CN111304201A - 一种降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA及其应用。本发明通过构建含有膜性细胞器标志蛋白稳定表达的细胞系，利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体找到乙脑病毒的膜性复制位点，然后利用siRNA对乙型脑炎病毒基因组的复制位点进行RNA干扰，通过检测比对RNA干扰前后的乙型脑炎病毒的病毒RNA水平以及病毒滴度，验证得到降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA，并通过深入探究乙型脑炎病毒基因组的复制位点，为找到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点提供参考。

Description

一种降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及能诱导RNA干扰的小干扰RNA(siRNA)，特别是一种降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA，及其设计方法和用途。
背景技术
真核生物细胞内部的结构十分复杂，其内含有许多膜包被的结构，如内质网膜、高尔基体膜和溶酶体膜等，它们共同构成了细胞的内膜系统。在真核细胞进行生理活动过程中，细胞内部各个膜结构之间以及细胞与细胞之间时时刻刻都在进行着物质与信息的交流。内膜系统构成了细胞及细胞器之间的天然屏障,保证重要的生命活动在相对独立的空间内进行。细胞内的膜性细胞器之间的物质运输(如蛋白质、脂类),主要是通过囊泡完成的。囊泡的表面通常包被一层蛋白,因此也称为包被囊泡。根据囊泡外面包被的蛋白不同,可将转运囊泡分为两类:一类为网格蛋白包被囊泡，主要负责从高尔基转运货物到细胞内体、溶酶体,也负责细胞膜与膜性细胞器之间的物质转运；另一类包被囊泡被细胞质中的蛋白包被,称为COP。根据功能不同分为COPI和COPII,COPI主要负责将蛋白从高尔基体逆向转运至内质网,而COPII负责将蛋白从内质网转运到高尔基体。
日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，简称乙脑，是一种中枢神经系统疾病，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus,JEV)引起的一种蚊媒性人兽共患传染病，可造成不可逆的神经损害。日本乙型脑炎病毒是黄病毒科黄病毒属的成员之一。其基因组为单股正链RNA分子，长约11kb。整个基因组包括5非编码区，一个单一的开放阅读框和3非编码区所构成。该基因组编码三个结构蛋白：衣壳蛋白C，膜蛋白M和囊膜蛋白E，七个非结构蛋白NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5。研究表明，许多正链RNA病毒，如EV71和柯萨奇病毒，它们在病毒基因组复制的过程中会使包括高尔基体在内的膜性细胞器破碎，从而造成内膜系统发生重新排列，进而利用膜性结构进行基因组复制或躲避宿主细胞的监控。还有某些细菌会阻止或促进细胞内的囊泡运输，形成密集的膜性结构，躲避宿主细胞的清除。种种研究结果表明，宿主细胞的内膜系统无论是对宿主本身还是入侵的病原微生物，都发挥着重大的生理作用。作为正链RNA病毒的乙型脑炎病毒是否利用内膜系统作为膜复制位点，究竟利用哪些膜结构作为膜复制位点，通过乙型脑炎病毒基因组的复制位点的研究，有助于快速定位到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点。
RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术是作为一种由双链RNA或微RNA介导的高效特异性强的基因阻断技术。2001年Thomas Tuschl团队发现外源合成的siRNA导入体内后可诱导哺乳动物体内的RNAi作用，这项发现引发了利用可控制的RNAi来进行生物医学研究与药物开发的方法，在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值。
有鉴于此，本发明设想通过构建含有膜性细胞器标志蛋白稳定表达的细胞系，利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体找到乙脑病毒的膜性复制位点，然后利用siRNA对乙型脑炎病毒基因组的复制位点进行RNA干扰，通过检测比对RNA干扰前后的乙型脑炎病毒的病毒RNA水平以及病毒滴度，深入探究乙型脑炎病毒基因组的复制位点，同时期望找到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA，其设计方法和用途，以及一种判断乙型脑炎病毒基因组复制位点的方法。
本发明第一方面提供一种降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点，所述的干扰靶位点包括内质网、溶酶体、COPI囊膜蛋白、ERGIC53中的一种或多种。
在本发明一实施例中，所述COPI囊膜蛋白的干扰靶位点包括ARF1。
在本发明一实施例中，所述溶酶体的干扰靶位点包括LAMP1。
本发明第二方面提供一种降低乙型脑炎病毒感染的siRNA，所述siRNA的核苷酸编码序列选自以下1)-3)的序列：
1)SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列；
2)与SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列中任一序列的同源性性至少为70％的序列；
