反向引物R2:5’-TACAAGCTTGATCGGTCGCGCGCCGACGC-3’(SEQ ID NO.6)为引物，用PCR从Sphingopyxis sp.DBS4基因组中扩增出特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因片段。

扩增体系：

同上2.6。

PCR扩增程序：

同上2.6。

3.2PCR产物及载体用Nde I和HindⅢ分步酶切。

酶切及酶连体系参考2.7及Nde I和HindⅢ限制性内切酶说明书。

3.3转化和表达

将酶连好的含有特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因(spoA)的pET-28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，涂布于含有50mg L^-1卡那霉素的平板，获得重组转化子E.coli BL21(DE3)(pET-28a-spoA)(图9)。

3.4阳性转化子表达的目的蛋白的纯化及其对(S)-DCPP降解功能的验证

将阳性转化子在LB培养基中培养至OD₆₀₀ 0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃低温诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。由于构建的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET-28a-spoA)经过IPTG诱导表达的SpoA蛋白N端和C端都带有6个组氨酸残基组成的标签，重组蛋白可以通过Ni²⁺-NTAResin(Novagen)进行洗脱纯化。详细纯化步骤及所需溶液见试剂盒内附说明书。纯化后进行蛋白透析(方法同野生菌蛋白的分级纯化部分)，最后进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度(图10)。蛋白操作均在层析柜(4℃)中进行，蛋白浓度的测定采用Bradford方法(Bradford,1976)，牛血清白蛋白作为标准蛋白质。以(S)-DCPP为底物建立纯酶的酶促反应体系(3mL)：

35℃水浴反应30min，加入30μL HCl(25％)和等体积的二氯甲烷萃取终止反应。去除上清水相，用无水硫酸钠除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用高效液相色谱进行检测。液相色谱检测条件同上2.10。

最后采用高效液相色谱串联质谱检测并鉴定代谢产物。MS分析使用ESI模式，检测器为Agilent G6410B Triple Quad Mass Spectrometer。

LC-MS(高效液相色谱和质谱联用)检测结果表明，所述的纯酶SpoA可以将(S)-DCPP转化为非手性的化合物2,4-二氯苯酚(图11)。

3.5SpoA的底物谱研究及其动力学参数测定

将阳性转化子在LB培养基中培养OD₆₀₀至0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃低温诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。按照3.4所述方法获得重组蛋白的纯酶，同时构建如3.4所述的酶促反应体系。向酶促反应体系中添加终浓度为30mg L^-1的供试底物。35℃水浴反应30min，加入30μL HCl(25％)和等体积的二氯甲烷萃取终止反应。通过设定不同底物的不同浓度梯度，测定在不同浓度下的酶促反应速率，采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)将米氏方程改写为1/V＝(K_m/V_max)×(1/[S])+1/V_max，并绘制酶动力学曲线，从而求出K_m、V_max和K_m/K_cat。

实验结果的检测方法同2.10。

实验结果表明，特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶可以将供试底物中的2,4-D和(S)-MCPP转化为其对应的苯酚化合物。其动力学参数见表下表1：

表1 SpoA对不同底物的酶动力学参数

3.6重组蛋白SpoA的酶学特性研究

根据上述方法获得重组蛋白SpoA的纯酶。将SpoA纯酶加入到酶活测定体系中，放置于不同温度梯度(10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃和60℃)条件下反应20min。在酶活体系中加入30μL HCl(25％)和等体积的二氯甲烷终止反应。HPLC检测(S)-DCPP的转化率，以35℃条件下的酶活力为100％，计算相对酶活。

将SpoA纯酶分别加入到不同pH缓冲范围的缓冲液中。包括50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0-6.2)、50mM咪唑缓冲液(pH 6.2-7.8)和50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-8.8)。30℃反应20min。在酶活体系中加入30μL HCl(25％)和等体积的二氯甲烷终止反应。HPLC检测(S)-DCPP的转化率。以50mM咪唑缓冲液pH 7.0条件下的酶活力为100％，计算相对酶活。

在最适反应pH条件下，向酶促反应体系中加入终浓度为0.1mM的常见金属离子(Ca²⁺,Fe²⁺,Co²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺和Cd²⁺)，在最适反应温度条件下反应20min。以添加0.1mM的Fe²⁺反应体系下的酶活力定义为100％，计算各实验组的相对酶活。

实验结果表明，SpoA的最适温度为35℃，最适pH为7.0(图12-13)。不同金属离子对SpoA酶活影响的实验结果。结果显示，在不添加任何金属离子的条件下，SpoA的相对酶活力低于10％。其他供试的金属离子均不能替代Fe²⁺的作用，对SpoA酶活力没有促进作用。相反Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺和Ni²⁺还会微弱的抑制SpoA的酶活(图14)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> (R, S)-2,4-滴丙酸降解菌株及特异性降解其(S)-型异构体的双加氧酶基因

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> Sphingopyxis sp.

