CN111308102B - 一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片 - Google Patents

一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片 Download PDF

Info

Publication number
CN111308102B
CN111308102B CN202010183580.8A CN202010183580A CN111308102B CN 111308102 B CN111308102 B CN 111308102B CN 202010183580 A CN202010183580 A CN 202010183580A CN 111308102 B CN111308102 B CN 111308102B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chip
pct
solution
monoclonal antibody
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010183580.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111308102A (zh
Inventor
王鹏
郭闻轩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Original Assignee
Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Leadman Biochemistry Co ltd filed Critical Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Priority to CN202010183580.8A priority Critical patent/CN111308102B/zh
Publication of CN111308102A publication Critical patent/CN111308102A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111308102B publication Critical patent/CN111308102B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/585—Calcitonins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Abstract

本发明公开了一种快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片，属于免疫分析领域。该芯片包括示踪试剂和捕捉试剂；其中，所述示踪试剂包括花菁染料Cy5标记的PCT单克隆抗体和质控物；所述捕获试剂含有PCT单克隆抗体和质控物单克隆抗体。该芯片通过示踪抗体标记血液中的PCT抗原，形成免疫复合物，被捕捉抗体捕捉，在激发光的激发下发光。具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围，能够用来评价患者PCT水平，提示细菌感染等。

Description

一种快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片。
背景技术
降钙素原(PCT)是降钙素的前体物，是由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白。PCT由N末端-降钙素-C末端三部分组成，不会降解为降钙素，不受体内激素水平影响。在人体内的半衰期约为20～24小时，稳定性好，降钙素原在正常人血液中含量极低，在系统炎症反应综合症(SIRS)、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤等患者血液中显著升高，而在病素毒感染时则保持低水平，降钙素原在严重细菌感染(2-3小时后)早期即可升高，因此具有早期诊断价值。在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时降钙素原的浓度不增加或轻微增加，而只在严重的全身系统性感染时才明显增加，这就决定了降钙素原的高度特异性，因此也可用于各种临床情况的鉴别诊断。临床资料显示，PCT浓度高于0.1ng/mL说明存在临床相关的细菌感染，血药采用抗生素进行治疗；当PCT浓度高于0.5ng/mL要考虑患者可能发展成重败血症或败血症休克的危险。降钙素原的浓度和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而降钙素原又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。
降钙素原常规检测方法有免疫比浊法(CN 107907692A)，化学发光分析法(CN107807240A)，ELISA诊断试剂盒(CN 107688096A)和胶体金免疫层析法(CN 106093431A)，等。但是ELISA法技术成熟，检测费用较低，但灵敏度和线性范围较差，操作复杂，重复性较差，检测时间较长。而胶体金免疫层析法，操作简单，但灵敏度、线性、重复性和定量准确性较差。免疫比浊法和化学发光发敏感高、准确，但需配套昂贵的大型仪器，检测时间长，并不适合小样本检测。同样存在灵敏度和线性范围较差的特点。
因此，找到一种既能够降低操作难度、减少检测时间，又能够提高检测灵敏度、准确度和重复性的检测方法是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片，该芯片通过与Response IQ联用，大大降低了操作难度和检测时间，有效提高了PCT检测的灵敏度、准确度和重复性。
基于上述目的，本发明提供的一种快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片，包括中心板和底板，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合，样本流道与所述测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有用于溶解示踪试剂的示踪区、两个样本混合区域、液体检测监控区域、样本流道端部有样本废料区域，在测量格对应位置的中心板上设置捕获区；其特征在于，
所述芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂包括用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的PCT单克隆抗体和用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的质控物；
