CN111308086A - 一种检测可溶性st2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途 - Google Patents

一种检测可溶性st2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两种抗人ST2单克隆抗体：所述第一抗人ST2单克隆抗体为ST2‑4F12抗体，包括重链和轻链，所述ST2‑4F12的重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同；ST2‑4F12的轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同；所述第二抗人ST2单克隆抗体为ST2‑2D1抗体，包括重链和轻链，所述ST2‑2D1的重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.3相同；ST2‑2D1的轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.4相同。本发明还公开了其用途。本发明的试剂盒能够有效检测可溶性ST2含量，为后续的质量发挥作用。

Description

一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途。
背景技术
心力衰竭(Heart Failure,HF)简称心衰，其主要是指由于各种原因引起心肌损伤时，导致心脏的收缩舒张功能发生障碍，不能将静脉中的回心血量充分射出心脏，从而使静脉系统中血液淤积以及动脉系统中血液充盈不足，进而引起心脏循环障碍的临床综合征。近年来随着IL-33/ST2信号传导途径的发现，生长刺激表达基因2蛋白ST2作为新的心衰检测指标引起了人们的注意。
生长刺激表达基因2蛋白ST2(IL1RL1或IL-1R),是白介素1受体家族成员之一。目前影响心脏疾病相关的ST2有可溶性(sST2)和跨模型(ST2L)。研究表明，当sST2浓度低时，ST2L可与ST2的功能性配体IL-33结合对心脏有保护作用，当sST2浓度高时，sST2可竞争性与IL-33结合，导致ST2L与IL-33结合减少，从而阻断ST2L/IL-33信号转导途径，进而抑制IL-33抗心肌细胞肥大、抗动脉粥样硬化和抗组织纤维化，降低心脏的功能并增加心脏发生病变的机率，如心肌肥厚、心脏射血分数下降和心房心室扩张等类似于急性心肌梗死或者严重心力衰竭后的心肌重构。
另外据文献报道ST2也可作为反映冠脉易损程度的炎症标志物在急性冠状动脉综合症发生发展中发挥重要作用。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的目的之二在于所述试剂盒的检测方法，其检测方法主要在于检测所述可溶性ST2含量。
本发明的目的之三在于所述试剂盒的用途。
为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：
一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括两种抗人ST2单克隆抗体：
所述第一抗人ST2单克隆抗体为ST2-4F12抗体，包括重链和轻链，所述ST2-4F12的重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWLKQRPGQGLEWIGAIYPGDGVTTYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLAFEDSAVYYCARRGLTEDHWGQGTTLTVSS；
ST2-4F12的轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTHFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK；
所述第二抗人ST2单克隆抗体为ST2-2D1抗体，包括重链和轻链，所述ST2-2D1的重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.3相同，具体如下：
EVQLKQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWHWIRQFPGNKLEWMGYITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSNNLFFLQLNSVTTEDTATYYCAYRYDWDFDVWGAGTTVTVSS；
ST2-2D1的轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.4相同，具体如下：
DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNHLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLTVYYCKQSYILYTFGGGTKLEIK。
为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：
一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒的用途，其中，所述用途为用于检测可溶性ST2含量。
本发明的有益效果在于：
本发明的试剂盒能够有效检测可溶性ST2含量，为后续的质量发挥作用。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测样品中可溶性ST2的含量示意图。
图2为市售试剂盒检测检测结果的相关性示意图。
具体实施方式
实施例1：
抗人ST2单克隆抗体杂交瘤细胞的制备：
1.1小鼠的免疫
使用融合重组蛋白对BALB/c小鼠进行四次免疫，间隔时间为21天，在第四次免疫之后5-7天后采取小鼠的眼眶血并测定效价，效价较好时则再次进行加强免疫。
1.2滋养层细胞的培养
1.2.1在融合实验开始的前一天，取周龄6周以上的BALB/c小鼠，脊椎脱臼处死后将其放入盛满75％酒精的烧杯中浸泡2分钟。
1.2.2在无菌超净台中取出小鼠的脾脏并置于200目无菌不锈钢筛网中，通过研磨获得单细胞悬液。经1640基础培养基离心重悬清洗两次后，用适量含15％FBS的1640培养基再次重悬细胞，使用无菌巴氏玻璃吸管将细胞液均匀滴入96孔培养板中，每孔的体积约为80ul，最后将培养板放于培养箱中过夜培养，培养条件为37摄氏度及5％的CO2浓度。
1.3细胞融合及筛选
1.3.1采用颈椎脱臼的方法处死免疫后的小鼠，置于装满75％酒精的烧杯中浸泡2min。
1.3.2在无菌操作台中取出小鼠的脾脏，于200目的无菌筛网中进行研磨以此来获得单细胞悬浮液，之后用37℃预热的1640基础培养基依照1400rpm/5min的条件离心重悬清洗2次。
1.3.3收集生长良好且处于生长对数期的sp2/0细胞，同样用预热的1640基础培养基依照1400rpm/5min的条件离心重悬清洗2次。
1.3.4将清洗后的脾脏细胞和sp2/0细胞按大约5:1的比例在离心管中混匀，并加入预热的1640基础培养基充分混匀，之后1400rpm/5min的条件离心一次，弃上清后用手指轻弹管底来混匀两种细胞。
1.3.5将装有混匀细胞的离心管放于37℃条件下水浴加热，并逐滴加入1ml已预热过的PEG溶液，期间不停轻轻震荡离心管，使融合过程更加有效。
1.3.6PEG溶液加完后，匀速滴入14ml 1640基础培养基来终止融合过程。将离心管置于37℃培养箱中静置10min后800rpm/5min条件下离心，弃上清液。
1.3.7加入预热的1640全培养基轻柔重悬融合后的细胞，用灭菌的5ml巴氏玻璃吸管均匀滴加到含有滋养层细胞的96孔培养板中，每孔大约80ul/孔，之后放于37℃,5％CO2培养箱中培养，每隔3-4天用HT培养基进行换液，共进行两次换液，之后每孔取少量上清液进行ELISA检测。
1.3.8挑选检测值较高的孔进行亚克隆，每次亚克隆后都进行ELISA检测，通常经过3-4次亚克隆后才能获得稳定分泌抗体表型的细胞，并对最后一次亚克隆后的细胞进行冻存。
