CN111308099A - 一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片 - Google Patents

一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，属于免疫分析领域。该芯片包括示踪试剂和捕捉试剂；其中，所述示踪试剂包括花菁染料Cy5标记的cTnI单克隆抗体和质控物；所述捕获试剂含有cTnI单克隆抗体和质控物单克隆抗体。该芯片通过示踪抗体标记血液中的cTnI抗原，形成免疫复合物，被捕捉抗体捕捉，在激发光的激发下发光。具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围，能够用来评价患者cTnI水平，提示急性心肌梗塞。

Description

一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种快速检测cTnI的微流控荧光免疫芯片。
背景技术
心肌肌钙蛋白是调控心脏收缩的关键蛋白。由心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白C(cTnC)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)三个亚基组成的三聚体复合物。cTnI的生理作用是在没有钙的情况下抑制肌动蛋白-肌球蛋白复合物中ATP酶的活动，以阻止肌肉收缩。cTnI的分子量约为24kDa，由209个氨基酸组成，是一种富含α螺旋的蛋白。TnI(肌钙蛋白I)存在三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白I(sTnI)中存在快骨骼肌型和慢骨骼肌型，它们具有相似的分子量(20KD)，但二者之间的氨基酸序列约存在40％的差异；第三种为心肌型。心肌肌钙蛋白I(cTnI)与骨骼肌型的氨基酸序列也存在40％的差异，cTnI末端比sTnI末端多31个氨基酸，并且cTnI在心肌细胞中只存在一种亚型，决定了cTnI在心肌细胞中的特异性。
急性心肌梗塞(Acμte myocardial infarction,AMI)是最常见的心血管疾病之一，是在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血所导致的冠状动脉病变，最终引起心肌的缺血性坏死。病情严重时，心脏无法再行使其泵血的功能，会导致病人突然死亡。因此，急性心肌梗塞的早期诊断对于其预防和治疗是非常重要的。cTnI被研究者认为是AMI诊断最好的生物指标之一，由于其在心肌受损时才在血液中出现，并且出现时间早，持续时间久，特异性强，因此被广泛研究作为心肌损伤的确定性标志物。正常人和心肌梗塞患者血清中cTnI的临界值是0.5ng/mL，发病时血中浓度可达1～25ng/mL。所以快速，灵敏的检测样本中的cTnI是至关重要的。
心肌肌钙蛋白I常规检测方法有免疫比浊法(CN 104991077 A)，化学发光分析法(CN 109580954 A)，ELISA诊断试剂盒(公开号CN 107561289 B)和胶体金免疫层析法(公开号CN 207725899 μ)，等。但是ELISA法技术成熟，检测费用较低，但灵敏度和线性范围较差，操作复杂，重复性较差，检测时间较长。而胶体金免疫层析法，操作简单，但灵敏度、线性、重复性和定量准确性较差。免疫比浊法和化学发光发敏感高、准确，但需配套昂贵的大型仪器，检测时间长，并不适合急性诊断和小样本检测。同样存在灵敏度和线性范围较差的特点。因此，找到一种既能够降低操作难度、减少检测时间，又能够提高检测灵敏度、准确度和重复性的检测方法是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，该芯片通过与Response IQ联用，大大降低了操作难度和检测时间，有效提高了cTnI检测的灵敏度、准确度和重复性。
基于上述目的，本发明提供的一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，包括中心板和底板，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合，样本流道与所述测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有用于溶解示踪试剂的示踪区、两个样本混合区域、液体检测监控区域、样本流道端部有样本废料区域，在测量格对应位置的中心板上设置捕获区；其特征在于，
所述芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂包括用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的cTnI单克隆抗体和用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的质控物；
所述捕获试剂包括cTnI单克隆抗体和质控物单克隆抗体；
芯片最小检测限不高于0.01ng/mL，检测范围为0.01～25ng/mL，对非cTnI的交叉物的加样回收率均小于5.0％。
所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴300-600pL的液滴喷在芯片的捕获区内，喷点形成3个以上等间距的6*7矩形点阵，喷点不相互重合；捕获区cTnI单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL；捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL。
每滴喷点体积为400pL，矩形点阵数量为5个；捕获区cTnI单克隆抗体的浓度为1.2mg/mL；所述捕获区质控物单克隆抗体的浓度为1mg/mL。
所述荧光染料为Cy5花菁染料；所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，示踪剂体积为6μL；所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的cTnI单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.05～2.0μg/mL。