3)经过改造的选自1)或2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多50个核苷酸的序列。
在本发明一实施例中，所述步骤2)的同源性优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％或98％。
在本发明一实施例中，所述步骤3)中添加的核苷酸个数为至多50个，优选至多40个，更优选至多30个，更优选至多20个，最优选至多10个。
本发明第三方面提供一种重组载体，其可操作地连接有本发明第二方面所述的siRNA的核苷酸编码序列。
本发明第四方面提供一种组合物，其含有本发明所述的诱导RNA干扰的分子或者重组载体，以及药学上可接受的载体。
本发明第五方面提供一种降低乙型脑炎病毒感染的方法，包括以下步骤：
根据本发明第一方面所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点设计并制备siRNA，使所得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触，进而干扰乙脑病毒基因的表达，降低乙型脑炎病毒感染；其中，使所得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触包括：1)采用药学上可接受的载体运载siRNA，使得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触；和/或2)通过重组有编码siRNA的DNA序列的表达载体转染细胞，在细胞内表达siRNA，使得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触。
本发明第五方面一实施例中，本发明提供了一种降低乙型脑炎病毒感染的方法，包括以下步骤：
(1)根据本发明第一方面所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点设计并合成siRNA序列；
(2)将步骤(1)所得的siRNA序列连接到表达载体中，将载体导入细胞以表达siRNA分子，从而干扰乙脑病毒基因的表达，实现降低乙型脑炎病毒感染。
在本发明一实施例中，所述的干扰靶位点包括内质网、溶酶体、COPI囊膜蛋白、ERGIC53中的一种或多种。
在本发明一实施例中，所述COPI囊膜蛋白的干扰靶位点包括ARF1。
在本发明一实施例中，所述溶酶体的干扰靶位点包括LAMP1。
在本发明一实施例中，所述步骤(1)的siRNA的核苷酸编码序列选自以下1)-3)的序列：
1)SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列；
2)与SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列中任一序列的同源性性至少为70％的序列；
3)经过改造的选自1)或2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多50个核苷酸的序列。
在本发明一优选实施例中，所述步骤2)的同源性优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％。
在本发明一优选实施例中，所述步骤3)中添加的核苷酸个数为至多50个，优选至多40个，更优选至多30个，更优选至多20个，最优选至多10个。
本发明第六面提供一种判断乙型脑炎病毒基因组复制位点的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有膜性细胞器标志蛋白稳定表达的细胞系；其中，所述膜性细胞器标志蛋白包括但不限于内质网标志蛋白、溶酶体标志蛋白、COPI囊膜蛋白、ERGIC53中的一种或多种；
(2)利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体，激光共聚焦寻找乙脑病毒膜复制位点。
本发明第七面提供一种判断能降低乙型脑炎病毒基因组感染的siRNA的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有膜性细胞器标志蛋白稳定表达的细胞系；其中，所述膜性细胞器标志蛋白包括但不限于内质网标志蛋白、溶酶体标志蛋白、COPI囊膜蛋白、ERGIC53中的一种或多种；
(2)利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体，激光共聚焦寻找乙脑病毒膜复制位点；
(3)利用siRNA对乙型脑炎病毒基因组的复制位点进行RNA干扰；
(4)检测比对RNA干扰前后的乙型脑炎病毒的病毒RNA水平以及病毒滴度。
在本发明第六或第七方面一实施例中，所述COPI囊膜蛋白包括ARF1，所述溶酶体标志蛋白包括LAMP1。
在本发明第六或第七方面一实施例中，所述步骤(1)的细胞系通过gateway过表达系统构建稳定表达各个膜性细胞器且带有荧光标签标志蛋白。
在本发明第六或第七方面一实施例中，所述步骤(2)通过利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体找到乙脑病毒的膜性复制位点。
在本发明第六或第七方面一实施例中，所述步骤(3)的siRNA，其核苷酸编码序列选自以下1)-3)的序列：
1)SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列；
2)与SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列中任一序列的同源性至少为70％的序列；
3)经过改造的选自1)或2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多50个核苷酸的序列；