实施例2：
抗人ST2单克隆抗体轻重链可变区序列的测定：
测定抗人ST2单克隆抗体重链和轻链可变区的方法包括以下步骤：
2.1杂交瘤细胞cDNA的获取
从获取的杂交瘤细胞中提取RNA，通过RT-PCR技术将获得的RNA反转录为cDNA。利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)。
2.2重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJET cloningvector)连接，连接的产物转化至感受态细菌(DH5a)，因为pJET克隆载体含有氨苄抗性基因(Amp+)，所以可将转化后的菌液均匀涂布于Amp抗性的LB固体培养基上，放于培养箱中，37℃条件下过夜培养。
2.3挑选培养基上边缘清晰、生长良好的菌落进行测序鉴定。
2.4根据测序结果保留候选的轻重链可变区序列，再次通过PCR克隆出可与表达载体连接的轻链和重链的可变区序列，并将PCR产物与提前用双酶切处理的线性表达载体连接，连接后的产物转化至DH5a，由于表达载体中含有卡那霉素抗性基因(Kana+)，因此可将转化后的菌液均匀涂布于Kana抗性的LB固体培养基上，置于培养箱中，37℃条件下过夜培养。
2.5挑选生长良好的细菌测序，并对比两次测序结果从而得到具有正确的序列的转化细菌，通过扩大培养后进行质粒抽提。
2.6将连有当克隆抗体重链和轻链可变区基因的表达载体一起共同转染真核表达细胞293。293细胞用无血清培养基SFM4Transfx-293 without L-Glutamine悬浮培养，在转染时培养基替换为无血清培养基
Figure BDA0002389097990000051
FreeStyleTM293 Expression Medium。连续培养一周后收取上清培养液离心(5000rpm 20min)，得到的上清液用0.22um过滤膜过滤除菌。
2.7利用ELISA试剂盒检测含有目的抗体的上清液，结果显示良好。
通过上述方法来获得抗人ST2-4F12单克隆抗体重链可变区：
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWLKQRPGQGLEWIGAIYPGDGVTTYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLAFEDSAVYYCARRGLTEDHWGQGTTLTVSS
ST2-4F12单克隆抗体轻链可变区
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTHFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK
ST2-2D1单克隆抗体重链可变区
EVQLKQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWHWIRQFPGNKLEWMGYITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSNNLFFLQLNSVTTEDTATYYCAYRYDWDFDVWGAGTTVTVSS
ST2-2D1单克隆抗体轻链可变区
DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNHLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLTVYYCKQSYILYTFGGGTKLEIK
本发明从表达抗人ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取到抗体的重链和轻链的可变区，根据测序结果保留候选的轻重链可变区序列，并通过PCR扩增出与表达载体匹配的轻重链可变区序列，连接PCR产物与双酶切预处理的表达载体，之后转化至感受态细菌DH5a。将连有目的单抗轻链和重链可变区的表达载体共同转染真核表达细胞株293，收取培养后的上清含有目的抗体，说明得到的重链和轻链可变区序列是正确的。
实施例3：
一种检测可溶性ST2含量的ELISA试剂盒的检测方法：
3.1试剂盒的组成
本发明的ELISA试剂盒包括包被于酶标板上的实施案例1中制备的ST2包被抗体(ST2-2D1)、经生物素标记的ST2检测抗体(ST2-4F12)、可溶性ST2蛋白标准品(R&DSystems)、辣根过氧化物酶(HRP)、样本稀释液、洗涤液(PBST)、显色液(TMB)及终止液组成。
3.2样本的采集及处理
采用正确的医用技术收集一批医院心衰病人的血清，收集后的血清样本如在8h内不能检测则放置于4℃冰箱低温保存，如果需要72h以上时间保存或运输，应将样本-20℃冻存，并避免反复冻融。检测前提前将样本常温放置半小时，并震荡混匀，取适量病人血清用样本稀释液稀释至50倍。
3.3可溶性ST2含量的测定方法
3.3.1 Na2CO3和NaHCO3组成的包被液稀释包被抗体ST2-2D1(1ug/ml),在96孔酶标板中各加入100ul,4℃过夜，使包被抗体与酶标板紧密结合。
3.3.2包被后用洗涤液(PBST)洗板3次，每孔加入100ul的3％牛血清封闭液37℃条件下封闭1h。封闭结束后甩干，并加入稀释好的待测血清样品以及梯度稀释好的可溶性ST2蛋白标准品(从2ng/ml开始对比稀释，共设置7个浓度，最后一空加样品稀释液为空白对照，每个梯度做3个重复)，加液体积为100ul/孔，室温条件下75rpm震荡孵育1h。
3.3.3 PBST洗板三次甩干，接着加入生物素标记的检测抗体ST2-4F12，100ul/孔，室温条件下75rpm震荡孵育1h。
3.3.4 PBST洗板三次甩干，加入辣根过氧化物酶(HRP)，100ul/孔，室温条件下75rpm震荡孵育1h。
3.3.5 PBST洗板六次甩干，加入显色液TMB，100ul/孔，室温震荡孵育10min，之后加入终止液(100ul/孔)终止颜色反应，通过酶标仪测定每孔的OD450值。
3.3.6以ST2标准品浓度乘以样品稀释倍数(×50)的值为纵坐标，以相应测得的OD450值为横坐标制作标准曲线(如图1)，并得到计算公式，根据待测样品的OD450值计算出样品中可溶性ST2的含量。
本发明试剂盒按照方法学鉴定，可达到以下指标：
标准曲线线性：R2>0.9990
准确度：添加率82％
最低检测限≤2.14pg/ml
重复性：变异系数<5％
3.3.7将14份血清样本测值与市售可溶性生长刺激表达基因2蛋白检测试剂盒A对比，比较本发明试剂盒与市售试剂盒检测检测结果的相关性,结果如图2所示。
由本发明的数据及图2可知，本发明的标准曲线线性R2>0.9990，而现有技术的市售试剂盒的标准曲线仅为R2＝0.9312，由此可见本发明的试剂盒与现有市售试剂盒相比，检测精度更高，对后期的数据采集等工作的辅助性更强。
序列表
<110> 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司
<120> 一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途
<130> YHPI2000007
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Val Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Leu Thr Glu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Glu Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn Leu Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Arg Tyr Asp Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Thr Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ile Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (2)

