CN111286466A - 土壤杆菌及其所产抗炎症反应胞外多糖 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株土壤杆菌及其所产抗炎症反应胞外多糖。所述的土壤杆菌为土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656，保藏编号为CCTCC NO:M 2018797。本发明的土壤杆菌能够产生具有抗炎症反应的胞外多糖，产量可达20g/L，碳源转化率约为67％。本发明的胞外多糖安全无毒，在细胞水平和动物水平上，该胞外多糖均能够抑制LPS引起的炎症反应，具有显著的抗炎活性，在抗炎药物制备中具有潜在的应用前景。

Description

土壤杆菌及其所产抗炎症反应胞外多糖

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株土壤杆菌及其所产抗炎症反应胞外多糖。

背景技术

微生物所产多糖依据其与菌体的依附方式可分为：作为微生物细胞组分的胞内多糖，粘附在细胞表面的脂多糖和荚膜多糖，以及分泌到环境中的胞外多糖(Extracellularpolysaccharides，EPS)。其中胞外多糖因其产量高、易于分离纯化和工业化生产而受到研究者的持续关注。

根瘤菌是普遍存在于植物根际的一类固氮细菌。研究表明，许多根瘤菌来源的胞外多糖因其优异的流变学性质和乳化等特性而在食品加工、石油开采和化妆品等领域具有较大的开发价值和应用前景。如中国专利CN 201210324713.4通过放射形根瘤菌发酵得到的胞外多糖具有很好的粘度、稳定性和乳化性，可用作酸奶的增稠剂。此外，有些根瘤菌来源的胞外多糖也具有特殊的生物学活性，在医药领域具有巨大应用潜力。据Zhao 等报道，根瘤菌N613所产胞外多糖能够抑制小鼠肉瘤S180的发生，具有一定的抗肿瘤活性(Zhao L,Chen Y,Ren S,et al.Studies on the chemical structure and antitumor activityof an exopolysaccharide from Rhizobium sp.N613[J].Carbohydrate research,2010,345(5): 637-643.)。黄晓波等报道，该多糖还能对小鼠免疫功能产生影响，具有一定的免疫增强活性(黄晓波,张建国,韩勇,等.一种根瘤菌胞外多糖对小鼠免疫功能的影响[J].免疫学杂志,2006(z1):149-150.)。但目前尚未发现根瘤菌胞外多糖在抗炎症反应方面的相关报道。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，又称内毒素，是存在于革兰氏阴性菌细胞外膜中的一种糖酯类成分，会在哺乳动物体内引起强烈的免疫炎症反应。人体中纳克级痕量的LPS即可引起败血症休克的所有症状。肝脏是人体重要的解毒器官，也是清除LPS 的重要场所，能对LPS作出应答，从而引起强烈的炎症反应，造成肝损伤，严重时导致死亡。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656。该菌株经分子生物学鉴定为Agrobacterium sp.，命名为Agrobacterium sp.ZCC3656。该菌株已于2018 年11月16日在中国典型物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2018797，保藏地址为中国武汉市武昌珞珈山。

本发明的目的之二在于提供上述土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656生产的抗炎症反应胞外多糖，命名为瑞格林(Riclin)。

本发明的目的之三在于提供上述土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656发酵生产抗炎症反应胞外多糖的方法，具体步骤为：将土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656种子液接种至发酵培养基中，27～37℃下动态培养，培养结束后提取胞外多糖；所述的发酵培养基成分为10～40g/L蔗糖、0.3～1g/L土豆浸出粉、0～5g/L氯化钠、pH6～8。

优选地，动态培养时，摇床转速为220～300rpm。

优选地，培养时间为48～72小时。

所述的胞外多糖的提取方法为：培养结束后，在发酵培养基中加入2～3倍体积的乙醇，过滤收集析出的絮状多糖。

本发明的目的之四在于提供上述土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656生产的抗炎症反应胞外多糖在抗炎症反应中的应用。

特别地，本发明提供上述抗炎症反应胞外多糖在抗内毒素引起的炎症反应中应用。

本发明的目的之四在于提供上述抗炎症反应胞外多糖在制备抗炎药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明的土壤杆菌胞外多糖产量高，发酵48小时后，多糖产量可达20g/L，并且培养基简单，发酵周期短，传代稳定，适合工业化生产；