所述捕获试剂包括PCT单克隆抗体和质控物单克隆抗体；
芯片最小检测限不高于0.05ng/mL，检测范围为0.05～50ng/mL。
所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴300-600pL的液滴喷在芯片的捕获区内，喷点形成3个以上等间距的6*7矩形点阵，喷点不相互重合；捕获区PCT单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL；捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL。
每滴喷点体积为350pL，矩形点阵数量为5个；捕获区PCT单克隆抗体的浓度为0.75mg/mL；所述捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.75mg/mL。
所述荧光染料为Cy5花菁染料；所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，示踪剂体积为6μL；所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的PCT单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.05～2.0μg/mL。
所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的PCT单克隆抗体浓度为0.75μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.25μg/mL。
所述示踪试剂还包括动物蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述捕获试剂还包括缓防腐剂和缓冲液；
动物蛋白为质量百分比浓度为3.5％的牛血清白蛋白，表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的Triton X-100，异嗜性抗体阻断剂浓度为40μg/mL，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠，缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液。
芯片检测样本的体积为10-100μL，检测时间为10min；优选样本体积为50μL，批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的PCT微流控荧光芯片通过与抗体特异性结合，并在消逝场中的激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，实现荧光发光检测。该芯片具有较高的灵敏度、特异性和基质影响小。
(2)本发明提供的PCT微流控荧光芯片使用高精度点样仪喷涂示踪试剂和捕捉试剂，芯片的捕获区内具有至少3个6*7的矩形点阵，捕获区喷点体积小、浓度高，能精准制作芯片，使该芯片的重复性好，灵敏度较高。
(3)本发明提供的PCT微流控荧光芯片具有多个液体检测监控区域，保证样本在芯片流动过程中不出现气泡等干扰实验结果。
(4)本发明提供的PCT微流控荧光芯片样本混合、反应、分离和检测功能集成于一个芯片上，易生产制备通过与Response IQ联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差，可以满足随时随地检测。
(5)本发明提供的PCT微流控荧光芯片适用于全血、血浆、血清等血基质样本，适用范围广，有助于即时诊断。
(6)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，检测时间为10min,大大的缩短了检测时间，适用于急诊使用。
(7)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，只需要50μL血液就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。
(8)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，测试完废弃样本储存在密闭的芯片中，不存在生物污染的情况，具有生物安全性。
(9)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，使用高质量单抗抗干扰能力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。
(10)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，配套Response IQ系统，体积小，使用场景限制少，适用于床旁诊断和预后监控。
附图说明
图1为本发明示踪区图。
图2为本发明捕获区点阵图。
图3为本发明PCT检测标准曲线图。
图4为本发明实施例3中A，B点连点拟合曲线；
图5为本发明芯片检测全血PCT与进口化学发光微粒免疫检测法测定值的相关性。
图6为本发明芯片检测血浆PCT与进口化学发光微粒免疫检测法测定值的相关性。
图7为本发明芯片检测全血PCT与本发明芯片检测血浆PCT测定值的相关性。
图8为本发明所用芯片的主视结构示意图。
图9为本发明所用芯片的中心板部分的结构示意图。
图10为本发明所用芯片的底板部分的结构示意图。
图中，1中心板，2光学区域，3样本加入口，4第一样本混合区，5样本示踪区，6第二样本混合区，7样本废料区域，8样本流道端部，9底板，10测量格，11监测点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片(参见图8-10)包括中心板1和底板9，所述中心板1为光学透明材料，所述底板9位于毗邻所述中心板1的下侧，其中所述测量格10由设在中心板1中、所述底板9中、或所述中心板1和所述底板9两者中的凹部形成，其中所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合。该芯片具有样本流道，所述样本流道与所述测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有以下布局，用于溶解示踪试剂的示踪区5、两个样本混合区域(第一样本混合区4和第二样本混合区6)、液体检测监控区域(用于监测液体在流道中的位置)、样本流道端部8有样本废料区域7，在所述中心板上设有用于将样本引入到所述芯片中的样本加入口3，样本加入口是能以压力密闭方式来闭合的。除了所述中心板和所述底板以外，还设有部分地覆盖所述中心板的上盖，通过热塑封方式进行连接。上盖贴有RFID标签，所述RFID标签为电子信息存储器，存有PCT校准信息及芯片唯一代码。芯片的具体结构可参见专利号为ZL2011800366544的专利内容。在测量格对应位置的中心板上设置捕获区。