1.一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两种抗人ST2单克隆抗体：
所述第一抗人ST2单克隆抗体为ST2-4F12抗体，包括重链和轻链，所述ST2-4F12的重链可变区（mVH）的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWLKQRPGQGLEWIGAIYPGDGVTTYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLAFEDSAVYYCARRGLTEDHWGQGTTLTVSS；
ST2-4F12的轻链可变区（mVL）的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTHFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK；
所述第二抗人ST2单克隆抗体为ST2-2D1抗体，包括重链和轻链，所述ST2-2D1的重链可变区（mVH）的氨基酸序列与SEQ ID NO.3相同，具体如下：
EVQLKQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWHWIRQFPGNKLEWMGYITYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSNNLFFLQLNSVTTEDTATYYCAYRYDWDFDVWGAGTTVTVSS；
ST2-2D1的轻链可变区（mVL）的氨基酸序列与SEQ ID NO.4相同，具体如下：
DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNHLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLTVYYCKQSYILYTFGGGTKLEIK。
2.如权利要求1所述的一种检测可溶性ST2含量的酶联免疫检测试剂盒的用途，其特征在于，所述用途为用于检测可溶性ST2含量。
CN202010108213.1A 2020-02-21 2020-02-21 一种检测可溶性st2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途 Active CN111308086B (zh)

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