(2)本发明首次发现了具有抗炎症反应的胞外多糖，其抗炎症反应效果显著，能用于制备抗炎症药物。

附图说明

图1是土壤杆菌ZCC3656的在发酵培养基中的生长曲线和产糖过程曲线。

图2是土壤杆菌ZCC3656传代次数对发酵产糖量的影响图。

图3是土壤杆菌ZCC3656所产胞外多糖Riclin对内毒素(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞产生促炎因子水平的影响图。

图4是土壤杆菌ZCC3656所产胞外多糖Riclin对内毒素导致小鼠死亡率的影响图。

图5是土壤杆菌ZCC3656所产胞外多糖Riclin对内毒素导致的肝损伤小鼠中炎症指标的影响图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合附图和较佳的实施例对本发明做全面、细致的描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。下文所用到的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同，除非另有定义。除非另有特别说明，本发明中用到的试剂，原料，仪器和设备等均可市场购买得到或者已经有的方法制备得到。

实施例1产胞外多糖土壤杆菌的分离筛选和鉴定

(1)产糖菌的筛选

从河南芒砀山竹林中取根际土壤样本，称取0.5g，置于直径为7cm的滤纸片上，再将滤纸片置于固体筛选培养基表面，于生化培养箱中30℃培养三天。用接种针挑取土样周围的滤纸，置于2ml离心管中，加2ml生理盐水振荡混匀后，静置5min。取上清液进行梯度稀释，取0.1ml稀释液涂布到固体筛选培养基上进行培养。挑取生长形态水润光滑的粘质菌落，用稀释涂布法进行分离纯化和筛选获得单菌落。将单菌落接种至液体筛选培养基中，置于30℃水平摇床中振荡培养2天，选取生长快速，发酵液粘度高的菌落，命名为ZCC3656，将其进行斜面保存，并取1.5ml发酵培养基，加0.5ml无水灭菌甘油，振荡混匀后，置于-80℃冰箱保存。

液体筛选培养基：20g/L蔗糖，2g/L蛋白胨，2g/L酵母膏，5g/L土豆浸出粉，5氯化钠，pH7.0。

固体筛选培养基：20g/L蔗糖，2g/L蛋白胨，2g/L酵母膏，5g/L土豆浸出粉，5氯化钠，10g/L琼脂，pH7.0。

(2)菌株的鉴定

对分离筛选的菌株进行形态学、生理生化鉴定和分子生物学鉴定。

形态学特征：ZCC3656菌落为白色，光滑圆润，边缘整齐，随着培养时间的延长，菌落中心略有凹陷，菌落颜色变浅黄色。液体培养基中，发酵第二天，菌液粘稠，有挂壁现象。

生理生化特征：革兰氏染色呈阴性；在18-40℃范围内能够生长；能利用葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖。不分泌色素。

分子生物学鉴定：以ZCC3656菌株的基因组DNA为模板，用细菌16SrDNA(见序列表SEQ NO.1)通用引物进行PCR扩增。将获得的约1.5kb的DNA片段送至测序公司进行测序。获得的序列提交到GenBank数据库中进行同源性分析，结果表明， ZCC3656与Agrobacteriumsp.菌株的16SrDNA基因序列相似度达到99％。该菌株的16SrDNA序列在GenBank数据库的编号为MK177650。

综上分析，ZCC3656鉴定为Agrobacterium sp.，命名为Agrobacteriumsp.ZCC3656，已于2018年11月16日在中国典型物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO: M 2018797，保藏地址为中国武汉市武昌珞珈山。

实施例2

发酵培养土壤杆菌ZCC3656产Riclin

菌株复壮：将土壤杆菌ZCC3656接种到固体培养基中培养。

斜面培养：将土壤杆菌ZCC3656单菌落划线接种到斜面固体培养基中培养。

固体培养基的组分为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，1g/L氯化钠，10g/L琼脂，pH7.2。培养温度30℃，培养时间48小时。

种子培养：将平板上的单菌落接种至种子培养基中培养。种子培养基的组分为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，1g/L氯化钠，10g/L琼脂，pH7.2。培养温度30度，培养时间48小时。摇床转速为200rpm，培养时间24小时。

发酵生产：按1～10％接种量将种子培养基接入发酵培养基中进行培养。发酵培养基为：30g/L蔗糖，0.5g/L土豆浸出粉，1g/L氯化钠，pH7，培养温度30度，摇床转速为250rpm，培养时间50小时。