所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的cTnI单克隆抗体浓度为1.0μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.50μg/mL。
所述示踪试剂还包括动物蛋白、动物血清、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述捕获试剂还包括缓防腐剂和缓冲液。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片通过与抗体特异性结合，并在消逝场中的激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，实现荧光发光检测。该芯片具有较高的灵敏度、特异性和基质影响小。
(2)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片使用高精度点样仪喷涂示踪试剂和捕捉试剂，芯片的捕获区内具有至少3个6*7的矩形点阵，捕获区喷点体积小、浓度高，能精准制作芯片，使该芯片的重复性好，灵敏度较高。
(3)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片具有多个液体检测监控区域，保证样本在芯片流动过程中不出现气泡等干扰实验结果。
(4)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片样本混合、反应、分离和检测功能集成于一个芯片上，易生产制备通过与Response IQ联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差，可以满足随时随地检测。
(5)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片适用于全血、血浆、血清等血基质样本，适用范围广，有助于即时诊断。
(6)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，检测时间为10min,大大的缩短了检测时间，适用于床旁诊断及急诊使用。
(7)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，只需要50μL血液就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。
(8)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，测试完废弃样本储存在密闭的芯片中，不存在生物污染的情况，具有生物安全性。
(9)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，使用高质量单抗抗干扰能力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。
(10)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，配套Response IQ系统，体积小，使用场景限制少，适用于床旁诊断和预后监控。该芯片通过示踪抗体标记血液中的cTnI抗原，形成免疫复合物，被捕捉抗体捕捉，在激发光的激发下发光。具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围，能够用来评价患者cTnI水平，提示急性心肌梗塞。
附图说明
图1为本发明示踪区图。
图2为本发明捕获区点阵图。
图3为本发明cTnI检测标准曲线图。
图4为本发明实施例3中A，B点连点拟合曲线；
图5为本发明芯片检测全血cTnI与进口化学发光微粒免疫检测法测定值的相关性。
图6为本发明芯片检测血清cTnI与进口化学发光微粒免疫检测法测定值的相关性。
图7为本发明芯片检测全血cTnI与本发明芯片检测血清cTnI测定值的相关性。
图8为本发明所用芯片的主视结构示意图。
图9为本发明所用芯片的中心板部分的结构示意图。
图10为本发明所用芯片的底板部分的结构示意图。
图中，1中心板，2光学区域，3样本加入口，4第一样本混合区，5样本示踪区，6第二样本混合区，7样本废料区域，8样本流道端部，9底板，10测量格，11监测点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片(参见图8-10)包括中心板1和底板9，所述中心板1为光学透明材料，所述底板9位于毗邻所述中心板1的下侧，其中所述测量格10由设在中心板1中、所述底板9中、或所述中心板1和所述底板9两者中的凹部形成，其中所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合。该芯片具有样本流道，所述样本流道与所述测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有以下布局，用于溶解示踪试剂的示踪区5、两个样本混合区域(第一样本混合区4和第二样本混合区6)、液体检测监控区域(用于监测液体在流道中的位置)、样本流道端部8有样本废料区域7，在所述中心板上设有用于将样本引入到所述芯片中的样本加入口3，样本加入口是能以压力密闭方式来闭合的。除了所述中心板和所述底板以外，还设有部分地覆盖所述中心板的上盖，通过热塑封方式进行连接。上盖贴有RFID标签，所述RFID标签为电子信息存储器，存有cTnI校准信息及芯片唯一代码。芯片的具体结构可参见专利号为ZL2011800366544的专利内容。在测量格对应位置的中心板上设置捕获区。
所述底板9的整体尺寸大约为(900～1000)mm*(400～450)mm，捕获区长度占底板长度的4～5倍。
示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将4-6μL示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，优选地，示踪剂体积为6μL。
芯片内捕获区预先封装捕获试剂。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴300-600pL的液滴喷在芯片捕获区域内上，喷点以某种方式排列形成3个以上等间距的矩形点阵，每个矩形点阵为6*7的阵列，喷点不相互重合，且相邻两列的喷点交错布置，即第二列的喷点位于第一列和第三列相邻两个喷点中间的位置，多个等间距的矩形点阵沿底板长度方向均匀布置在捕获区中，优选地，液滴体积为400pL，矩形点阵数量为5个。由喷点组成图形，喷点在芯片上为结晶状态。