<400> 1

atgccattcc aggtcaatca gctgcatccg atctttgcgg cagaaatgtt cggttgcgac 60

atcctcaagc cggtgacgga tgaaacgaga aatgccgtcg aagatgcgat ggccaaatat 120

gccgtgctgg ttatccgcga tcaggcggcc gcgagtgacg aggatcaggt ccgctttgct 180

aaggcattcg ggcccttgga gttgccgccc gatctcggca tgtcggagag gacgaggccg 240

acgcgcgtcc atccgaaact ctacgacgtg tcgaacttgg acgagaacgg caatctggac 300

aaacccgata cgctgcgccg caagttcgcc aagggcaacg agctcttcca tacggacagc 360

tcattcaatg acctgccgac caaatggtcg atgttgttgg cccacgtcgt cacgcccacg 420

gggggcaata ccgaatttgt cgatacacgg gcagcctatg atgcgctgtc gccttcgatg 480

aaggagcagg tcgaaccact gagcgtcatt cacagtctca cctactcgcg cgaaaggggt 540

ggcctcaccg gcacgactgt tttcgatcgc gcctttccgc cggtgacaca gccacttgta 600

cggacaagcg catcgggccg taaggctctc tatatcggcg cacacgccgc aaccgttgtc 660

ggcatggatg aggcggccgg gcggaccctg ctcgacaagt tggtctcgga tgccagccga 720

ccggagtata tatattcaca caaatggctg cccggcgacc tcgttatctg ggacaatcgc 780

tgcactatgc atcgcgcgac cgaatatgcg tacatggagg accggcggga tctgcgtcgg 840

gcgaccatca acgaatttgg cgaggatcgc gtcggcgcgc gaccgatcta g 891

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> Sphingopyxis sp.

<400> 2

Met Pro Phe Gln Val Asn Gln Leu His Pro Ile Phe Ala Ala Glu Met

1 5 10 15

Phe Gly Cys Asp Ile Leu Lys Pro Val Thr Asp Glu Thr Arg Asn Ala

20 25 30

Val Glu Asp Ala Met Ala Lys Tyr Ala Val Leu Val Ile Arg Asp Gln

35 40 45

Ala Ala Ala Ser Asp Glu Asp Gln Val Arg Phe Ala Lys Ala Phe Gly

50 55 60

Pro Leu Glu Leu Pro Pro Asp Leu Gly Met Ser Glu Arg Thr Arg Pro

65 70 75 80

Thr Arg Val His Pro Lys Leu Tyr Asp Val Ser Asn Leu Asp Glu Asn

85 90 95

Gly Asn Leu Asp Lys Pro Asp Thr Leu Arg Arg Lys Phe Ala Lys Gly

100 105 110

Asn Glu Leu Phe His Thr Asp Ser Ser Phe Asn Asp Leu Pro Thr Lys

115 120 125

Trp Ser Met Leu Leu Ala His Val Val Thr Pro Thr Gly Gly Asn Thr

130 135 140

Glu Phe Val Asp Thr Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Ser Pro Ser Met

145 150 155 160

Lys Glu Gln Val Glu Pro Leu Ser Val Ile His Ser Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Arg Glu Arg Gly Gly Leu Thr Gly Thr Thr Val Phe Asp Arg Ala Phe

180 185 190

Pro Pro Val Thr Gln Pro Leu Val Arg Thr Ser Ala Ser Gly Arg Lys

195 200 205

Ala Leu Tyr Ile Gly Ala His Ala Ala Thr Val Val Gly Met Asp Glu

210 215 220

Ala Ala Gly Arg Thr Leu Leu Asp Lys Leu Val Ser Asp Ala Ser Arg

225 230 235 240

Pro Glu Tyr Ile Tyr Ser His Lys Trp Leu Pro Gly Asp Leu Val Ile

245 250 255

Trp Asp Asn Arg Cys Thr Met His Arg Ala Thr Glu Tyr Ala Tyr Met

260 265 270

Glu Asp Arg Arg Asp Leu Arg Arg Ala Thr Ile Asn Glu Phe Gly Glu

275 280 285

Asp Arg Val Gly Ala Arg Pro Ile

290 295

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atactcgagg ctcactatct caaagacg 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attactagtg catggggaac gagcctgt 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctacatatgg ctcactatct caaagacga 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacaagcttg atcggtcgcg cgccgacgc 29

Claims

1.一株(R,S)-DCPP降解菌DBS4,其特征在于分类命名为Sphingopyxis sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 20191082，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址为中国-武汉，武汉大学。

2.由权利要求1所述的(R,S)-DCPP降解菌DBS4制备的菌剂。

3.权利要求1所述的降解菌DBS4或权利要求2所述的菌剂在降解手性除草剂的外消旋体(R,S)-DCPP或其两种手性异构单体(R)-DCPP和(S)-DCPP中的应用。

4.特异性降解(S)-DCPP的双加氧酶基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

5.权利要求2所述的双加氧酶基因编码的双加氧酶蛋白质，其特征在于氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

6.含权利要求4所述的双加氧酶基因的重组质粒。

7.含权利要求6所述的重组质粒的基因工程菌。

8.权利要求4所述的双加氧酶基因在降解土壤、水体或农作物的苯氧羧酸类除草剂残留方面的应用；优选在去除土壤、水体或农作物中的(S)-DCPP，2,4-D及(S)-MCPP残留方面的基因工程应用。

9.权利要求4所述的双加氧酶基因在抗(S)-DCPP，2,4-D及(S)-MCPP苯氧羧酸类除草剂转基因作物培育中的应用。

10.权利要求5所述的双加氧酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的(S)-DCPP，2,4-D及(S)-MCPP苯氧羧酸类除草剂残留方面和/或在手性拆分(R,S)-DCPP的旋光异构体获得(R)-DCPP中的应用。