CN111304093A

CN111304093A - 一种制备红曲黄素c用的红曲菌及利用其制备红曲黄素c的方法

Info

Publication number: CN111304093A
Application number: CN201911338798.XA
Authority: CN
Inventors: 陈勉华; 高嘉欣; 张妍; 王路
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111304093B

Abstract

本发明提供一种制备红曲黄素C用红曲菌(Monascus.sp)，所述红曲菌的保藏编号为CGMCC No.18578。该红曲黄素C(Monascinol)具有显著的降低血脂、控制体重增加、抑制体脂肪堆积的功能。本发明还提供了一种制备红曲黄素C的方法，该方法利用所述红曲菌发酵红曲米，能以高产量获得所述红曲黄素C。

Description

一种制备红曲黄素C用的红曲菌及利用其制备红曲黄素C的方法

技术领域

本发明涉及红曲菌，尤其涉及一种制备红曲黄素C用的红曲菌及利用其制备红曲黄素C的方法。

背景技术

脂质作为细胞膜和脂蛋白的组成成分之一，主要由胆固醇和甘油三酯组成，不仅用于体内固醇类物质的合成，更能为人体提供新陈代谢所需的能量。人体内过多脂质积累会引发高脂血症。高脂血症(Hyperlipidemia,HLP)是人体血浆总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 水平明显升高，高密度脂蛋白胆固醇(HLD-C)偏低的代谢疾病，是诱发动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝等心血管疾病的关键因素。

胆固醇是生物体细胞膜的主要成分之一，同时也是所有类固醇激素的前体，对于生命活动至关重要。肝脏是胆固醇代谢的核心器官，其主要依靠多种载脂蛋白与外围组织进行胆固醇的转运。正常情况下，胆固醇的合成、吸收以及排泄保持稳态，过量的胆固醇合成或吸收会导致胆固醇代谢紊乱而引发高脂血症。甘油三酯由甘油和脂肪酸酯化而成，是血脂的主要成分，也是机体重要供能物质。甘油三酯主要有两种途径生成：磷脂酸途径和甘油一酯途径。肝细胞中主要通过磷脂酸途径合成甘油三酯，再与载脂蛋白、胆固醇等合成极低密度脂蛋白，通过血液循环运送到肝外组织储存或利用。当肝细胞中甘油三酯的合成增加、极低密度脂蛋白分泌减少及脂肪酸氧化能力降低时均可导致肝脏中甘油三酯堆积，形成非酒精性脂肪肝(NAFLD)。NAFLD 的流行与肥胖密切相关。通过饮食调节，从NAFLD发生的早期阶段介入预防是目前防止NAFLD进一步恶化的重要环节。甘油一酯途径主要在小肠中进行，人体摄入的脂肪经口腔和胃的初步消化，在小肠中被胰脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，进而被人体吸收。过量甘油三酯摄入会导致肥胖，胰脂肪酶抑制剂可抑制小肠中胰脂肪酶活性，一定程度上减少脂类物质的吸收，是药物治疗肥胖的有效途径之一。

甘油三酯和胆固醇虽为人体脂类物质的重要组成成分，过度存储将导致肥胖、心血管疾病、糖尿病等发病风险飙升。肥胖引发的血脂过高可导致动脉硬化，增加心血管疾病的风险；肥胖人群更容易出现脂肪肝；在肥胖人群中，身体中过多的脂肪还会沉积在呼吸道中，影响呼吸系统功能，使哮喘患者的症状恶化。肥胖是撬动心血管疾病、糖尿病、哮喘、非酒精性脂肪肝和骨关节炎癌症等发生的一个重要“支点”。

红曲菌(Monascus)在中国发酵食品中的应用已有上千年的历史。红曲菌发酵产物中发现的洛伐他汀(Monacolin K)，通过抑制内源性胆固醇合成起到降血脂的功效。红曲色素是红曲菌的次级代谢产物，目前文献记载的具有明确完整结构解析资料的红曲色素种类超过60种。潘子明教授等人研究发现，红曲素(Monascin：MS)和安卡红曲黄素(Ankaflavin：AK)通过抑制甘油三酯生成和促进脂肪酸β-氧化减轻了油酸诱导小鼠FL83B肝细胞的脂肪变性。方玉祥等研究发现MS和AK非竞争性抑制胰脂肪酶活性，具有潜在的抗肥胖功效。吕旭聪等发现红曲色素可改善高脂饮食Wistar大鼠肝脏中脂肪堆积，改善脂质代谢紊乱。MS和AK两种红曲黄色素具有预防机体脂肪积累，改善血脂异常的生理活性。

2008年日本发明专利JP2008-56618A首次报道了一种被命名为 Monascinol的红曲黄色素具有抗炎、防癌功能。2014年中国台湾发明专利 TW1437001B报道了一种被命名为Monascuspiloin的红曲黄色素 (TW1437001B)，它能够抑制5α-还原酶活性，减少雄性激素二氢睾固酮的生成，治疗雄性激素失调相关病症。经比较，色素Monascuspiloin与Monascinol具有相同的结构，为同一种化合物。