芯片检测样本的体积为10-100μL，优选地，样本体积为50μL。
芯片与Response IQ仪器连用，后者通过调整气压控制样本可以在芯片流道流动。芯片通过仪器提供的激发光在消逝场中激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，芯片可任选地沿移动轴以连续方式或以逐步方式从第一位置至少移到第二位置，以使各个芯片区域进入激发辐射的射束路径中。
所述示踪试剂包括不限于Cy5花菁染料标记的cTnI单克隆抗体和质控物，采用化学交联法对抗体或质控物进行抗体标记的方法为利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将荧光素表面的官能团(如羧基、氨基)与抗体表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。
所述示踪区Cy5花菁染料标记的cTnI单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL，优选地，浓度为1.0μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.05～0.50μg/mL，优选地，浓度为0.50μg/mL。
优选地，所述示踪试剂还包括动物蛋白、动物血清、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述动物蛋白选自牛血清白蛋白、酪蛋白其中的一种，所述动物蛋白的质量百分比浓度为0.1～1.0％，优选地，动物蛋白为质量百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白；所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，优选地，动物血清为马血清；所述的表面活性剂选自BRIJ35、Triton X-100，Tween20中的一种，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.01～0.05％，优选地，表面活性剂为质量百分比浓度为0.02％的Tween20；所述异嗜性抗体阻断剂浓度为10-100μg/mL，优选地，异嗜性抗体阻断剂浓度为30μg/mL；所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.05～0.2％，优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0，优选地，缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液。
所述示踪试剂中Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法如下：
(1)将cTnI单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析。
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(3)向Cy5溶液中加入NHS/EDC，活化0.5h～2h，优选地，活化0.5h。
(4)向步骤(1)处理后的cTnI单克隆抗体中加入步骤(3)制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比cTnI单克隆抗体的摩尔比为5:1-10:1，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
所述示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法如下：
(1)采用10mM PBS缓冲液配制5～10mg/mL的BSA溶液。
(2)向BSA溶液中加入SMCC，活化0.5h～2h，优选地，活化时间为1h。
(3)用PD10柱子纯化可得活化的BSA溶液。
(4)向步骤(3)活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比2:1～1:1投料，混匀，室温反应5h。然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mg/mL，得到浓缩液。
(5)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(6)向Cy5荧光素溶液中加入NHS/EDC，活化0.5h～2h。
(7)向步骤(4)浓缩液中加入步骤(6)制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1～10:1投料，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
所述捕获试剂含有cTnI单克隆抗体和质控物单克隆抗体。捕获区cTnI单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL，优选地，浓度为1.2mg/mL；所述捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL，优选地，浓度为1mg/mL。
所述捕获试剂还包括缓冲液和防腐剂；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0，优选地，缓冲液为pH为7.2的HEPES缓冲液。所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.05～0.2％，优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠。
本发明中cTnI微流控荧光免疫芯片的原理为：将待测血液样本加入芯片中，依靠泵提供的正压及负压，样本依次流过样本示踪区5使示踪试剂中的Cy5标记的cTnI单克隆抗体与样本中的cTnI抗原结合，形成免疫复合物，同时质控物溶解到样本中。经过两个混合区充分混合后进行液体检测，检测液体基质是否为血液基质和是否含有微小气泡，若为非血液基质或者有微小气泡则发出报警，避免检测或操作失误发生；若为血液基质且没有微小气泡，则进入芯片，免疫复合物与捕捉抗体结合，质控物与质控抗体结合。同时激光激发液体下层捕获物中的Cy5发光，检测发光强度并计算发射光强度随时间的变化率，经计算后得出信号强度。此信号强度在一定范围内与样本中的cTnI抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从信号强度-cTnI抗原浓度标准曲线上读取待测血液样本中的cTnI含量。