在本发明第六或第七方面一优选实施例中，所述步骤2)的同源性优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％或98％。
在本发明第六或第七方面一优选实施例中，所述步骤3)中添加的核苷酸个数为至多50个，优选至多40个，更优选至多30个，更优选至多20个，最优选至多10个。
本发明第八方面提供如本发明第一方面所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点、如本发明第二方面所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA、如本发明第三方面所述的重组载体、如本发明第四方面所述的组合物、如本发明第五方面所述的降低乙型脑炎病毒感染的方法、如本发明第六方面所述的判断乙型脑炎病毒基因组复制位点的方法或如本发明第七方面所述的判断能降低乙型脑炎病毒基因组感染的siRNA的方法在制备预防/诊断/治疗乙型脑炎病毒疾病药物中的应用。
本发明通过通过构建含有膜性细胞器标志蛋白稳定表达的细胞系，利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体找到乙脑病毒的膜性复制位点，然后利用siRNA对乙型脑炎病毒基因组的复制位点进行RNA干扰，通过检测比对RNA干扰前后的乙型脑炎病毒的病毒RNA水平以及病毒滴度，深入探究乙型脑炎病毒基因组的复制位点，同时为找到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点提供参考。
附图说明
图1为本发明实施例提供的细胞器标志蛋白与乙脑病毒复制复合体共定位分析的激光共聚焦结果图，A-J是各细胞器标志蛋白与乙脑病毒复制复合体共定位分析；
图2为本发明实施例提供的ARF1与sec24d的siRNA干扰效率及乙脑病毒RNA水平的检测结果图；
图3为本发明实施例提供的使用siRNA干扰ARF1及sec24d后对乙脑病毒滴度影响的结果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
1通过gateway过表达系统构建稳定表达各个膜性细胞器且带有荧光标签标志蛋白的hela细胞系。由于gateway系统是基于噬菌体位点特异重组系统(attB+attP→attL+attR),所以我们首先构建目的基因入门载体质粒PENTER，然后通过重组反应构建目的基因表达载体质粒plenti-DEST。
1)构建基因入门载体质粒PENTER
根据NCBI上各个基因的序列，设计含有BglII和XhoI双酶切位点的目的基因引物，部分目的基因(RAB6A、Giantin-C1、Sec24d、ERGIC53)的引物序列如图下图表所示：
Bgl II-Rab6-F TATTCGTCTCAGATCTATGGTGAGCAAGGGC(SEQ ID NO.1)
Xho I-Rab6-R TATTCGTCTCTCTAGATTAGCAGGAACAGCC(SEQ ID NO.2)
Bgl II-Giantin-F TATTCGTCTCAGATCTATGGTGAGCAAGGGC(SEQ ID NO.3)
Xho I-Giantin-R TATTCGTCTCTCTAGACTATAGATGGCCCGT(SEQ ID NO.4)
Bgl II-SEC24D-F TATTGGTCTCAGATCTATGGTGAGCAAGGGC(SEQ ID NO.5)
Xho I-SEC24D-R TATTGGTCTCTCTAGATTAATTAAGCAGCTG(SEQ ID NO.6)
Bgl II-ERGIC53-F TATTCGTCTCAGATCTATGGTGAGCAAGGGC(SEQ ID NO.7)
Xho I-ERGIC53-R TATTCGTCTCTCTAGATCAAAAGAATTTTTTGGC(SEQ ID NO.8)
可以理解的是，本发明实验人可以根据现有公知技术，根据NCBI上公布的基因序列，设计出其它含有BglII和XhoI双酶切位点的目的基因引物(LC3、GM130、RAB7、LAMP1、GalT、Calnexin)。
将扩增产物双酶切后连到同样双酶切的PENTER入门质粒上，连接产物转化到Stb13感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，37℃培养过夜，菌液PCR挑取正确的阳性克隆，测序结果无误后命名。
正确的菌液按1：500接种于含有卡纳抗性的液体LB培养基中，置于37℃摇床，180r/min振荡培养14-16小时，随后使用E.Z.N.A.Endo-free plasmidMidi Kit II去内毒素试剂盒进行质粒抽提，命名。
2)构建基因表达载体质粒plenti-DEST
按照赛默飞公司GatewayTMLR ClonaseTMII Enzyme Mix试剂盒说明书进行重组反应，重组后的产物转化到Stb13感受态细胞，37℃培养过夜，菌液PCR挑取正确的阳性克隆，测序结果无误后命名。
正确的菌液按1：500接种于含有卡纳抗性的液体LB培养基中，置于37℃摇床，180r/min振荡培养14-16小时，随后使用E.Z.N.A.Endo-free plasmidMidi Kit II去内毒素试剂盒进行质粒抽提，命名。
3)慢病毒包装
将6μg plenti-DEST目的基因表达质粒、6μg psPAX2和3μgpMD2.G辅助质粒共转染到培养有70％～80％单层HEK293T细胞的60mm细胞培养皿中，转染48h后收集细胞上清，得到含有慢病毒的病毒液。
4)细胞株的筛选
将所收慢病毒接种于生长密度约50％的单层hela细胞(6孔细胞培养板)，24h后，加入该细胞系最优有效浓度的嘌呤霉素(1-1.5μg/mL)，继续培养至细胞长满后传代。利用嘌呤霉素筛选传代细胞，每48h更换一次新鲜的含嘌呤霉素的培养液，筛选3～5代。
2、激光共聚焦寻找乙脑病毒膜复制位点