多糖提取：往发酵培养基中加入2.5倍体积的乙醇，过滤收集析出的絮状多糖，挤干酒精，烘箱烘干研碎成粉末，称重记录多糖产量。图1为产糖量和发酵液粘度随时间变化曲线，从图1看出，在发酵48小时后，多糖产量已经达到20g/L。表1为文献报道的属的不同菌株的产糖情况。

表1根瘤菌属细菌发酵产胞外多糖的情况

参参文献见最后一页。

实施例3传代培养土壤杆菌ZCC3656产Riclin

用接种环蘸取发酵培养基，划线接种至斜面固体培养基中培养。再将斜面上长出的菌种接种至液体发酵培养基中传代培养。记录传代次数及相应发酵培养基产胞外多糖的产量。图2为传代次数对产糖量的影响。从图中看出，随着传代次数的增加，ZCC3656 的产糖量能够维持在18～20g/L，生长周期短，发酵稳定，适合工业化生产。

实施例4土壤杆菌ZCC3656所产胞外多糖Riclin对内毒素(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞产生促炎因子水平的影响

用含1％青链霉素和15％小牛血清的DMEM培养基培养小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)。培养条件为37℃，5％CO₂培养箱中培养。待细胞长至80％贴壁密度后，分别用PBS(对照组)、LPS、Riclin处理细胞，24h后抽取细胞总RNA，立即用Invitrogen 的M-MLV反转录酶将mRNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用荧光定量PCR 检测不同组的细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因表达情况。图3为不同浓度的 Riclin对LPS诱导的小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因表达水平的影响，从图中看出，随着Riclin浓度的增加，这四种促炎因子的表达水平均显著下降，减轻了 LPS引起的巨噬细胞的炎症反应。

实施例5土壤杆菌ZCC3656所产胞外多糖Riclin对内毒素(LPS)诱导的小鼠致死率的影响

将8周龄的C57BL/6小鼠共30只随机分成3组。一组腹腔注射PBS(模型组)，二组腹腔注射20mg/kg的Riclin(实验组)，三组腹腔注射50mg/kg的Riclin(实验组)。 2小时后，所有小鼠腹腔注射肝损伤药物D-氨基半乳糖(D-GalN)800mg/kg和LPS10 μg/kg，观察和记录小鼠死亡情况和死亡时间。图4为小鼠生存时间和生存率变化曲线。从图中看出，腹腔注射D-GalN/LPS后6h，模型组小鼠开始出现死亡，12h后全部死亡，而对照组和给Riclin组小鼠均能100％存活。说明Riclin能有效提高D-GalN/LPS模型小鼠的存活率。

实施例6土壤杆菌ZCC3656所产胞外多糖Riclin对内毒素(LPS)诱导的肝损伤小鼠炎症指标的影响

将8周龄的C57BL/6小鼠共30只随机分成3组。一组腹腔注射PBS(模型组)，二组腹腔注射20mg/kg的Riclin(实验组)，三组腹腔注射50mg/kg的Riclin(实验组)。 2小时后，所有小鼠腹腔注射肝损伤药物D-氨基半乳糖(D-GalN)800mg/kg和LPS10 μg/kg。4小时后，杀鼠取血、肝脏，分别测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)、TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平。从肝脏组织中抽提mRNA，利用荧光定量 PCR测定TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平。图5为对照组和模型组小鼠各种炎症指标的变化情况。A为血清谷丙转氨酶(ALT)水平；B为血清谷草转氨酶(AST)水平； C为血清中TNF-α蛋白水平；D为肝脏组织中TNF-α基因表达水平；E为血清中IL-1β蛋白水平；F为肝脏组织中IL-1β基因表达水平；C为血清中IL-6蛋白水平；D为肝脏组织中IL-6基因表达水平。从图中看出，Riclin能抑制LPS引起的炎症因子的释放，并降低至正常水平，显著减轻了炎症的发生。

附录：表1涉及的参参文献：

[1]Ghosh A,Ghosh S,Basu P.Production of extracellular polysaccharideby a Rhizobium species from root nodules of the leguminous tree Dalbergialanceolaria[J]. Engineering in life sciences,2005,5(4):378-382.

[2]Kaci Y,Heyraud A,Barakat M,et al.Isolation and identification ofan EPS-producing Rhizobium strain from arid soil(Algeria):characterization ofits EPS and the effect of inoculation on wheat rhizosphere soil structure☆[J].Research in Microbiology,2005,156(4): 522-531.