实施例1快速定量检测cTnI的微流控荧光免疫芯片
本实施实例中，快速定量检测cTnI的微流控荧光免疫芯片包括中心板1和底板9，所述中心板1为光学透明材料，所述底板9位于毗邻所述中心板1的下侧，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合。
在中心板表面一侧设有用于将样本引入到所述芯片中的样本加入口3，样本加入口以压力密闭方式来闭合的，从样本加入口3通过流道依次进入第一样本混合区4、示踪区、第二样本混合区，两个样本混合区呈蛇形延伸，示踪区呈U型，U型的两侧为两条平行直线；在中心板的另一侧设有样本流道端部，且样本流道端部有样本废料区域7，样本流道端部与第二样本混合区尾端之间为空白段。
所述底板整体呈矩形，底板的长度方向边缘设有齿状结构，底板能覆盖在中心板上，底板与中心板的空白段对应的位置上设有测量格，测量格沿底板长度方向将样本流道端部与第二样本混合区尾端联通，构成连续的样本流道，在测量格对应的中心板空白段上喷捕获剂，形成捕获区。在与中心板上两个样本混合区对应的底板边缘上沿底板长度方向设置多个监测点11，多个监测点构成液体检测监控区域，用于监测液体在流道中的位置，保证样本在芯片流动过程中不出现气泡等干扰实验结果。
该芯片的整个样本流道为从样本加入口、第一样本混合区4、用于溶解示踪试剂的示踪区5、第二样本混合区6、测量格、样本流道端部8构成，样本流道与测量格呈流体接触。
芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将6μL示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，如图1所示，示踪区形成两条平行的直线，图中U型的平行部分。
本实施实例中，芯片的捕获区预先封装捕获试剂。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴400pL的液滴喷在芯片捕获区域内上，多个喷点形成5个等间距的矩形点阵，喷点不相互重合。如图2所示，图2中为一个6*7的矩形点阵形态，喷点在芯片上为结晶状态。
本实施实例中，芯片检测样本的加样体积为50μL。
本实施实例中，芯片与Response IQ仪器连用，后者通过调整气压控制样本可以在芯片流道流动。芯片通过仪器提供的激发光在消逝场中激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，芯片可任选地沿移动轴以连续方式或以逐步方式从第一位置至少移到第二位置，以使芯片各个区域进入激发辐射的射束路径中。
本实施实例中，示踪试剂包括花菁染料Cy5标记的cTnI单克隆抗体和质控物、动物蛋白、动物血清、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液。
Cy5标记的cTnI单克隆抗体浓度为1.00μg/mL；质控物浓度浓度为0.50μg/mL；动物蛋白为质量百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白；动物血清为马血清；表面活性剂为质量百分比浓度为0.02％的Tween20；异嗜性抗体阻断剂浓度为30μg/mL；防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠；缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液。
Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法如下：
(1)将cTnI单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析。
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.5mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(3)向Cy5荧光素溶液中加入NHS或EDC，活化0.5h。
(4)向步骤(1)处理后的cTnI单克隆抗体中加入步骤(3)制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比cTnI单克隆抗体的摩尔比为10:1，混匀，室温反应24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
所述示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法如下：
(1)采用10mM PBS缓冲液配制10mg/mL的BSA溶液。
(2)向BSA溶液中加入SMCC，活化1h。
(3)用PD10柱子纯化可得活化的BSA溶液。
(4)向步骤(3)活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比1.5:1投料，混匀，室温反应5h。然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mg/mL，得到浓缩液。
(5)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.5mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(6)向Cy5荧光素溶液中加入NHS/EDC，活化1h。
(7)向步骤(4)浓缩液中加入步骤(6)制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1投料，混匀，室温反应24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
本实施实例中，捕捉试剂包括cTnI单克隆抗体、质控物单克隆抗体、防腐剂和缓冲液。cTnI单克隆抗体的浓度为1.2mg/mL，质控物单克隆抗体的浓度为1mg/mL；防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠；缓冲液为pH为7.2的HEPES缓冲液。