示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将4-6μL示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，优选地，示踪剂体积为6μL。
芯片内捕获区预先封装捕获试剂。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴300-600pL的液滴喷在芯片捕获区域内上，喷点以某种方式排列形成3个以上等间距的矩形点阵，每个矩形点阵为6*7的阵列，喷点不相互重合，且相邻两列的喷点交错布置，即第二列的喷点位于第一列和第三列相邻两个喷点中间的位置，多个等间距的矩形点阵沿底板长度方向均匀布置在捕获区中，优选地，液滴体积为350pL，矩形点阵数量为4个。由喷点组成图形，喷点在芯片上为结晶状态。
芯片检测样本的体积为10-100μL，优选地，样本体积为50μL。
芯片与Response IQ仪器连用，后者通过调整气压控制样本可以在芯片流道流动。芯片通过仪器提供的激发光在消逝场中激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，芯片可任选地沿移动轴以连续方式或以逐步方式从第一位置至少移到第二位置，以使各个芯片区域进入激发辐射的射束路径中。
所述示踪试剂包括但不限于Cy5花菁染料标记的PCT单克隆抗体和质控物。采用化学交联法对抗体或质控物进行抗体标记的方法为利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将荧光素表面的官能团(如羧基、氨基)与抗体表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。
所述示踪区Cy5花菁染料标记的PCT单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL，优选地，浓度为0.75μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.05～0.50μg/mL，优选地，浓度为0.25μg/mL
所述示踪试剂还包括动物蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述动物蛋白选自牛血清白蛋白、酪蛋白其中的一种，所述动物蛋白的质量百分比浓度为1.0～5.0％，优选地，动物蛋白为质量百分比浓度为3.5％的牛血清白蛋白；所述的表面活性剂选自BRIJ 35、Triton X-100，Tween 20中的一种，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.02～0.10％，优选地，表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的Triton X-100；所述异嗜性抗体阻断剂浓度为10-100μg/mL，优选地，异嗜性抗体阻断剂浓度为40μg/mL；所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.05～0.2％，，优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0,优选地，缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液。
所述示踪试剂中Cy5标记的PCT单克隆抗体的制备方法如下：
(1)将PCT单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析。
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(3)向Cy5荧光素溶液中加入NHS/EDC，活化0.5h～2h，优选地，活化时间为1.5h。
(4)向步骤(1)处理后的PCT单克隆抗体中加入步骤(3)制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比PCT单克隆抗体的摩尔比为5:1-10:1，优选，摩尔比为8:1，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
所述示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法如下：
(1)采用10mM PBS缓冲液配制5～10mg/mL的BSA溶液。
(2)向BSA溶液中加入SMCC，活化0.5h～2h，优选地，活化时间为1h。
(3)用PD10柱子纯化可得活化的BSA溶液。
(4)向步骤(3)活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比2:1～1:1投料，优选，摩尔比为1.5:1，混匀，室温反应2-8h。然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mg/mL，得到浓缩液。
(5)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(6)向Cy5溶液中加入NHS/EDC，活化0.5h～2h，优选地，活化时间为1h。
(7)向步骤(4)浓缩液中加入步骤(6)制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1～10:1投料，优选地，摩尔比为5:1，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
所述捕获试剂含有PCT单克隆抗体和质控物单克隆抗体。捕获区PCT单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL，优选地，浓度为0.75mg/mL；所述捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.5～2.0mg/mL，优选地，浓度为0.75mg/mL。
所述捕获试剂还包括缓冲液和防腐剂；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0，优选地，缓冲液为pH为7.2的HEPES缓冲液；所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.05～0.2％，优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠。
本发明中PCT微流控荧光免疫芯片的原理为：将待测血液样本由样本加入口加入芯片中，依靠泵提供的正压及负压，样本依次流过样本示踪区使示踪试剂中的Cy5标记的PCT单克隆抗体与样本中的PCT抗原结合，形成免疫复合物，同时质控物溶解到样本中。经过混合区充分混合后进行液体检测，检测液体基质是否为血液基质和是否含有微小气泡，若为非血液基质或者有微小气泡则发出报警，避免检测或操作失误发生；若为血液基质且没有微小气泡，则进入芯片，免疫复合物与捕捉抗体结合，质控物与质控抗体结合。同时激光激发液体下层捕获物中的Cy5发光，检测发光强度并计算发射光强度随时间的变化率，经计算后得出信号强度。此信号强度在一定范围内与样本中的PCT抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从信号强度-PCT抗原浓度标准曲线上读取待测血液样本中的PCT含量。