(1)铺板：将稳定表达各细胞器标志蛋白的hela细胞以约105个/mL的细胞密度接种至铺有无菌玻片的24孔细胞培养板，每孔500μL。置于5％CO2、37℃细胞培养箱中培养过夜。
(2)固定、通透和封闭：吸弃上清，加入500μL4℃预冷的4％多聚甲醛，室温固定30min；弃4％多聚甲醛后加入PBS洗涤3次，每次3min；加入含0.1％Triton X-100的通透液室温孵育30min；加入5％的BSA或脱脂乳进行封闭，37℃湿盒孵育1h；弃封闭液后，加入PBS洗涤3次，每次3min。
(3)免疫反应：加入1：1000倍稀释的JZ抗体，37℃湿盒孵育2h；以PBS洗涤3-5次，每次3min；加入1：1000稀释的或Alexa Flour 594IgG或AlexaFlour 647IgG，混匀后每孔加入200μL，37℃湿盒避光孵育45-60min；PBS洗涤3-5次，每次3min。
(4)染核：将DAPI按1：1000进行稀释后加入细胞中，每孔加入100μL，室温5min；以PBS洗涤3-5次，每次3min。
(5)制片：滴5μL抗荧光淬灭剂于载玻片上，用防静电镊子轻轻取出玻片，细胞生长面向下，轻轻放到载玻片上，使两层玻片中间没有气泡，以中性树脂封闭玻片周围，晾干后4℃冰箱保存，于一周以内置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
结果如图1所示，乙型脑炎在基因组复制过程中复制复合体与RAB6A，ERGIC53和LAMP1存在共定位现象，而与sec24d没有任何共定位，具体结果如下：
Figure BDA0002388546310000081
3、干扰COPI和COPII对JEV SA14在hela上基因组复制的影响
依据步骤2所得结果，我们初步怀疑乙脑病毒利用ERGIN53、溶酶体和COPI膜结构作为复制结构，为了进一步验证我们的结果，我们进行siRNA分别干扰COPI形成时的重要蛋白ARF1及COPII的结构蛋白sec24d，从而阻碍COPI和COPII结构，看其对乙脑病毒复制以及生命周期的影响。
siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成，其核苷酸编码序列如下表所示：
名称 sirna(5’-3’)
si-h-sec24d_001 ucguucaucaguugagauc(seq id no.9)
si-h-sec24d_002 guacucuugacaucuaacg(seq id no.10)
si-h-arf1_001 ucugucauugcuguccacc(seq id no.11)
si-h-arf1_002 uccacguugaagccuaugg(seq id no.12)
1)siRNA转染：
准备两个1.5mL EP管，A管将2.5μL siRNA(100nM)加入150μL opti-MEM中，混匀；B管中则将2.5μL的
Figure BDA0002388546310000082
2000加入150μL opti-MEM中，充分混匀，室温静置5min。然后将A管和B管混合均匀，静置5-10min。吸去原培养基，PBS洗两遍，将含有lipo-DNA的混合溶液(约300μL)缓慢加入hela细胞的12孔板中，轻柔地晃动细胞板，使转染液体充分接触细胞，置于含5％CO2的37℃培养箱孵育，4～6h后每孔更换为37℃预热的1mL opti-MEM，继续培养。
2)沉默效率检测
siRNA转染36h后，提取细胞总RNA，反转录，Q-PCR检测ARF1和sec24d的mRNA水平，Q-PCR检测结果如图2所示，与对照组相比，ARF1和sec24d干扰效果极好；同时Q-PCR检测细胞中乙脑病毒SA14的病毒RNA水平，发现使用siRNA干扰ARF1后明显降低乙脑病毒RNA水平，而使用siRNA干扰sec24d后对乙脑病毒RNA水平影响不显著。
3)沉默ARF1和sec24d后对乙脑病毒复制的影响
铺板：将生长状态良好的hela细胞铺到12孔细胞培养板中，当细胞生长至70％～80％时即可进行后续实验。
病毒感染：参照siRNA转染的方法，36h后以1MOI的SA14病毒量接种细胞，分别于感染后24h、收集细胞获取病毒液以及细胞总RNA,暂存于-80℃冰箱。
测定：TCID50采用ICC法测定；病毒RNA用荧光定量检测。
结果如图3所示，使用siRNA干扰ARF1后明显降低乙脑病毒的滴度，而使用siRNA干扰sec24d后对乙脑病毒的滴度影响不显著。
综上，本发明提供了一种能降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA，通过使用本发明提供的siRNA成功干扰COPI形成时的重要蛋白ARF1，并通过利用Q-PCR检测细胞中乙脑病毒SA14的病毒RNA水平，发现使用siRNA干扰ARF1后明显降低乙脑病毒RNA水平，明显降低乙脑病毒的滴度，结果表明本发明提供的siRNA能有效降低乙型脑炎脑病毒的感染，为深入探究乙型脑炎病毒基因组的复制位点以及找到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点提供坚实基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种降低乙型脑炎脑病毒感染的siRNA及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattcgtctc agatctatgg tgagcaaggg c 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattcgtctc tctagattag caggaacagc c 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tattcgtctc