实施例2快速定量检测cTnI的微流控荧光免疫芯片绘制标准曲线测定及信息存储
将芯片从储存条件下取出后平衡至室温再用于检测；
步骤1.用稀释液配制cTnI校准品，浓度为：0、0.1、1、5、15、25ng/mL
步骤2.分别取50μL校准品加到微流控芯片样本加入口，每次取样前都需要更换移液器头避免交叉污染，10分钟后，通过Response IQ读取系统检测信号，每个标准品的浓度检测两次，校准品液系列信号值测定结果如表1所示，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-信号值的回归曲线，如图3所示。
表1
Figure BDA0002413423760000101
实施例3快速定量检测cTnI的微流控荧光免疫芯片的方法学检定
按照本领域中的常规的制造及检定规程对实施例1中的芯片进行检定，结果如下：
1.芯片精密度测定
1.1批内精密度分析
将实施例1中的芯片一批，分别测定高、低浓度的质控品液系列，10片平行测定，得出批内变异系数分别为3.45％、1.97％，结果如表2所示。
表2
靶值(ng/mL) 测定次数 分析内CV(％)
1 10 3.45
10 10 1.97
1.2批间精密度分析
将实施例1中的芯片取三批，每批芯片均测定高、低浓度的质控品液系列，10片平行测定，每份质控品液得到30个浓度测值，统计批间变异系数分别为5.86％、4.03％，结果如表3所示。
表3
靶值(ng/mL) 测定次数 分析内CV(％)
1 30 5.86
10 30 4.03
2.芯片最低检测限
最低检测限是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量。用零浓度较准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的信号值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度较准品和相邻校准品之间的浓度-信号值进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的信号值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。
2.1A点信号值结果如表4所示，其中cTnI-STD-A表示cTnI的A点信号值。
由表4可见，A点信号值的均值X＝0.000038、SD＝0.001683、X+2SD＝0.003403
表4
Figure BDA0002413423760000111
2.2B点信号值结果如表5所示，其中cTnI-STD-B表示cTnI的B点信号值。
由表5可见，B点信号值的均值X＝0.04208。
表5
Figure BDA0002413423760000121
2.3A，B点连点拟合曲线如图4所示。
由图4可知，A，B点连点拟合曲线方程为y＝0.4204x+0.00004，R2＝1，x为浓度，单位ng/mL，y为信号值。
2.4根据A-B点浓度-信号值线性拟合方程(A，B点连点拟合曲线方程)，将M+2SD的信号值值带入上述方程中，求得对应的浓度值，即为最低检测限，即实施例1中芯片的最低检测限为0.008ng/mL。
3.芯片交叉反应试验
使用稀释液分别配制浓度为1μg/mL的心肌钙蛋白、骨骼肌钙蛋白I、原肌凝蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白C、轻链肌凝蛋白、肌红蛋白、CK-MB的特异性样本；向180μL浓度介于4ng/mL～6ng/mL区间的血样中加入20μL校准品稀释液，配制对照样本；各样本重复检测3次。按照下述公式计算交叉反应：交叉反应＝(加样样本测值-对照样本测值)/加样终浓度×100％
交叉反应实验结果如表6所示，由表6可知，cTnI芯片对cTnI具有高度特异性。在已知cTnI浓度的血浆样品中加入下列化合物后测定交叉反应没有检测出交叉反应。
表6
对照样本 心肌钙蛋白T 骨骼肌钙蛋白I 原肌凝蛋白 肌动蛋白
样本浓度(ng/mL) 4～6 1000 1000 1000 1000
交叉反应 -- <1％ <1％ <1％ <1％
肌钙蛋白C 轻链肌凝蛋白 肌红蛋白 CK-MB
样本浓度(ng/mL) 1000 1000 1000 1000
交叉反应 <1％ <1％ <1％ <1％
4.芯片抗干扰试验
向180μL浓度为4ng/mL～6ng/mL区间的血样中添加20μL校准品稀释液配制成干扰物，作为干扰样本；向4ng/mL～6ng/mL区间的血样中添加20μL较准品稀释液，作为对照样本；采用实施例1中的芯片测定对照样本和干扰样本，每个样本测定3次。结果如表7所示。
表7
添加物 偏差
对照样本
0.3％脂浊 4.84％
2.5g/L血红蛋白 3.68％
500μM游离胆红素 5.84％
500μM结合胆红素 4.51％
100IU/mL肝素钠 2.20％
由表7结果可知，干扰样本测值与对照样本测值的偏差均小于±15％。本发明的芯片抗干扰效果良好。
5.芯片稳定性试验
对实施例1中的芯片分别进行4℃和37℃放置的稳定性实验，芯片4℃放置12个月和37℃放置7天，最低检测限低于0.01ng/mL，分析内和分析间精密度分别小于±10％和±15％、交叉反应加样回收率小于±5％。因此，芯片有效期可达12个月。
经过大量的实验证明，本发明的芯片方法学指标如下：
检测范围：0.01～25ng/mL
最低检测限：最小检测限不高于0.01ng/mL
精密度：批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％
交叉反应：对非cTnI的交叉物的加样回收率均小于5.0％。
稳定性：试剂各组分置4℃12个月和37℃7天后测定结果均符合要求，芯片有效期可达12个月。
实施例4本发明芯片同进口化学发光微粒免疫检测法芯片临床样本测值比对
用实施例1中的芯片和进口化学发光微粒子免疫检测法对40份人血样同时进行检测，同一份样本分别检测全血与血清。以本发明芯片测定全血的cTnI浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定的结果为横坐标作图，如图5所示。以本发明芯片测定血清的cTnI浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定的结果为横坐标作图，如图6所示。以本发明芯片测定血清的cTnI浓度为纵坐标，以本发明芯片测定全血的cTnI浓度为横坐标，如图7所示。