申请人研究发现该色素Monascuspiloin与Monascinol除了上述功能，还具有显著的降低血脂、控制体重增加、抑制体脂肪堆积的功能。并致力于进一步开发其在功能性食品或药品中的应用，但目前记载的获得上述色素的方法产量低，不利于大规模工业生产利用。

因此，如何提供一种能高产量获得上述色素方法，成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种制备红曲黄素C用红曲菌(Monascus.sp)，所述红曲菌的保藏编号为CGMCC No.18578。

本发明还提供了一种制备红曲黄素C的方法，利用所述红曲菌，能以高产量制备所述红曲黄素C。

本发明所述的红曲菌(Monascus.sp)，已于2019年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18578。

在本发明的方案中，红曲黄素C(Monascinol)与色素Monascuspiloin与Monascinol具有相同的结构，为同一物质，在本申请中，申请人命名为红曲黄素C(Monascinol)，简称MC，申请人发现其具有显著的降低血脂、控制体重增加、抑制体脂肪堆积的功能。

本发明提供的一种制备红曲黄素C的方法，其利用所述的红曲菌对原料进行发酵。

进一步的，所述原料为大米。本发明方案对于大米的来源没有特殊限定，所述大米例如可以是普通商购可获得的大米。

在本发明的一个具体实施方式中，所述制备红曲黄素C的方法包括以下步骤：

1)制备固态培养基：将大米与水浸泡后灭菌获得所述固态培养基；

2)制备种子液：活化所述红曲菌，将活化的红曲菌接种至种子液培养基中培养，获得种子液；

3)发酵：将所述种子液按1：5-10L/kg的比例注入所述固态发酵培养基中进行发酵，以得到发酵后的大米即红曲米；

4)提取红曲黄素C：所述红曲米经干燥、粉碎后，使用50％-80％乙醇进行提取，提取中控制红曲米与乙醇的重量比为1：5-20，提取液再经高效液相色谱分离，以获得所述红曲黄素C。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述制备红曲黄素C的方法包括以下步骤：

1)制备固态培养基：将所述大米用水浸泡后形成的湿米平铺在锥形瓶中，灭菌，得到固态发酵培养基；

2)制备种子液：将所述红曲菌使用活化培养基活化后接种至种子液培养基中培养，制成红曲菌的种子液；

3)发酵：过滤所述红曲菌的种子液以去除菌丝体，将去除菌丝体的所述红曲菌的种子液按比1：5-10L/kg注入所述固态发酵培养基中进行发酵，得到发酵后的大米即红曲米；

4)提取红曲黄素C：将发酵后得到的红曲米经干燥、粉碎后，使用 50％-80％乙醇进行提取，提取中控制红曲米与乙醇的重量比为1：5-20，提取液再经高效液相色谱分离，以获得所述红曲黄素C。

进一步的，步骤1)浸泡过程中大米与水的比例为1:1kg/L，在室温下浸泡4-24h。

进一步的，步骤2)中所述红曲菌的活化温度为25-35℃，活化培养2-5 天。进一步的，在所述步骤2)中，所述活化培养基为麦芽汁斜面培养基。

所述麦芽汁斜面培养基为本领域常规的培养基，可以购买获得。也可以按照以下制备获得：将大麦芽粒轻度粉碎，称取250.0g，加入1L水，60℃恒温水浴4h，过滤后加水，将糖度稀释至12°Brix，加入3.0g琼脂，于121℃、 0.1MPa条件下灭菌20min。

更进一步的，步骤2)中将活化的红曲菌接种至种子液培养基中培养在恒温摇床中进行，控制摇床温度为25-35℃，摇床转速为150-200r/min，培养时间为24-48小时。

所述种子液培养基为本领域常规的培养基，可以购买获得。也可以按照以下配方制备获得，以重量计，6.0份葡萄糖、2.0份蛋白胨、1.0份NaNO₃、 1.0份KH₂PO₄、0.5份MgSO₄，以及100份的水。例如将6.0g葡萄糖、2.0 g蛋白胨、1.0gNaNO₃、1.0gKH₂PO₄、0.5gMgSO₄溶于100mL水并分装至 250mL锥形瓶中，8层纱布和牛皮纸封口，于121℃、0.1MPa条件下灭菌20min获得。

进一步的，步骤3)中发酵的温度为25-35℃，发酵时间为10-25天。

在本发明的另一个方案中，所述步骤4)，提取液再经高效液相色谱分离，以获得所述红曲黄素C的过程中，还包括从提取液获得红曲素(Monascin, 简称MS)。申请人检测发现MS与MC同时存在于该提取液中，可以通过常规技术手段将二者从提取液中分离出来，例如根据MS与MC出峰时间的不同，在高效液相色谱分离过程中分别收集MS与MC，这对于本领域技术人员是可以实现的。

进一步，MS可以通过式1的方式转变为MC；本申请提供的制备MS的方法，也可以包括步骤5)将从提取液获得的MS转变为MC，以进一步提高 MC的产量。

本发明方法制备的红曲黄素C可以用于制备减脂功能性食品或药品。

进一步的，所述减脂功能性食品用于预防或改善个体与肥胖相关的亚健康状态。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述减脂制品包括减脂药品。