agatctatgg tgagcaaggg c 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tattcgtctc tctagactat agatggcccg t 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tattggtctc agatctatgg tgagcaaggg c 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tattggtctc tctagattaa ttaagcagct g 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tattcgtctc agatctatgg tgagcaaggg c 31
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tattcgtctc tctagatcaa aagaattttt tggc 34
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ucguucauca guugagauc 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
guacucuuga caucuaacg 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ucugucauug cuguccacc 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uccacguuga agccuaugg 19

Claims (10)

1.一种降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点，其特征在于，所述的干扰靶位点包括内质网、溶酶体、COPI囊膜蛋白、ERGIC53中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点，其特征在于，所述COPI囊膜蛋白的干扰靶位点包括ARF1，所述溶酶体的干扰靶位点包括LAMP1。
3.一种降低乙型脑炎病毒感染的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸编码序列选自以下1)-3)的序列：
1)SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列；
2)与SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10所示序列中任一序列的同源性性至少为70％的序列；
3)经过改造的选自1)或2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多50个核苷酸的序列。
4.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体可操作地连接有如权利要求2所述的siRNA的核苷酸编码序列。
5.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有如权利要求2所述的siRNA或者如权利要求3所述的重组载体，以及药学上可接受的载体。
6.一种降低乙型脑炎病毒感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据权利要求1所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点设计并制备siRNA，使所得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触，进而干扰乙脑病毒基因的表达，降低乙型脑炎病毒感染；其中，使所得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触包括：1)采用药学上可接受的载体运载siRNA，使得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触；和/或2)通过重组有编码siRNA的DNA序列的表达载体转染细胞，在细胞内表达siRNA，使得siRNA与感染乙型脑炎病毒的细胞接触。
7.如权利要求6所述的降低乙型脑炎病毒感染的方法，其特征在于，所述步骤(1)的siRNA干扰靶位点包括ARF1、ERGIC53、LAMP1中的一种或多种。
8.一种判断乙型脑炎病毒基因组复制位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有膜性细胞器标志蛋白稳定表达的细胞系；其中，所述膜性细胞器标志蛋白包括但不限于内质网标志蛋白、溶酶体标志蛋白、COPI囊膜蛋白、ERGIC53中的一种或多种。
(2)利用dsRNA抗体靶向乙脑病毒基因组复制复合体，激光共聚焦寻找乙脑病毒膜复制位点。
9.如权利要求8所述的判断乙型脑炎病毒基因组复制位点的方法，其特征在于，所述COPI囊膜蛋白包括ARF1，所述溶酶体标志蛋白包括LAMP1。
10.如权利要求1所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA干扰靶位点、如权利要求3所述的降低乙型脑炎病毒感染的siRNA、如权利要求4所述的重组载体、如权利要求5所述的组合物、如权利要求6所述的降低乙型脑炎病毒感染的方法或如权利要求8所述的判断乙型脑炎病毒基因组复制位点的方法在制备预防/诊断/治疗乙型脑炎病毒疾病药物中的应用。
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