实施例1快速定量检测PCT的微流控荧光免疫芯片的组成及制备
本实施实例中，快速定量检测PCT的微流控荧光免疫芯片包括中心板1和底板9，所述中心板1为光学透明材料，所述底板9位于毗邻所述中心板1的下侧，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合。
在中心板表面一侧设有用于将样本引入到所述芯片中的样本加入口3，样本加入口以压力密闭方式来闭合的，从样本加入口3通过流道依次进入第一样本混合区4、示踪区、第二样本混合区，两个样本混合区呈蛇形延伸，示踪区呈U型，U型的两侧为两条平行直线；在中心板的另一侧设有样本流道端部，且样本流道端部有样本废料区域7，样本流道端部与第二样本混合区尾端之间为空白段。
所述底板整体呈矩形，底板的长度方向边缘设有齿状结构，底板能覆盖在中心板上，底板与中心板的空白段对应的位置上设有测量格，测量格沿底板长度方向将样本流道端部与第二样本混合区尾端联通，构成连续的样本流道，在测量格对应的中心板空白段上喷捕获剂，形成捕获区。在与中心板上两个样本混合区对应的底板边缘上沿底板长度方向设置多个监测点11，多个监测点构成液体检测监控区域，用于监测液体在流道中的位置，保证样本在芯片流动过程中不出现气泡等干扰实验结果。
该芯片的整个样本流道为从样本加入口、第一样本混合区4、用于溶解示踪试剂的示踪区5、第二样本混合区6、测量格、样本流道端部8构成，样本流道与测量格呈流体接触。
所述底板9的整体尺寸大约为(900～1000)mm*(400～450)mm,捕获区长度占底板长度的4～5倍，优选捕获区长度占底板长度的4.5倍。
芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将6μL示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，如图1所示，示踪区形成两条平行的直线，图中U型的平行部分。
本实施实例中，芯片的捕获区预先封装捕获试剂。所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴350pL的液滴喷在芯片捕获区域内上，多个喷点形成4个等间距的矩形点阵，喷点不相互重合。如图2所示，图2中为一个6*7的矩形点阵形态，喷点在芯片上为结晶状态。
本实施实例中，芯片检测样本的体积为50μL。
本实施实例中，芯片与Response IQ仪器连用，后者通过调整气压控制样本可以在芯片流道流动。芯片通过仪器提供的激发光在消逝场中激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，芯片可任选地沿移动轴以连续方式或以逐步方式从第一位置至少移到第二位置，以使各个芯片区域进入激发辐射的射束路径中。
本实施实例中，示踪试剂包括但不限于花菁染料Cy5标记的PCT单克隆抗体和质控物、动物蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液。
Cy5标记的PCT单克隆抗体浓度为0.75μg/mL，质控物浓度浓度为0.25μg/mL；动物蛋白为质量百分比浓度为3.5％的牛血清白蛋白；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的Triton X-100；异嗜性抗体阻断剂浓度为40μg/mL；防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠；缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液。
Cy5标记的PCT单克隆抗体的制备方法如下：
(1)将PCT单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析。
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.5mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(3)向Cy5荧光素溶液中加入NHS或EDC，活化1.5h。
(4)向步骤(1)处理后的PCT单克隆抗体中加入步骤(3)制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比PCT单克隆抗体的摩尔比为8:1，混匀，室温反应24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
Cy5标记的质控物的制备方法如下：
(1)采用10mM PBS缓冲液配制8mg/mL的BSA溶液。
(2)向BSA溶液中加入SMCC，活化1h。
(3)用PD10柱子纯化可得活化的BSA溶液。
(4)向步骤(3)活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比1.5:1投料，混匀，室温反应2-8h。然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mg/mL，得到浓缩液。
(5)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.5mg/mL的Cy5荧光素溶液。
(6)向Cy5溶液中加入NHS/EDC，活化1h。
(7)向步骤(4)浓缩液中加入步骤(6)制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1投料，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得。
本实施实例中，捕捉试剂包括PCT单克隆抗体、质控物单克隆抗体、防腐剂和缓冲液。PCT单克隆抗体的浓度为0.75mg/mL；质控物单克隆抗体的浓度为0.75mg/mL；防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠；缓冲液为pH为7.2的HEPES缓冲液。
实施例2快速定量检测PCT的微流控荧光免疫芯片绘制标准曲线测定及信息存储
将芯片从储存条件下取出后平衡至室温再用于检测；
步骤1.用稀释液配制PCT校准品，浓度为：0、0.25、2、10、25、50ng/mL
步骤2.分别取50μL校准品加到微流控芯片样本加入口，每次取样前都需要更换移液器头避免交叉污染，10分钟后，通过Response IQ读取系统检测信号，每个标准品的浓度检测两次，校准品液系列信号值测定结果如表1所示，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-信号值的回归曲线，如图3所示。
表1