进一步的，所述减脂药品用于预防或治疗个体与脂代谢异常相关的疾病。

进一步的，所述个体与脂代谢异常相关的疾病包括非酒精性脂肪肝、心血管疾病、糖尿病和哮喘中的一种或多种。

更进一步的，所述减脂药品的制剂形式可以为硬胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、悬浮液、糖浆、口服液或注射液。

根据选择剂型的不同，所述减脂药品还可以包括医药学上可接受的赋形剂，辅料等。

进一步的，在本发明的方案中，所述减脂药品为单位制剂。例如所述单位制剂中含有50-200mg的红曲黄素C。当然上述红曲黄素C的量也可以根据施用对象的不同适当调整，只要能实现预防或治疗个体与脂代谢异常相关的疾病即可。

本发明方案中，单位制剂中的红曲黄素C的量是针对一般成人体重、单次施用的药剂中所述有效成分的量。所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，常见的单位制剂如一单位(片)片剂、一单位(针)针剂或粉针剂等。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如，在制备药物的过程中，一般认为成人体重为50-90kg，可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中国临床药理学与治疗学》,2004Sep；9(9):1069- 1072)来确定。在本发明的实施方式中，可以使用按照人和仓鼠的体表面积折算系数0.12来换算人和仓鼠的剂量。

本发明方案具有以下优点：

1)本发明提供一种新的红曲菌(Monascus.sp)，具有高产红曲黄素C 的能力。该红曲黄素C具有显著的降低血脂、控制体重增加、抑制体脂肪堆积的功能；并具有降低的细胞毒性，作为减脂制品具有更高的使用安全性。

2)本发明提供的制备红曲黄素C的方法，利用特定的红曲菌，能以高产量生产红曲黄素C，能满足大规模工业应用的需要，尤其是开发具有上述效果的功能性食品或药品的需要。

3)本申请方案提供的方法，发酵获得的红曲米中MC含量为5-10mg/g 在中国台湾发明专利TW1437001B中发酵获得的红曲米中Monascuspiloin色素的含量仅为0.31mg/g。

附图说明

图1显示了MC的LCMS一级正离子谱图。

图2A显示了MC的¹H-NMR谱图；图2B显示了MC的¹³C-NMR谱图。

图3A显示了MS的ESI-MS测定结果。图3B显示了MS的¹H-NMR 谱图。图3C显示了MS的¹³C-NMR谱图。

图4A显示了油酸添加前HepG2细胞情况，图4B显示了油酸添加后 HepG2细胞脂质堆积情况。

图5显示了MC和MS不同给药量对油酸造模后的HepG2细胞存活率的影响。

图6显示了不同MC给药浓度对油酸造模后的HepG2细胞内TG含量的影响。

图7显示了MC和MS对油酸造模后的HepG2细胞内TG含量的影响。

图8A为油酸造模组HepG2细胞内脂质堆积图；图8B为MS组HepG2 细胞内脂质堆积图；图8C为MC组HepG2细胞内脂质堆积图。

图9显示了MC对胰脂肪酶的抑制活性随浓度的变化图。

图10A为MS(红曲素,Monascin)反应物添加顺序不同的抑制率结果图；图10B为AK(安卡红曲黄素,Ankaflavin)反应物添加顺序不同的抑制率结果图；图10C为MC(红曲黄素C,Monascinol)反应物添加顺序不同的抑制率结果图。

图11显示了MC的Lineweaver–Burk曲线。

图12A-图12C显示了为各分组仓鼠的肝脏组织切片在100x光镜下的结果,图12D-图12F显示了为各分组仓鼠的肝脏组织切片在400x光镜下的结果。

图13A-图13C显示了为各分组仓鼠的脂肪组织切片在100x光镜下的结果,图13D-图13F显示了为各分组仓鼠的脂肪组织切片在400x光镜下的结果。

具体实施方式

本申请实施例中的HepG2细胞购自协和细胞资源中心(资源编号：3111C0001CCC000035)，实验过程中使用的各种试剂均为常规试剂，均可商购获得。本申请中记载的红曲菌(Monascus sp)为2019年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18578的红曲菌。原料为普通商购获得的大米，培养基中各成分均为本领域常规可以商购获得的试剂。

实施例1-1利用本发明提供的红曲菌制备红曲黄素C

一、利用红曲菌CGMCCNo.18578制备红曲黄素C，包括以下步骤：

1)将大米和水按1:1的质量体积比(kg/L)在室温下浸泡4h，将水沥干后装入培养瓶中，在121℃、0.1MPa条件下灭菌20min，得到固态发酵培养基；

2)将保存于4℃冰箱的红曲菌CGMCCNo.18578转接入新鲜的麦芽汁斜面培养基上，35℃培养48h以活化该红曲菌；将灭菌后的无菌水在无菌操作下倒入活化好的菌种斜面中，接种环刮下孢子制成孢子悬浮液，转接至种子液培养基中，30℃，180r/min恒温摇床培养36h，以获得红曲菌的种子液，其中活化用的麦芽汁培养基可以是普通商购获得的。种子液培养基包括6.0份葡萄糖、2.0份蛋白胨、1.0份NaNO₃、1.0份KH₂PO₄、0.5份MgSO₄，以及100份的水，混合后灭菌获得。