采用本发明芯片检测全血cTnI浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定的结果为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.955x-0.2271，相关系数R2＝0.9756，采用本发明芯片检测血清cTnI浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定的结果为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.9454x-0.2402，相关系数R2＝0.9690，采用本发明芯片检测全血cTnI浓度为纵坐标，以本发明芯片检测血清cTnI浓度为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.9848x-0.0029，相关系数R2＝0.9831。经统计学处理结果表明，本方法同进口化学发光微粒免疫检测法芯片临床样本测定值相关性良好。本方法检测临床全血与血清测定值相关性良好。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的cTnI微流控荧光免疫芯片通过与抗体特异性结合，并在消逝场中的激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，实现荧光发光检测。该芯片具有较高的灵敏度、特异性和基质影响小。
(2)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片使用高精度点样仪喷涂示踪试剂和捕捉试剂，芯片的捕获区内具有至少3个6*7的矩形点阵，捕获区喷点体积小、浓度高，能精准制作芯片，使该芯片的重复性好，灵敏度较高。
(3)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片具有多个液体检测监控区域，在两个混合区下方设置两个监测点11，在示踪区左右两侧的上方设置两个监测点，保证样本在芯片流动过程中不出现气泡等干扰实验结果。
(4)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片样本混合、反应、分离和检测功能集成于一个芯片上，易生产制备通过与Response IQ联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差，可以满足随时随地检测。
(5)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片适用于全血、血浆、血清等血基质样本，适用范围广，有助于即时诊断，避免了滤网过滤等复杂过程。
(6)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，检测时间为10min,大大的缩短了检测时间，适用于床旁诊断及急诊使用。
(7)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，只需要50μL血液就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。
(8)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，测试完废弃样本储存在密闭的芯片中，不存在生物污染的情况，具有生物安全性。
(9)本发明提供的cTnI微流控荧光芯片，使用高质量单抗抗干扰能力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。
(10)本发明提供的BNP微流控荧光芯片，配套Response IQ系统，体积小，使用场景限制少，适用于床旁诊断和预后监控。
实施例5
本实施例快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，结构同实施例1，示踪试剂中Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法及示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法也同实施例1。不同之处在于，本实施例中示踪剂体积为5μL。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴500pL的液滴喷在芯片的捕获区域内上；捕获区cTnI单克隆抗体的浓度为1mg/mL；所述捕获区质控物单克隆抗体的浓度为1.5mg/mL。
实施例6
本实施例快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，结构同实施例1，示踪试剂中Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法及示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法也同实施例1。不同之处在于，本实施例中示踪剂体积为4μL。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴600pL的液滴喷在芯片的捕获区域内上。
实施例7
本实施例快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，结构同实施例1，示踪试剂中Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法及示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法也同实施例1。不同之处在于，本实施例中示踪剂体积为4μL。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴500pL的液滴喷在芯片的捕获区域内上。
实施例8
本实施例快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，结构同实施例1，示踪试剂中Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法及示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法也同实施例1。不同之处在于，本实施例中示踪试剂中动物蛋白为质量百分比浓度为0.8％的酪蛋白，动物血清为羊血清，表面活性剂为质量百分比浓度为0.02％的Triton X-100，缓冲液为pH为7.2的HEPES缓冲液。