实施例3快速定量检测PCT的微流控荧光免疫芯片的方法学检定
按照本领域中的常规的制造及检定规程对实施例1中的芯片进行检定，结果如下：
1.芯片精密度测定
1.1批内精密度分析
将实施例1中的芯片一批，分别测定高、低浓度的质控品液系列，10片平行测定，得出批内变异系数分别为3.61％、2.40％，结果如表2所示。
表2
靶值(ng/mL) 测定次数 分析内CV(％)
2 10 3.61
20 10 2.40
1.2批间精密度分析
将实施例1中的芯片取三批，每批芯片均测定高、低浓度的质控品液系列，10片平行测定，每份质控品液得到30个浓度测值，统计批间变异系数分别为4.91％、4.52％，结果如表3所示。
表3
靶值(ng/mL) 测定次数 分析内CV(％)
2 30 4.91
20 30 4.52
2.芯片最低检测限
最低检测限是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量。用零浓度较准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的信号值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度较准品和相邻校准品之间的浓度-信号值进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的信号值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。
2.1 A点信号值结果如表4所示，其中PCT-STD-A表示PCT的A点信号值。
由表4可见，A点信号值的均值X＝0.000042、SD＝0.000089、X+2SD＝0.00022
表4
2.2 B点信号值结果如表5所示，其中PCT-STD-B表示PCT的B点信号值。
由表5可见，B点信号值的均值X＝0.0011595
表5
2.3 A，B点连点拟合曲线如图4所示。
由图4可知，A，B点连点拟合曲线方程为y＝0.0045x+0.00004，R2＝1。
2.4根据A-B点浓度-信号值线性拟合方程，将M+2SD的信号值值带入上述方程中，求得对应的浓度值，即为最低检测限，即实施例1中芯片的最低检测限为0.04ng/mL。
3.芯片抗干扰试验
向180μL浓度为4ng/mL～6ng/mL区间的血样中添加20μL校准品稀释液配制成干扰物，作为干扰样本；向4ng/mL～6ng/mL区间的血样中添加20μL较准品稀释液，作为对照样本；采用实施例1中的芯片测定对照样本和干扰样本，每个样本测定3次。结果如表6所示。
表6
由表6结果可知，干扰样本测值与对照样本测值的偏差均小于±15％。本发明的芯片抗干扰效果良好。
4.芯片稳定性试验
对实施例1中的芯片分别进行4℃和37℃放置的稳定性实验，芯片4℃放置12个月和37℃放置7天，最低检测限低于0.05ng/mL，分析内和分析间精密度分别小于±10％和±15％。因此，芯片有效期可达12个月。
经过大量的实验证明，本发明的芯片方法学指标如下：
检测范围：0.05～50ng/mL
最低检测限：最小检测限不高于0.05ng/mL
精密度：批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％
稳定性：试剂各组分置4℃12个月和37℃7天后测定结果均符合要求，芯片效期可达12个月。
实施例4本发明芯片同进口化学发光微粒免疫检测法临床样本测值比对
用实施例1中的芯片和进口化学发光微粒子免疫检测法对40份人血样同时进行检测，同一份样本分别检测全血与血浆。以本发明芯片测定全血的PCT浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定的结果为横坐标作图，如图5所示。以本发明芯片测定血浆的PCT浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定的结果为横坐标作图，如图6所示。以本发明芯片测定血浆的PCT浓度为纵坐标，以本发明芯片测定全血的PCT浓度为横坐标，如图7所示。
采用本发明芯片检测全血PCT浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定血浆的结果为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.9551x-0.458，相关系数R2＝0.9762，采用本发明芯片检测血浆PCT浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法测定血浆的结果为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.9447x-0.4716，相关系数R2＝0.9691，采用本发明芯片检测全血PCT浓度为纵坐标，以本发明芯片检测血浆PCT浓度为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.9845x+0.004，相关系数R2＝0.9835。经统计学处理结果表明，本方法同进口化学发光微粒免疫检测法临床样本测定值相关性良好。本方法检测临床全血与血浆测定值相关性良好。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的PCT微流控荧光芯片通过与抗体特异性结合，并在消逝场中的激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子，实现荧光发光检测。该芯片具有较高的灵敏度、特异性和基质影响小。
(2)本发明提供的PCT微流控荧光芯片使用高精度点样仪喷涂示踪试剂和捕捉试剂，芯片的捕获区内具有至少3个6*7的矩形点阵，捕获区喷点体积小、浓度高，能精准制作芯片，使该芯片的重复性好，灵敏度较高。
(3)本发明提供的PCT微流控荧光芯片具有多个液体检测监控区域，在两个混合区下方设置两个监测点11，在示踪区左右两侧的上方设置两个监测点，保证样本在芯片流动过程中不出现气泡等干扰实验结果。
(4)本发明提供的PCT微流控荧光芯片样本混合、反应、分离和检测功能集成于一个芯片上，易生产制备通过与Response IQ联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差，可以满足随时随地检测。
(5)本发明提供的PCT微流控荧光芯片适用于全血、血浆、血清等血基质样本，适用范围广，有助于即时诊断。
(6)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，检测时间为10min,大大的缩短了检测时间，适用于急诊使用。
(7)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，只需要50μL血液就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。