3)用双层纱布过滤所述红曲菌的种子液以去除菌丝体，将去除菌丝体的所述红曲菌的种子液按1：10L/kg的体积重量比注入所述固态发酵培养基中在25℃发酵10天，得到发酵后的大米即红曲米；

4)将发酵后的红曲米放置于烘箱60℃干燥、粉碎后，使用70％乙醇进行提取，红曲米与乙醇的重量比为1：5，经提取液再经高效液相色谱分离以获得所述红曲黄素C。

实施例1-2利用本发明提供的红曲菌制备红曲黄素C

一、利用红曲菌CGMCCNo.18578制备红曲黄素C，包括以下步骤：

1)将大米和水按1:1的质量体积比(kg/L)在室温下浸泡15h，将水沥干后装入培养瓶中，在121℃、0.1MPa条件下灭菌20min，得到固态发酵培养基；

2)将保存于4℃冰箱的红曲菌CGMCCNo.18578转接入新鲜的麦芽汁斜面培养基上，30℃培养3天以活化该红曲菌；将灭菌后的无菌水在无菌操作下倒入活化好的菌种斜面中，接种环刮下孢子制成孢子悬浮液，转接至种子液培养基中，25℃，200r/min恒温摇床培养48h，以获得红曲菌的种子液。

其中活化用的麦芽汁培养基是通过大麦芽粒轻度粉碎，称取250.0g，加入1L水，60℃恒温水浴4h，过滤后加水，将糖度稀释至12°Brix，加入3.0 g琼脂，于121℃、0.1MPa条件下灭菌20min制备获得。

种子液培养基通过将6.0g葡萄糖、2.0g蛋白胨、1.0gNaNO₃、1.0 gKH₂PO₄、0.5gMgSO₄溶于100mL水并分装至250mL锥形瓶中，8层纱布和牛皮纸封口，于121℃、0.1MPa条件下灭菌20min获得。

3)用双层纱布过滤所述红曲菌的种子液以去除菌丝体，将去除菌丝体的所述红曲菌的种子液按1：5L/kg的体积重量比注入所述固态发酵培养基中在35℃发酵25天，得到发酵后的大米即红曲米；

4)将发酵后的红曲米放置于烘箱60℃干燥、粉碎后，使用70％乙醇进行提取，红曲米与乙醇的重量比为1：12，经提取液再经高效液相色谱分离以获得所述红曲黄素C。

实施例1-3利用本发明提供的红曲菌制备红曲黄素C

1)将大米和水按1:1的质量体积比(kg/L)在室温下浸泡24h，将水沥干后装入培养瓶中，在121℃、0.1MPa条件下灭菌20min，得到固态发酵培养基；

2)将保存于4℃冰箱的红曲菌CGMCCNo.18578转接入新鲜的麦芽汁斜面培养基上，25℃培养5天以活化该红曲菌；将灭菌后的无菌水在无菌操作下倒入活化好的菌种斜面中，接种环刮下孢子制成孢子悬浮液，转接至种子液培养基中，35℃，150r/min恒温摇床培养24h，以获得红曲菌的种子液，其中活化用的麦芽汁培养基可以是普通商购获得的。种子液培养基包括6.0份葡萄糖、2.0份蛋白胨、1.0份NaNO₃、1.0份KH₂PO₄、0.5份MgSO₄，以及100份的水，混合后灭菌获得。

3)用双层纱布过滤所述红曲菌的种子液以去除菌丝体，将去除菌丝体的所述红曲菌的种子液按1：8L/kg的体积重量比注入所述固态发酵培养基中在30℃发酵20天，得到发酵后的大米即红曲米；

4)将发酵后的红曲米放置于烘箱60℃干燥、粉碎后，使用70％乙醇进行提取，红曲米与乙醇的重量比为1：20，经提取液再经高效液相色谱分离以获得所述红曲黄素C。

实施例1-4实施例1-1到实施例1-3制备得到的MC结构解析和含量测定

1)实施例1-1到实施例1-3制备得到的MC结构解析

ESI-MS测定所获得的红曲黄素C的结果如图1所示，其一级正离子峰m/z为361.2000[M+H]⁺，该化合物分子式为C₂₁H₂₈O₅。

红曲黄素C的¹H-NMR结果如图2A所示，红曲黄素C的¹³C-NMR结果如图2B所示，该结果与文献JP2008-56618A记载Monascinol的结构表征信息相同。

2)实施例1-1到实施例1-3制备得到的MC含量测定

MC标准曲线的绘制：

将制备纯化的MC(HPLC纯度>95％)溶解于70％乙醇，配置成4mg/ml 母液，经梯度稀释得到浓度分别为400、200、100、50、25μg/ml的MC标准工作液，美国安捷伦科技有限公司1260型HPLC检测绘制标准曲线，HPLC 条件：色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(5μm，4.6×250mm)；流动相乙腈-0.1％甲酸水60:40(V/V)，等度洗脱；二极管阵列检测器；检测波长390nm；柱温25℃；流速1mL/min；进样体20μL。以峰面积Y对浓度X进行线性回归，得到MC回归方程为Y＝31.63x+122，R²＝0.998。

红曲发酵产物中MC含量的测定：

60℃烘干发酵产物(即发酵后的红曲米)，磨粉过筛(200目)后准确称取0.50g入10mL离心管中，用70％乙醇溶液按照一定的料液比(按照实施例1-1到1-3中的比例)超声提取30min，3500r/min离心10min，将上清液适当稀释后经0.22μm有机滤器过滤提取液至液相小瓶中，HPLC检测。

根据样品中检测到的MC峰面积和样品稀释倍数及MC标准曲线，计算得到实施例1-1中发酵产物中MC含量为5mg/g；实施例1-2中发酵产物中 MC含量为10mg/g；实施例1-3中发酵产物中MC含量为8mg/g。本申请实施例中使用CGMCCNo.18578发酵红曲米MC含量远高于中国台湾发明专利 TW1437001B中所用红曲菌发酵的红曲米中MC含量(0.31mg/g)。

实施例1-5MS的制备、结构解析和含量测定

实施例1-1到实施例1-3发酵产物中经结构解析确认同时含有MS，MS在实施例1-1到实施例1-3发酵产物中的含量也同时进行了定量检测。

所获得MS的ESI-MS测定结果如图3A所示，其一级正离子峰m/z为 359.1847[M+H]⁺，该化合物分子式为C₂₁H₂₆O₅。MS的¹H-NMR结果如图3B 所示。MS的¹³C-NMR结果如图3C所示，该结果与文献记载MS的结构表征信息一致。

MS标准曲线的绘制：

将制备纯化的MS(HPLC纯度>98％)溶解于70％乙醇，配置成4mg/ml 母液，经梯度稀释得到浓度分别为400、200、100、50、25μg/ml的MS标准工作液，美国安捷伦科技有限公司1260型HPLC检测绘制标准曲线，HPLC 条件：色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(5μm，4.6×250mm)；流动相乙腈-0.1％甲酸水60:40(V/V)，等度洗脱；二极管阵列检测器；检测波长390nm；柱温25℃；流速1mL/min；进样体20μL。以峰面积Y对浓度X进行线性回归，得到MS回归方程为Y＝49.21x+32，R²＝0.996。

红曲发酵产物中MS含量的测定：

根据样品中检测到的MS峰面积和样品稀释倍数及MS标准曲线，计算得到实施例1-1中发酵产物中MS含量为6mg/g；实施例1-2中发酵产物中 MS含量为15mg/g；实施例1-3中发酵产物中MS含量为10mg/g。

如将该MS照式1进一步转化为MC，可进一步提高本申请红曲菌发酵生产MC的产量。

实施例2、红曲黄素C的细胞毒性

1)油酸造模HepG2细胞

取生长状态良好的HepG2细胞以2*10⁵个/mL，每孔1mL接种于6孔培养板内。待细胞贴壁率达到80％-90％时，弃去培养基。设置空白组与模型组，空白组加完全培养基，模型组加用完全培养基稀释的0.3mmol/L的油酸诱导液，每孔加2mL，培养24h后，通过油红O染色观察细胞中脂滴蓄积情况。

空白组细胞形态呈梭形，细胞边缘清晰，细胞内无明显脂滴积累；加入2 mL0.3mmol/L的油酸诱导液的贴壁HepG2细胞，在孵育培养24h后，细胞没有明显的增殖损伤，且与空白组相比细胞边缘可以看到有明显的红色脂滴环绕在细胞核周围，细胞轮廓较清晰，表明建模成功，参见图4，图4A-图 4B显示了油酸添加前后对HepG2细胞脂质堆积的影响(倒置显微镜×400)。

2)红曲黄素C(Monascinol，简称MC)和红曲素(Monascin,简称MS) 对油酸造模后的HepG2细胞的细胞毒性实验

a.取生长状态良好的HepG2细胞以5*10⁴个/mL，每孔100μL接种于 96孔培养板内。待细胞贴壁率达到80％-90％时，弃去培养基。

b.将MS和MC分别溶于DMSO中配置成5mg/mL的母液，将母液置于-20℃保存。取5mg/mL的母液用含油酸0.3mmol/L的完全培养基稀释成实验所需的MS样品浓度或MC样品浓度(2、4、6、8、10、12μg/mL)，保证每个样品中DMSO的终浓度为0.5％。

c.设置造模组与加药组，

第1天(弃去培养基后)，在造模组的HepG2细胞中添加含0.3mmol/L油酸的完全培养基200μL；在加药组的HepG2细胞中添加含0.3mmol/L油酸及上述不同浓度的MS或MC样品的完全培养基200μL。

24h后，按MTT实验方法检测各组HepG2细胞存活率。

d.结果如图5所示，当MS给药浓度达到10μg/mL以上时，细胞存活率仅为36.7％，开始出现细胞毒性，细胞大量死亡。MC给药浓度12μg/mL时细胞存活率为66.7％，比相同给药浓度MS的细胞毒性明显小。

实施例3红曲黄素C不同给药剂量对细胞甘油三酯含量的影响

按照以下进行实验：

a.选取长势良好的HepG2细胞按2*10⁵个/mL，每孔1mL接种于6孔培养板中培养12h，待细胞贴壁后弃去培养基。

b.弃去培养基后，设置空白组，造模组，加药组。

空白对照组：加入2mL完全培养基；

油酸造模组：加入2mL含油酸0.3mmol/L的完全培养基；

MC低剂量组：加入2mL含油酸0.3mmol/L以及2μg/mL的红曲黄素C 的完全培养基；

MC中剂量组：加入2mL含油酸0.3mmol/L以及4μg/mL的红曲黄素C 的完全培养基；

MC高剂量组：加入2mL含油酸0.3mmol/L以及8μg/mL的红曲黄素C 的完全培养基。

完成给药后，培养各组细胞24小时，收集各组细胞，利用甘油三酯试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)测定各组HepG2细胞中甘油三酯的含量。

c.结果如图6所示，其中不同字母表示与空白组比有显著性差异，P＜ 0.01。

从图6可以看出，与空白组相比，造模组中的TG(甘油三酯,Triglyceride) 含量显著上升(P＜0.01)，细胞内TG含量达到正常组的3.2倍，表明造模成功。与造模组相比，MC低、中、高三个剂量均能显著(P＜0.01)降低细胞中TG的含量。MC浓度在2μg/mL和4μg/mL时使细胞中TG含量分别下降38.9％，34.6％，浓度为8μg/mL时使细胞中TG含量下降51.3％。因此，MC有效降低HepG2细胞内TG含量。

实施例4红曲黄素C(Monascinol，简称MC)和红曲素(Monascin,简称MS)对油酸造模的HepG2细胞的甘油三酯含量的影响

按照以下进行实验：

首先获得正常HepG2细胞，并按照实施例1方法获得油酸造模后的 HepG2细胞(油酸浓度0.3mmol/L)。

第1天，空白对照组：对HepG2细胞正常培养不做处理；油酸造模组(油酸浓度0.3mmol/L)，对油酸造模后的HepG2细胞正常培养不做处理；MC 组：对油酸造模后的HepG2细胞给药2μg/mL的红曲黄素C即MC；MS组：对油酸造模后的HepG2细胞给药2μg/mL的红曲素MS。

完成给药后，继续培养各组细胞24小时，收集各组细胞，利用甘油三酯试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)测定各组HepG2细胞中甘油三酯的含量，结果如图7所示。

从图7可以看出，0.3mmol/L的油酸孵育HepG2细胞24h后，细胞中 TG含量较空白组显著升高(P＜0.01)。相同浓度的MS和MC均使细胞中 TG的含量显著下降(P＜0.01)。2μg/mL的MS和MC可使细胞中TG含量分别下降26.3％和33.3％，两者降脂效果无显著性差异(P>0.01)。

通过油红O染色进一步进行形态学观察，结果如图8A-8C(倒置显微镜×400)所示，图8A为油酸造模组HepG2细胞内脂质堆积图；图8B为MS 组HepG2细胞内脂质堆积图；图8C为MC组HepG2细胞内脂质堆积图，可以看出，与油酸造模组相比，2μg/mL的MS组和MC组均可使细胞中的脂滴减少，颜色变浅。这与TG的检测结果一致。

实施例5MC对胰脂肪酶的抑制活性及抑制类型

实验以4-甲基伞形酮油酸酯(4-MUO)为底物，采用荧光检测法评价 MC对胰脂肪酶(type II，来源猪胰腺)的抑制活性。

设置以下组(也可参见表1)：

空白组：不含MC样品，仅有底物、胰脂肪酶和Tris-HCL缓冲液；

空白背景组：不含MC样品和胰脂肪酶，仅有底物和Tris-HCL缓冲液；

样品背景组：不含胰脂肪酶，仅有MC样品、底物和Tris-HCL缓冲液；

样品组：不含Tris-HCL缓冲液，仅有MC样品、底物和胰脂肪酶。

表1体外测定胰脂肪酶活力方法

根据以下公式计算抑制率：

抑制率(％)＝[(A₁–A₂)–(A₃–A₄]/(A₁–A₂)×100；

A₁：空白组荧光值；A₂：空白背景组荧光值

A₃：样品组荧光值；A₄：样品背景组荧光值

将各组含有的物质按照表1所示比例添加在黑色96孔培养板中的孔中，每组实验设三个平行，其中4-MUO的浓度为0.1mM，MC样品使用DMSO 溶解(设置6个不同的浓度：5、10、20、40、80、160μg/mL)，脂肪酶溶液的浓度为1mg/mL，在25℃条件下反应30min后，加入100μL0.1M柠檬酸钠缓冲溶液终止反应。脂肪酶会催化底物4-甲基伞形酮油酸酯(4-MUO) 生成产物---4-甲基伞形酮，4-甲基伞形酮在激发波长340nm，发射波长460 nm下有荧光强度。通过检测荧光值的大小，间接判断脂肪酶活力(即脂肪酶活力越高，催化生成的4-甲基伞形酮越多，荧光信号也就越强。因此，在激发波长360±40nm，发射波长460±40nm条件下对产物4-甲基伞形酮进行测定。

将上述所述MC的6个浓度转化为对数浓度后，以对数浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，在Origin85中绘制出图9所示的s型曲线，可以看出，MC 对胰脂肪酶的抑制率随着浓度的增加而上升。进一步，基于该S型曲线后，利用本领域已知软件计算IC50值为75.8μg/mL。此部分结果表明MC对胰脂肪酶有一定的抑制活性，通过抑制甘油一酯吸收途径减少甘油三酯经肠道摄取量，具有潜在的抗肥胖功效。

根据抑制剂与酶结合方式和特点不同，抑制类型可分为可逆抑制和不可逆抑制两种类型。不可逆抑制通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的基团结合使酶失活。可逆抑制分为竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制。研究已报道MS和AK对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制，本部分实验以 MS，AK为对照，通过改变反应物的添加顺序判断MC的抑制类型，三种色素抑制剂的干预浓度均为80μg/mL。结果如图10A-10C所示，图10A为MS(红曲素,Monascin)反应物添加顺序不同的抑制率结果图；图10B为AK(安卡红曲黄素,Ankaflavin)反应物添加顺序不同的抑制率结果图；图10C为MC(红曲黄素C,Monascinol)反应物添加顺序不同的抑制率结果图；可以看出MC的抑制类型与MS，AK的抑制类型不同。图10A-10C中，S：底物，I：抑制剂， E：酶。

以下根据Lineweaver－burk双倒数作图法的结果，来确定MC对胰脂肪酶的抑制类型。本领域已知，若两条直线相交于1/S轴，则抑制类型为非竞争性抑制；若两条直线相交1/V轴，则抑制类型为竞争性抑制；若两条直线平行，则抑制类型为反竞争性抑制。

图11显示了MC的Lineweaver–Burk曲线，其中，1/S为底物浓度倒数； 1/V为反应速率倒数，反应速率为反应前后的荧光差值除以时间差值。绘制 Lineweaver-Burk曲线实验的基本流程为：在脂肪酶浓度(1mg/mL)一定的条件下，以一系列不同的底物浓度进行酶促反应速率的测定。空白组不含抑制剂MC(不含MC样品，仅有不同浓度底物、胰脂肪酶和Tris-HCL缓冲液)， MC组是加入(160μg/mLMC，不同浓度底物、胰脂肪酶和Tris-HCL缓冲液。从图11中可以看出，双倒数作图法显示两条直线趋向平行，属可逆抑制类型中的反竞争性抑制。说明MC不直接与酶结合，通过与酶-底物复合物结合的方式降低胰脂肪酶的催化反应速率。

实施例6MC动物实验数据

动物实验使用的24只雄性叙利亚金黄地鼠(Golden Syrian hamster，简称仓鼠)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重110-120克，年龄8 周。

预养一段时间后，随机分为3组，每组8只，按照以下进行分组和实验：

第1天开始每天：

正常组(NOR)：自由摄取基础饲料，并灌胃给与MC组等同量CMC-Na 溶液；

高油脂组(HFD)，自由摄取具高油脂成分的咀嚼饲料，并灌胃给与MC 组等同量CMC-Na溶液；

MC组：自由摄取具高油脂成分的咀嚼饲料，并且按照20mg/kg体重的剂量灌胃MC(溶解于CMC-Na溶液中)。

每周测量仓鼠的体重、摄食量。10周后，采集组织样本或血清样本并进行以下分析。

5.1MC对仓鼠体重、肝、肾与脂肪组织重量的影响

表2记录了仓鼠肝脏、肾脏、脂肪等与脂代谢相关联的脏器重量指标。由以上实验数据可知，与HFD组相比，MC组可显著抑制(p＜0.05)仓鼠因高脂饮食导致的体重、肝重增加及外周脂肪的堆积。

表2

组别	NOR	HFD	MC
				食物摄取量(g)	8.27±0.23<sup>a</sup>	7.03±0.24<sup>b</sup>	6.71±0.35<sup>b</sup>
体重增长量(g)	35.80±4.99<sup>a</sup>	53.14±9.02<sup>b</sup>	22.33±4.12<sup>c</sup>
				肝脏重量(g)	4.02±0.20<sup>a</sup>	5.57±0.14<sup>b</sup>	4.21±0.17<sup>a</sup>
肾脏重量(g)	1.09±0.04<sup>a</sup>	1.10±0.05<sup>a</sup>	0.97±0.04<sup>a</sup>
				肾周围脂肪组织重量(g)	1.56±0.33<sup>a</sup>	2.94±0.41<sup>b</sup>	1.62±0.19<sup>a</sup>
附睾周围脂肪组织重量(g)	2.87±0.37<sup>a</sup>	4.87±0.47<sup>b</sup>	2.99±0.28<sup>a</sup>
				肾周及附睾周脂肪占体重百分比(％)	2.97±0.37<sup>a</sup>	4.79±0.29<sup>b</sup>	3.56±0.26<sup>a</sup>

5.2MC对仓鼠肝脏、血清中TG(甘油三酯，Triglyceride)与TC(总胆固醇，TotalCholesterol)的影响

基于Folch法提取肝脏中的TC和TG，使用南京建成生物工程研究所生产的TC和TG检测试剂盒，按照说明书提供的方法检测肝组织TC和TG含量。

采集的血清样本使用Cobas8000 E602全自动生化分析仪(德国罗氏诊断有限公司)测量血清中的TC和TG。结果记录于表3。

表3肝脏与血清中TC与TG含量

组别	NOR	HFD	MC
				血清TG(mmol/L)	1.89±0.23<sup>a</sup>	4.38±0.414<sup>b</sup>	2.97±0.39<sup>c</sup>
血清TC(mmol/L)	3.81±0.12<sup>a</sup>	4.90±0.24<sup>b</sup>	4.73±0.21<sup>b</sup>
				肝组织TG(mg/g)	9.63±0.62<sup>a</sup>	12.81±0.86<sup>b</sup>	9.62±0.34<sup>a</sup>
肝组织RTC(mg/g)	6.53±0.19<sup>a</sup>	23.94±1.25<sup>b</sup>	20.66±0.58<sup>c</sup>

由表3数据可知，HFD组仓鼠肝脏和血清中TG与TC含量与NOR组相比显著上升(p＜0.05)。相较于HFD组的仓鼠，MC组的仓鼠肝脏和血清中 TG与TC的含量显著下调(p＜0.05)，特别值得注意的是MC干预的高脂饮食仓鼠肝脏中的TG平均含量与NOR组相同。说明MC对于因高脂饮食而导致的血清与肝脏中的脂质堆积有显著抑止效果，尤其对肝脏和血清中TG堆积的抑止效果更佳，这与细胞实验MC抑制HepG2细胞中TG堆积的结果一致。

5.3仓鼠肝脏、脂肪组织病理切片分析

图12A-图12C显示了为各分组仓鼠的肝脏组织切片在100x光镜下的结果,图12D-图12F显示了为各分组仓鼠的肝脏组织切片在400x光镜下的结果,其中图12A和图12D为NOR组，图12B和图12E为HFD组，图12C 和图12F为MC组。可以看出，与HFD组因脂质堆积而增大的肝细胞相比， MC组细胞中脂质堆积显著减少，肝细胞索趋于正常。

图13A-图13C显示了为各分组仓鼠的脂肪组织切片在100x光镜下的结果,图13D-图13F显示了为各分组仓鼠的脂肪组织切片在400x光镜下的结果, 其中图13A和图13D为NOR组，图13B和图13E为HFD组，图13C和图 13F为MC组。可以看出，HFD组附睾周围脂肪组织细胞和肾周围脂肪组织细胞较NOR组体积明显增大，而MC组的细胞较HFD组体积明显减少，细胞体积大小介于NOR组与HFD组的细胞体积之间。

综合以上细胞实验、体外酶实验和动物实验，MC能够有效预防高脂饮食导致的体重增加、外周脂肪堆积、血液和肝脏TC和TG的堆积。可用于预防和治疗因肥胖引发的脂代谢异常及其相关的代谢综合症(如非酒精性脂肪肝、糖尿病、哮喘、骨关节炎等)。经本申请提供的红曲菌发酵获得的富含该MC的红曲米，或者由该红曲米提取分离获得的MC或者MS可用于开发调控脂代谢异常相关功能食品和作为药品的原料药。

Claims

1.一种制备红曲黄素C用的红曲菌(Monascus sp)，其特征在于，所述红曲菌的保藏编号为CGMCC No.18578。

2.一种制备红曲黄素C的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的红曲菌对原料进行发酵以制备红曲黄素C。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原料为大米。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述制备红曲黄素C的方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

步骤1)浸泡过程中大米与水的比例为1:1kg/L，在室温下浸泡4-24h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

步骤2)中所述红曲菌的活化温度为25-35℃，活化培养2-5天。

7.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，

步骤2)中所述活化培养基为麦芽汁斜面培养基。

8.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，

步骤2)中将活化的红曲菌接种至种子液培养基中培养在恒温摇床中进行，控制摇床温度为25-35℃，摇床转速为150-200r/min，培养时间为24-48小时。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

步骤2)中所述种子液培养基包括，以重量计，

6.0份葡萄糖、2.0份蛋白胨、1.0份NaNO₃、1.0份KH₂PO₄、0.5份MgSO₄，以及100份的水。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

步骤3)中发酵的温度为25-35℃，发酵时间为10-25天。