上述实施例5-8经测试其抗干扰性强，芯片有效期均能达到12个月，检测范围：0.01～25ng/mL。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (8)

1.一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片，包括中心板和底板，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合，样本流道与所述测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有用于溶解示踪试剂的示踪区、两个样本混合区域、液体检测监控区域、样本流道端部有样本废料区域，在测量格对应位置的中心板上设置捕获区；其特征在于，
所述芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂包括用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的cTnI单克隆抗体和用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的质控物；
所述捕获试剂包括cTnI单克隆抗体和质控物单克隆抗体；
芯片最小检测限不高于0.01ng/mL，检测范围为0.01～25ng/mL，对非cTnI的交叉物的加样回收率均小于5.0％。
2.根据权利要求1所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴300-600pL的液滴喷在芯片的捕获区内，喷点形成3个以上等间距的6*7矩形点阵，喷点不相互重合；捕获区cTnI单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL；捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL。
3.根据权利要求2所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，每滴喷点体积为400pL，矩形点阵数量为5个；捕获区cTnI单克隆抗体的浓度为1.2mg/mL；所述捕获区质控物单克隆抗体的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，所述荧光染料为Cy5花菁染料；所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，示踪剂体积为6μL；所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的cTnI单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.05～2.0μg/mL。
5.根据权利要求4所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的cTnI单克隆抗体浓度为1.0μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.50μg/mL。
6.根据权利要求4所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，所述示踪试剂还包括动物蛋白、动物血清、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述捕获试剂还包括缓防腐剂和缓冲液。
7.根据权利要求1所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，示踪试剂中Cy5标记的cTnI单克隆抗体的制备方法是：
(1)将cTnI单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析；
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液；
(3)向Cy5荧光素溶液中加入NHS或EDC，活化0.5h；
(4)向步骤(1)处理后的cTnI单克隆抗体中加入步骤(3)制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比cTnI单克隆抗体的摩尔比为10:1，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；
示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法是：
(1)采用10mM PBS缓冲液配制5～10mg/mL的BSA溶液；
(2)向BSA溶液中加入SMCC，活化1h；
(3)用PD10柱子纯化可得活化的BSA溶液；
(4)向步骤(3)活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比1.5:1投料，混匀，室温反应5h；然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mg/mL，得到浓缩液；
(5)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液；
(6)向Cy5荧光素溶液中加入NHS/EDC，活化1h；
(7)向步骤(4)浓缩液中加入步骤(6)制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1投料，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
8.根据权利要求1所述的微流控荧光免疫芯片，其特征在于，芯片检测样本的体积为10-100μL，检测时间为10min；优选样本体积为50μL，批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％，对非cTnI的交叉物的加样回收率均小于5.0％。
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