(8)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，测试完废弃样本储存在密闭的芯片中，不存在生物污染的情况，具有生物安全性。
(9)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，使用高质量单抗抗干扰能力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。
(10)本发明提供的PCT微流控荧光芯片，配套Response IQ系统，体积小，使用场景限制少，适用于床旁诊断和预后监控。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (1)

1.一种快速定量检测全血中PCT的微流控荧光免疫芯片，包括中心板和底板，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合，样本流道与测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有用于溶解示踪试剂的示踪区、两个样本混合区域、液体检测监控区域、样本流道端部有样本废料区域，在测量格对应位置的中心板上设置捕获区；其特征在于，
所述芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂包括用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的PCT单克隆抗体和用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的质控物；
捕获试剂包括PCT单克隆抗体和质控物单克隆抗体；
所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴350pL的液滴喷在芯片的捕获区内，喷点形成5个等间距的6*7矩形点阵，喷点不相互重合；捕获区PCT单克隆抗体的浓度为0.75mg/mL；捕获区质控物单克隆抗体的浓度为0.75mg/mL；
所述荧光染料为Cy5花菁染料；所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，示踪剂体积为6μL；所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的PCT单克隆抗体浓度为0.75μg/mL；所述示踪区质控物浓度为0.25μg/mL；
所述示踪试剂还包括动物蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述捕获试剂还包括缓防腐剂和缓冲液；
动物蛋白为质量百分比浓度为3.5％的牛血清白蛋白，表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的Triton X-100，异嗜性抗体阻断剂浓度为40μg/mL，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠，缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液；
示踪试剂中Cy5标记的PCT单克隆抗体的制备方法是：
(1)将PCT单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析；
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液；
(3)向Cy5荧光素溶液中加入NHS/EDC，活化1.5h；
(4)向步骤(1)处理后的PCT单克隆抗体中加入步骤(3)制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比PCT单克隆抗体的摩尔比为8:1，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；
所述示踪试剂中Cy5标记的质控物的制备方法是：
(1)采用10mM PBS缓冲液配制5～10mg/mL的BSA溶液；
(2)向BSA溶液中加入SMCC，活化1h；
(3)用PD10柱子纯化可得活化的BSA溶液；
(4)向步骤(3)活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比1.5:1投料，混匀，室温反应2-8h；然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mg/mL，得到浓缩液；
(5)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的Cy5荧光素溶液；
(6)向Cy5溶液中加入NHS/EDC，活化1h；
(7)向步骤(4)浓缩液中加入步骤(6)制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1投料，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；
芯片与Response IQ联用，芯片最小检测限不高于0.05ng/mL，检测范围为0.05～50ng/mL，芯片检测样本的体积为50μL，检测时间为10min；批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％。
CN202010183580.8A 2020-03-17 2020-03-17 一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片 Active CN111308102B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010183580.8A CN111308102B (zh) 2020-03-17 2020-03-17 一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010183580.8A CN111308102B (zh) 2020-03-17 2020-03-17 一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111308102A CN111308102A (zh) 2020-06-19
CN111308102B true CN111308102B (zh) 2024-01-09

Family

ID=71149787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010183580.8A Active CN111308102B (zh) 2020-03-17 2020-03-17 一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111308102B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103154706A (zh) * 2010-07-26 2013-06-12 德赛诊断系统有限公司 用于通过在消逝场中的激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子的测量盒和测量设备