[3]Staudt A K,Wolfe L G,Shrout J D.Variations in exopolysaccharideproduction by Rhizobium tropici[J].Archives of Microbiology,2012,194(3):197-206.

[4]De P,Basu P.Production of extracellular polysaccharides by aRhizobium species from the root nodules of Tephrosia purpurea Pers[J].Actabiotechnologica,1996,16(2-3): 155-162.

[5]Zhou F,Wu Z,Chen C,et al.Exopolysaccharides produced by Rhizobiumradiobacter S10 in whey and their rheological properties[J].FoodHydrocolloids,2014,36:362-368.

[6]Moretto C,Castellane T C L,Lopes E M,et al.Chemical andrheological properties of exopolysaccharides produced by four isolates ofrhizobia[J].International journal of biological macromolecules,2015,81:291-298.

[7]Castellane T C L,Persona M R,Campanharo J C,et al.Production ofexopolysaccharide from rhizobia with potential biotechnological andbioremediation applications[J].International journal of biologicalmacromolecules,2015,74:515-522.

M.Extracellular polysaccharide production byRhizobiumciceri from Turkey[J].Annals of microbiology,2009,59(1):141-144.

序列表

<110> 南京理工大学

<120> 根瘤菌及其所产抗炎症反应胞外多糖

<141> 2018-12-07

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1343

<212> DNA

<213> 根瘤菌(Rhizobium species)

<400> 1

cgaacgcccc gcaaggggag tggcagacgg gtgagtaacg cgtgggaaca taccctttcc 60

tgcggaatag ctccgggaaa ctggaattaa taccgcatac gccctacggg ggaaagattt 120

atcggggaag gattggcccg cgttggatta gctagttggt ggggtaaagg cctaccaagg 180

cgacgatcca tagctggtct gagaggatga tcagccacat tgggactgag acacggccca 240

aactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc 300

atgccgcgtg agtgatgaag gccttagggt tgtaaagctc tttcaccgat gaagataatg 360

acggtagtcg gagaagaagc cccggctaac ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg 420

gggctagcgt tgttcggaat tactgggcgt aaagcgcacg taggcggata tttaagtcag 480

gggtgaaatc ccgcagctca actgcggaac tgcctttgat actgggtatc ttgagtatgg 540

gaagagggta agtgaaattc cgaagtgtag aggtgaaatt cgtagattat tcggaggaac 600

accagtggcg aaggcggctt attggtccat tactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga 660

gcaaacagga ttagatacct tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgtt agccgtcggg 720

cagtatactg ttcggtggcg cagctaacgc attaaaacat tccgcctggg gagtacggtc 780

gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 840

aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag ctcttgacat tcggggtatg ggcattggag 900

acgatgtcct tcagttaggc tggccccaga acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 960

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccctta gttgccagca 1020

tttagttggg cactctaagg ggactgccgg tgataagccg agaggaaggt ggggatgacg 1080

tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg 1140

ggcagcgaga cagcgatgtc gagctaatct ccaaaagcca tctcagttcg gattgcactc 1200

tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc agatcagcat gctgcggtga 1260

atacgttccc gggccttgta cacaccgcct gtcacaccat gggagttggt tttacccgaa 1320

ggtagtgcgc taactggcaa cca 1343

Claims (10)

1.土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656，保藏编号为CCTCC NO:M 2018797。

2.如权利要求1所述的土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656生产的抗炎症反应胞外多糖。

3.如权利要求1所述的土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656发酵生产抗炎症反应胞外多糖的方法，其特征在于，具体步骤为：将土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656种子液接种至发酵培养基中，27～37℃下振荡培养，培养结束后提取胞外多糖；所述的发酵培养基成分为10～40g/L蔗糖、0.3～1g/L土豆浸出粉、0～5g/L氯化钠、pH6～8。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，动态培养时，摇床转速为220～300rpm。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，培养时间为48～72小时。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的胞外多糖的提取方法为：培养结束后，在发酵培养基中加入2～3倍体积的乙醇，过滤收集析出的絮状多糖。

7.如权利要求2所述的抗炎症反应胞外多糖在抗炎症反应中的应用。

8.如权利要求2所述的抗炎症反应胞外多糖在抗内毒素引起的炎症反应中的应用。

9.如权利要求2所述的抗炎症反应胞外多糖在制备抗炎药物中的应用。

10.如权利要求2所述的抗炎症反应胞外多糖在制备抗内毒素引起的炎症反应药物中的应用。

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