CN103212456A (zh) * 2012-01-20 2013-07-24 奥索临床诊断有限公司 具有增加的灵敏度的小体积测定装置
CN108387564A (zh) * 2018-02-08 2018-08-10 南京岚煜生物科技有限公司 基于微流控芯片的降钙素原检测试剂盒及制备和检测方法
CN108519373A (zh) * 2018-04-27 2018-09-11 广州万孚生物技术股份有限公司 一种化学发光微流控芯片及含其的分析仪器
CN108872581A (zh) * 2018-07-03 2018-11-23 江苏恒易生物科技有限公司 同时检测超敏crp、脂蛋白磷脂酶a2和d-二聚体的荧光免疫层析试剂盒及制备方法
CN109211867A (zh) * 2018-11-17 2019-01-15 郑州亲和力科技有限公司 一种快速定量检测bnp的微流控荧光免疫芯片
CN110208549A (zh) * 2019-07-01 2019-09-06 北京利德曼生化股份有限公司 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白sST2发光试剂盒
CN110244036A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100386627C (zh) * 2001-07-03 2008-05-07 包刚 过滤型蛋白芯片
US20060008895A1 (en) * 2004-07-08 2006-01-12 Hsiu-Mei Chen Microarray chip for detection of immunoglobulin

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103154706A (zh) * 2010-07-26 2013-06-12 德赛诊断系统有限公司 用于通过在消逝场中的激发之后测量荧光放射来检测液体样本中的目标分子的测量盒和测量设备
CN103212456A (zh) * 2012-01-20 2013-07-24 奥索临床诊断有限公司 具有增加的灵敏度的小体积测定装置
CN108387564A (zh) * 2018-02-08 2018-08-10 南京岚煜生物科技有限公司 基于微流控芯片的降钙素原检测试剂盒及制备和检测方法
CN108519373A (zh) * 2018-04-27 2018-09-11 广州万孚生物技术股份有限公司 一种化学发光微流控芯片及含其的分析仪器
CN108872581A (zh) * 2018-07-03 2018-11-23 江苏恒易生物科技有限公司 同时检测超敏crp、脂蛋白磷脂酶a2和d-二聚体的荧光免疫层析试剂盒及制备方法
CN109211867A (zh) * 2018-11-17 2019-01-15 郑州亲和力科技有限公司 一种快速定量检测bnp的微流控荧光免疫芯片
CN110208549A (zh) * 2019-07-01 2019-09-06 北京利德曼生化股份有限公司 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白sST2发光试剂盒
CN110244036A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111308102A (zh) 2020-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106872420B (zh) 一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法
JP4383860B2 (ja) バイオセンサ、及び測定方法
CN111308098B (zh) 一种快速定量检测全血中sST2的微流控荧光免疫芯片
JP5714912B2 (ja) プロゾーン現象検出方法、分析方法、プロゾーン現象検出装置および分析装置
US20110097740A1 (en) Real-time continuous detection device
CN106053794A (zh) 一种用于准确检测待测物的试剂卡、试剂盒和用途
US20210156856A1 (en) Systems, devices, and methods for amplifying signals of a lateral flow assay
CN102967706A (zh) 检测肿瘤标志物流动注射化学发光免疫传感器的制备及应用
CN106370848A (zh) 免疫侧向层析检测系统及其制备方法
CN111337662A (zh) 一种基于微流控芯片的快速免疫检测方法
CN109725162A (zh) 一种完全均相测定胰岛素的检测试剂盒及其方法
CN108828231A (zh) 一种心肺功能标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法
CN111351924B (zh) 一种基于酶诱导磷酸根离子激活的近红外荧光免疫分析试剂盒及检测方法
CN113433329A (zh) 基于量子点荧光微球的pct/il-6二联检测试剂盒及其制备方法
CN111308102B (zh) 一种快速定量检测全血中pct的微流控荧光免疫芯片
CN112305230A (zh) 一种定量检测降钙素原的免疫层析试纸条及其定量检测方法
Xu et al. Multiplex biomarker analysis biosensor for detection of hepatitis B virus
CN111308101B (zh) 一种快速定量检测全血中bnp的微流控荧光免疫芯片
CN102095868A (zh) 甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒
CN111308099B (zh) 一种快速定量检测全血中cTnI的微流控荧光免疫芯片
CN108845146A (zh) 一种用于心肌五项标志物检测的生物芯片、检测方法
CN210323044U (zh) Il-6/pct联合检测时间分辨检测卡及试剂盒
CN113125761A (zh) 用于降钙素原检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
CN111521787A (zh) 新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡及其制备方法
CN101173923B (zh) 一种检测抗体亲和力的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant