CN111272899A - 一种鉴定热科2号所产沉香的方法 - Google Patents
一种鉴定热科2号所产沉香的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111272899A CN111272899A CN202010168282.1A CN202010168282A CN111272899A CN 111272899 A CN111272899 A CN 111272899A CN 202010168282 A CN202010168282 A CN 202010168282A CN 111272899 A CN111272899 A CN 111272899A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- chromone
- phenethyl
- methoxy
- hydroxy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
Landscapes
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及分析化学领域，具体公开了一种鉴定热科2号所产沉香的方法。所述方法将待测样品进行提取，获得提取物；提取物通过化学分析方法获得待测样品中单体化合物2‑[2‑(4‑甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量、单体化合物2‑[2‑(3‑甲氧基‑4‑羟基)苯乙基]色酮的相对百分含量和单体化合物2‑[2‑(3‑羟基‑4甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量；待测样品同时符合本发明所规定的标准时鉴定为“热科2号”所产沉香。本发明通过对“热科2号”所产的沉香进行系统研究，采用分析2‑(2‑苯乙基)色酮类成分获得的特征成分数据，提供一种科学系统地判定“热科2号”所产沉香的标准，能够准确地鉴定“热科2号”所产的沉香，具备可行性。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，更具体的说是涉及一种鉴定热科2号所产沉香的方法。
背景技术
沉香是瑞香科沉香属(Aquilaria)植物带有树脂的木材。奇楠是沉香中最上等和最珍贵的品种，因其神秘优雅的香味和丰富的油脂含量，市场上价格最为昂贵。国产沉香源植物是瑞香科白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.]。
白木香人工规模栽培已有40年历史，但对其遗传资源的系统评价和选育尚未开展，种苗培育所用种子大多来自栽培或野生成龄植株，种质参差不齐。研究沉香优良品种的选育和繁育技术具有重要的意义。种子后代为有性系，而通过组培、扦插和嫁接等方式生产的种苗为无性系，其性状不会发生分离。白木香是较难生根植物，无论组培还是扦插，生根率均较低，嫁接技术可以克服生根困难的问题。
中国热带农业科学院热带生物技术研究所，嫁接的无性系所产沉香具有奇楠沉香化学成分特征，被认为是一种白木香优良无性系，命名为“热科2号”，2017年获得海南省林木品种委员会认定(良种编号：琼R-ETS-AS-003-2017)。
中国热带农业科学院热带生物技术研究所申请的专利《一种鉴定奇楠沉香真伪的方法》(专利号：ZL201610606306.0)公布了一种鉴定奇楠沉香真伪的方法，专利中规定的检测项目包括沉香油脂提取率和沉香中单体化合物2-(2-苯乙基)色酮、单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮与单体化合物6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮的相对百分含量，根据检测结果来判定是否属于奇楠。“热科2号”所产的沉香有的达到了奇楠沉香的级别，可以通过上述专利进行鉴别，但有的还没有达到奇楠沉香的级别。为了规范市场，因此，需要建立一种质量鉴别技术来鉴别“热科2号”所产的沉香。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定热科2号所产沉香的方法，使得所述方法借助分析化学的手段，能够准确地鉴定热科2号所产的沉香。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种鉴定热科2号所产沉香的方法，包括：
步骤1、将待测样品进行提取，获得提取物；
步骤2、提取物通过化学分析方法获得待测样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮的相对百分含量和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量；
步骤3、待测样品同时符合以下标准时鉴定为“热科2号”所产沉香；
(1)待测样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量之和不得低于60％；
(2)待测样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量之和不得低于3％。
为了规范市场，更好的鉴别沉香的品质，本发明通过对“热科2号”所产沉香的系统性研究后提出了一套科学地鉴定分析方法。
其中，作为优选，所述提取为有机溶剂提取、索氏提取、二氧化碳超临界流体提取或水蒸气蒸馏提取。
进一步优选地，有机溶剂提取方案中有机溶剂包括乙酸乙酯、乙醚、乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、甲醇、正丁醇、烷烃、苯、丙酮。此外，所述索氏提取中也可以选择使用乙酸乙酯、乙醚、乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、甲醇、正丁醇、烷烃、苯、丙酮等有机溶剂提取。
在本发明的一些具体实施方式中，采用了二氧化碳超临界流体提取、水蒸气蒸馏提取、乙醚超声提取、乙酸乙酯索氏提取以及乙醇索氏提取。乙醚超声提取具体方案如下：
待测样品中加入乙醚溶剂，待测样品质量(g)：乙酸乙酯体积(mL)小于1:1(具体的可选择为2.850g:10mL)，超声10-30min，过滤得续滤液，重复三次，合并所有续滤液，待乙醚挥干，得油状乙醚提取物。
氯仿索氏提取具体方案如下：
待测样品加入氯仿溶剂，利用索氏提取设备，加热到90℃提取获得油状提取物，待测样品质量(g)：氯仿体积(mL)小于1:2(具体的可选择为2.500g:10mL)。
乙醇索氏提取具体方案如下：
待测样品加入乙醇溶剂，利用索氏提取设备，加热到110℃提取获得油状提取物，待测样品质量(g)：乙醇体积(mL)小于1:2(具体的可选择为2.500g:10mL)。
二氧化碳超临界流体提取具体方案如下：
取待测样品0.500g，与2.00g硅藻土混合均匀，得待分析样品；将待分析样品装入提取池，空体积用硅藻土填满。将提取池与超临界流体萃取装置连接，进行提取。提取条件为：静态萃取时间10min，动态萃取时间50min，压力20MPa，温度50～70℃，CO2流速2L/min；夹带剂流量0.5mL/min。
水蒸气蒸馏提取具体方案如下：
待测样品中加入水，105℃，利用水蒸气蒸馏法提取，待测样品质量(g)：水体积(mL)可参考2.800g：100mL。
本发明所述待测样品的单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量可通过现有的分析方法获得，如气相色谱、气相色谱-质谱联用、气相色谱-飞行时间质谱、快速热解-气质联用、(超高效/高效)液相色谱、高速逆流色谱、(超高效/高效)液相色谱-质谱联用、高效液相-飞行时间质谱、超临界流体色谱-质谱联用。
其中，所述气相色谱包括气相色谱-质谱联用，所述气相色谱-质谱联用包括气相色谱-飞行时间质谱和快速热解-气质联用；
所述超高效液相色谱包括超高效液相色谱-质谱联用；所述高效液相色谱包括高效液相色谱-质谱联用，所述高效液相色谱-质谱联用包括高效液相色谱-飞行时间质谱。
本发明中涉及的三种单体化合物的结构式如下：
对于上述各种化学分析方法，本发明给出了较为优选地更利于分析检测的方法，即气相色谱、气相色谱-质谱联用、气相色谱-飞行时间质谱、高效液相色谱、超高效液相色谱-质谱联用。
其中，所述气相色谱、气相色谱-质谱联用、气相色谱-飞行时间质谱条件中气相条件优选如下：
色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min。
更具体的，所述气相色谱、气相色谱-质谱联用条件中气相条件优选如下：
色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min；汽化室温度250℃；载气为高纯He；载气流量1.0mL/min；进样量1.0-2.0μL，不分流，溶剂延迟时间：4.0-5.0min。
所述气相色谱-飞行时间质谱中气相条件优选如下：
色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min；汽化室温度250℃；载气为高纯He；载气流量1.0mL/min；进样量1.0μL，分流比：10:1，溶剂延迟时间：4.0min。
所述气相色谱-质谱联用、气相色谱-飞行时间质谱、(超高效/高效)液相色谱-质谱联用中质谱条件优选如下之一：
(1)ESI离子源；碰撞气体为氦气，0.4L/min；雾化干燥气体为高纯氮气(99.999％)，6.0L/min；毛细管电压-4000V；端板电压500V；雾化器压力15psi；质量扫描范围m/z 70to 2200；
(2)电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围m/z55～500；
(3)电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式：全扫描；分辨率：8000FWHM。
(超高效/高效)液相色谱-质谱联用优选第(1)种，气相色谱-质谱联用优选第(2)种，气相色谱-飞行时间质谱优选第(3)种。
所述(超高效/高效)液相色谱、(超高效/高效)液相色谱-质谱联用中液相条件优选如下：
Dionex-Acclaim 120C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％甲酸水溶液，洗脱梯度程序：0～60min，25％～55％A，60～80min，55％～80％A，80～90min，80％～100％A，90～95min，100％A；流速0.4mL min-1，检测波长254nm。更具体的，Dionex-Acclaim 120C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％甲酸水溶液，洗脱梯度程序：0～60min，25％～55％A，60～80min，55％～80％A，80～90min，80％～100％A，90～95min，100％A；流速0.4mLmin-1，检测波长254nm，柱温26～30℃，进样量5～20μL。
应用本发明鉴定方法对已知的“热科2号”所产沉香和其他沉香进行鉴定，鉴定结果表明“热科2号”所产沉香均满足本发明要求的所有指标，而其他沉香均未满足所有指标，表明本发明鉴定方法具有较高地准确性和可行性，可以对“热科2号”所产沉香进行系统、客观地分析鉴定，与其他沉香进行区别。
由以上技术方案可知，本发明通过对“热科2号”所产沉香的系统研究，采用化学分析方法获得的特征成分数据，提供一种以2-(2-苯乙基)色酮类成分鉴定“热科2号”所产沉香的标准，能够准确地鉴定“热科2号”所产沉香，具备可行性。
具体实施方式
本发明公开了一种鉴定热科2号所产沉香的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
仪器：美国安捷伦公司HP7820 GC仪，配备自动进样器、化学工作站；北京赛多利斯天平有限公司BP221S万分之一电子秤；莱博科贸公司索氏提取仪。
试剂：天津市化学试剂一厂乙酸乙酯(AR)；美国天地公司(Tedia)产甲醇(色谱纯)。
耗材：2mL进样瓶，0.45μm有机相微孔滤膜。
待测样品描述：该样品采自海南文昌，是“热科2号”结香3年的沉香，外观呈黄绿色，长条状，有孔洞(打洞结香)，大量深浅不一的黄绿色油脂分布其上，油脂丰富；气味上香味浓郁醇厚，带有清凉味和蜂蜜般的甜味。
待测样品的鉴定包括以下几个步骤：
(1)样品的前处理：从该样品中取一小块样品，切碎并准确称取重量为2.000g；
(2)样品中加入10mL的乙酸乙酯溶剂，利用索氏提取设备，加热到90℃得油状提取物；
(3)准确称取少量提取物，配制成浓度为1mg/mL的溶液，过0.45μm的有机微孔滤膜至2mL的进样瓶，得到供试品溶液；分别准确称取少量单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮，分别配制成浓度为1mg/mL的溶液，过0.45μm有机微孔滤膜至2mL的进样瓶，得到单体化合物A溶液、单体化合物B溶液和单体化合物C溶液；
(5)利用气相色谱仪，对供试品溶液和三个单体化合物溶液进行分析，工作参数如下：
气相条件：色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999％)；载气流量1.0mL/min；进样量1.0μL，不分流，溶剂延迟时间：3.0min。
(6)得到色谱图，利用单体化合物的保留时间对待测样品进行鉴定，并采用峰面积归一化法计算待测样品中这三个单体化合物的相对百分含量，鉴定结果见表1。
表1 GC鉴定三个组分的结果
| 编号 | 保留时间 | 化合物名称 | 分子式 | 分子量 | 相对百分含量 |
| 1 | 41.29 | 2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮 | C<sub>18</sub>H<sub>16</sub>O<sub>3</sub> | 280 | 54.29％ |
| 2 | 43.49 | 2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮 | C<sub>18</sub>H<sub>16</sub>O<sub>4</sub> | 296 | 6.64％ |
| 3 | 44.30 | 2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮 | C<sub>18</sub>H<sub>16</sub>O<sub>4</sub> | 296 | 20.16％ |
该样品中检测到单体化合物A：2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮(54.29％)、单体化合物B：2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮(6.64％)和单体化合物C：2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮(20.16％)。
(7)根据“热科2号”所产沉香鉴定指标对待测样品进行鉴定，具体如下：
①气相色谱仪(GC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和81.09％，满足指标规定的不得低于60％；
②气相色谱仪(GC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和26.80％，满足指标规定的不得低于3％。
(8)根据本发明的操作规程，该样品满足“热科2号”所产沉香鉴定的所有指标，该样品是“热科2号”所产沉香。
(9)利用相同的分析方法对经专家鉴定为虫漏沉香的样品进行鉴定，该样品描述：外观：白色木质部上散布黄褐色油脂，表面有两个虫洞；气味：有淡淡的香气。根据“热科2号”所产沉香鉴定指标进行鉴定，具体如下：
①气相色谱仪(GC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和6.83％，不满足指标规定的不得低于60％；
②气相色谱仪(GC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和0.63％，不满足指标规定的不得低于3％。
(10)根据本发明的操作规程，该样品不满足“热科2号”所产沉香鉴定的所有指标，该样品不是“热科2号”所产沉香。
实施例2：
仪器：美国戴安公司和美国布鲁克公司UPLC3000-MS联用仪；北京赛多利斯天平有限公司BP221S万分之一电子秤；美国Bransonic-5510E-DTH超声波清洗仪。
试剂：天津市化学试剂一厂乙醚(AR)；美国天地公司(Tedia)产甲醇(色谱纯)。
耗材：2mL进样瓶，0.45μm有机相微孔滤膜。
待测样品描述：采自海南琼中“热科2号”结香2年的沉香，为不规则的碎块，体积约2立方厘米，密布黑褐色油脂细条纹；气味上香味清新，淡雅。
待测样品的鉴定包括以下几个步骤：
(1)样品的前处理：从该样品中取一小块样品，切碎并准确称取重量为2.500g；
(2)样品中加入10mL的乙醚溶剂，超声30min，过滤得续滤液；重复该步骤两次，合并续滤液，待其挥干，得油状乙醚提取物；
(3)准确称取少量提取物，配制成浓度为1.5mg/mL的溶液，过0.45μm的滤膜至2mL的进样瓶，得到供试品溶液；
(5)利用超高效液相色谱-质谱联用仪，对供试品溶液进行分析，工作参数如下：
液相条件：Dionex-Acclaim 120C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)和0.5％甲酸水溶液(B)。洗脱梯度程序：0～60min，25％～55％A，60～80min，55％～80％A，80～90min，80％～100％A，90～95min，100％A。流速0.4mL min-1，检测波长254nm，柱温26℃，进样量20μL。
质谱条件：ESI离子源；碰撞气体为氦气，0.4L/min；雾化干燥气体为高纯氮气(99.999％)，6.0L/min；毛细管电压-4000V；端板电压500V；雾化器压力15psi；质量扫描范围m/z 70to 2200。
(6)分析得到色谱图和质谱图，该样品组分鉴定结果见表2。
表2 UPLC-MS鉴定三个组分的结果
该样品中检测到单体化合物A：2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮(40.46％)、单体化合物B：2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮(4.40％)和单体化合物C：2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮(25.25％)。
(7)根据“热科2号”所产沉香鉴定指标对待测样品进行鉴定，具体如下：
①超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基苯乙基)]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和70.11％，满足指标规定的不得低于60％；
②超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和29.65％，满足指标规定的不得低于3％。
(8)根据本发明的操作规程，该样品满足“热科2号”所产沉香鉴定方法的所有指标，该样品是“热科2号”所产的沉香。
(9)利用相同的分析方法对经专家鉴定为人工打洞沉香的样品进行鉴定，该样品描述：外观：黄白色木质部上散布褐色油脂，侧面有直径为2.5cm的孔洞；气味：散发淡雅的香气。根据“热科2号”所产沉香鉴定指标进行鉴定，具体如下：
①超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和18.26％，不满足指标规定的不得低于60％；；
②超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和12.08％，满足指标规定的不得低于3％。
(10)根据本发明的操作规程，该样品不满足“热科2号”所产沉香鉴定的指标①，该样品不是“热科2号”所产的沉香。
实施例3：
仪器：美国安捷伦公司HP6890/5975C GC/MS联用仪，配备自动进样器、化学工作站；北京赛多利斯天平有限公司BP221S万分之一电子秤；美国Bransonic-5510E-DTH超声波清洗仪，200mL加热套，冷凝管，200mL圆底烧瓶。
试剂：美国天地公司(Tedia)产甲醇(色谱纯)。
耗材：2mL进样瓶，0.45μm有机相微孔滤膜。
待测样品描述：采自广东化州“热科2号”结香4年的沉香，外观上为枝条状小木条，表面呈黑褐色，并可见布满黑褐色油脂；气味上甜味浓郁。
待测样品的鉴定包括以下几个步骤：
(1)样品的前处理：从该中取一小块样品，切碎并准确称取重量为0.150g；
(2)样品中加入50mL水，120℃，利用水蒸气蒸馏法提取，得油状提取物；
(3)准确称取少量提取物，配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，过0.45μm的滤膜至2mL的进样瓶，得到GC-MS分析供试品溶液；
(5)利用气相色谱-质谱联用仪，对供试品溶液进行分析，工作参数如下：
气相条件：色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999％)；载气流量1.0mL/min；进样量2.0μL，不分流，溶剂延迟时间：4.0min。
质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围m/z55～500。
(6)分析得到色谱图和质谱图，质谱图通过Nist2014、Wiley275和自建沉香谱库进行定性鉴定，并采用峰面积归一化法计算各组分相对百分含量，即得到该样品组分鉴定结果，见表3。
表3 GC-MS鉴定三个组分的结果
该样品中检测到单体化合物A：2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮(29.49％)、单体化合物B：2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮(16.88％)和单体化合物C：2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮(47.72％)。
(7)根据“热科2号”所产沉香鉴定指标对待测样品进行鉴定，具体如下：
①气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基苯乙基)]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和94.09％，满足指标规定的不得低于60％；
②气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和64.60％，满足指标规定的不得低于3％。
(8)根据本发明的操作规程，该样品满足“热科2号”所产沉香鉴定的所有指标，该样品是“热科2号”所产沉香。
(9)利用相同的分析方法对经专家鉴定为吊口沉香的样品进行鉴定，该样品描述：外观：黄白色木质部上散布黑褐色油脂，表面木质部成吊刺状；气味：有淡淡的香气。根据“热科2号”所产沉香鉴定指标进行鉴定，具体如下：
①气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和6.31％，不满足指标规定的不得低于60％；
②气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和2.00％，不满足指标规定的不得低于3％。
(10)根据本发明的操作规程，该样品不满足“热科2号”所产沉香鉴定的所有指标，该样品不是“热科2号”所产的沉香。
实施例4：
仪器：美国安捷伦公司1260HPLC仪，配备自动进样器、化学工作站；北京赛多利斯天平有限公司BP221S万分之一电子秤；莱博科贸公司索氏提取仪。
试剂：天津市化学试剂一厂乙醇(AR)；美国天地公司(Tedia)产甲醇(色谱纯)；美国天地公司(Tedia)产乙腈(色谱纯)；天津市化学试剂一厂甲酸(AR)。
耗材：2mL进样瓶，0.45μm有机相滤膜。
待测样品描述：该样品采自海南保亭“热科2号”结香1.5年，外观呈黄褐色带墨绿色，黄绿色油脂丰富；气味上香味较醇厚，带有乳香味。
待测样品的鉴定包括以下几个步骤：
(1)样品的前处理：从该样品中取一小块样品，切碎并准确称取重量为2.500g；
(2)样品中加入20mL的乙醇溶剂，加热到110℃，利用索氏提取设备提取，得油状提取物；
(3)准确称取少量提取物，配制成浓度为1mg/mL的溶液，过0.45μm的有机微孔滤膜至2mL的进样瓶，得到供试品溶液；分别准确称取少量单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮，分别配制成浓度为0.01mg/mL的溶液，过0.45μm有机微孔滤膜至2mL的进样瓶，得到单体化合物A溶液、单体化合物B溶液和单体化合物C溶液；
(5)利用高效液相色谱仪，对供试品溶液和三个单体化合物溶液进行分析，工作参数如下：
液相条件：Dionex-Acclaim 120C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)和0.05％甲酸水溶液(B)。洗脱梯度程序：0～60min，25％～55％A，60～80min，55％～80％A，80～90min，80％～100％A，90～95min，100％A。流速0.4mL min-1，检测波长254nm，柱温30℃，进样量5μL。(6)得到色谱图，利用两个单体化合物的保留时间对待测样品中的这两个单体化合物进行鉴定，并采用峰面积归一化法计算待测样品中这三个单体化合物的相对百分含量，鉴定结果见表4。
表4 HPLC鉴定三个组分的结果
该样品中检测到单体化合物A：2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮(55.48％)、单体化合物B：2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮(0.92％)和单体化合物C：2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮(3.96％)。
(7)根据“热科2号”所产沉香鉴定指标对待测样品进行鉴定，具体如下：
①高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和60.36％，满足指标规定的不得低于60％；
②高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和4.88％，满足指标规定的不得低于3％。
(8)根据本发明的操作规程，该样品满足“热科2号”所产沉香鉴定的所有指标，该样品是“热科2号”所产沉香。
(9)利用相同的分析方法对经奇楠沉香鉴定方法鉴定为奇楠沉香的样品进行鉴定，该样品描述：外观呈黄褐色带墨绿色，长条状和卷曲状，大量深浅不一的黄褐色油脂条带分布其上，油脂条立体感明显；气味上香味浓郁醇厚，带有乳香味和蜂蜜般的甜味；手感上质地厚重，手捏表面黏感明显；刀切状态：极易成卷。根据“热科2号”所产沉香鉴定指标进行鉴定，具体如下：
①高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和61.32％，满足指标规定的不得低于60％；
②高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和1.04％，不满足指标规定的不得低于3％。
(10)根据本发明的操作规程，该样品不满足“热科2号”所产沉香鉴定的指标②，该样品不是“热科2号”所产的沉香。
实施例5：
仪器：英国Micromass公司GCT型气相色谱-飞行时间质谱；北京赛多利斯天平有限公司BP221S万分之一电子秤；美国Bransonic-5510E-DTH超声波清洗仪；瑞士SITEC公司超临界流体萃取仪HP-SFE。
试剂：工业液体CO2(纯度>99.0％，宁波方辛气体公司)；美国天地公司(Tedia)产甲醇(色谱纯)。
耗材：2mL进样瓶，0.45μm有机相微孔滤膜。
待测样品描述：采自海南澄迈，“热科2号”结香3年所产沉香，外观上块状小木块，表面呈绿褐色，并可见有绿褐色油脂分布；气味上甜味和凉味较重。
待测样品的真伪鉴定包括以下几个步骤：
(1)样品的前处理：从该中取一小块样品，切碎并准确称取重量为0.405g，与2.00g硅藻土混合均匀，得待分析样品；
(2)将上述带分析样品装入提取池，空体积用硅藻土填满。将提取池与超临界流体萃取装置连接，进行提取。提取条件为：静态萃取时间10min，动态萃取时间60min，压力20MPa，温度50～70℃，CO2流速2L/min；夹带剂流量0.4mL/min。提取物用收集瓶收集。准确称取重量为0.1108g；
(3)准确称取少量提取物，配制成浓度为0.8mg/mL的溶液，过0.45μm的滤膜至2mL的进样瓶，得到供试品溶液；
(4)利用GC-TOFMS仪，对供试品溶液进行分析，工作参数如下：
气相条件：色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999％)；载气流量1.0mL/min；进样量1.0μL，分流比：10:1，溶剂延迟时间：4.0min。
质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式：全扫描；分辨率：8000FWHM。
(5)分析得到色谱图和质谱图，质谱图通过Nist2014、Wiley275和自建沉香谱库进行定性鉴定，并采用峰面积归一化法计算各组分相对百分含量，即得到该样品组分鉴定结果，见表5。
表5 GC-TOFMS鉴定三个组分的结果
该样品中检测到单体化合物A：2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮(41.19％)、单体化合物B：2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮(14.25％)和单体化合物C：2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮(35.96％)。
(6)根据“热科2号”所产沉香鉴定指标对待测样品进行鉴定，具体如下：
①高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和91.40％，满足指标规定的不得低于60％；
②高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和50.21％，满足指标规定的不得低于3％。
(7)根据本发明的操作规程，该样品满足“热科2号”所产沉香鉴定的所有指标，该样品是“热科2号”所产的沉香。
(8)利用相同的分析方法对经奇楠沉香鉴定方法鉴定为奇楠沉香的样品进行鉴定，该样品描述：外观上块状小木块，表面呈紫褐色，并可见有褐色油脂细条纹分布；气味上甜味和奶香味浓郁；手感上质地一般，手捏表面有黏感；刀切状态：可稍成卷。根据“热科2号”所产沉香鉴定指标进行鉴定，具体如下：
①高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和31.26％，不满足指标规定的不得低于60％；
②高效液相色谱仪(HPLC)检测到该样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对含量之和3.50％，满足指标规定的不得低于3％。
(9)根据本发明的操作规程，该样品不满足“热科2号”所产沉香鉴定的指标①，该样品不是“热科2号”所产的沉香。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种鉴定热科2号所产沉香的方法，其特征在于，包括：
步骤1、将待测样品进行提取，获得提取物；
步骤2、提取物通过化学分析方法获得待测样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮的相对百分含量和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量；
步骤3、待测样品同时符合以下标准时鉴定为“热科2号”所产沉香；
(1)待测样品中单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量之和不得低于60％；
(2)待测样品中单体化合物2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮和单体化合物2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮的相对百分含量之和不得低于3％。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述提取为有机溶剂提取、索氏提取、二氧化碳超临界流体提取或水蒸气蒸馏提取。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、乙醚、乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、甲醇、正丁醇、烷烃、苯、丙酮。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述化学分析方法包括：气相色谱、超高效液相色谱、高效液相色谱、高速逆流色谱、超临界流体色谱-质谱联用。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述气相色谱包括气相色谱-质谱联用。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述超高效液相色谱包括超高效液相色谱-质谱联用。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述高效液相色谱包括高效液相色谱-质谱联用。
8.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述气相色谱、气相色谱-质谱联用中气相条件如下：
色谱柱：HP-5MS 5％Phenyl Methyl Siloxane弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50℃，以5℃/min升温至150℃，保持20min，以2℃/min升温至170℃，保持10min，以5℃/min升温至310℃，保持5min；汽化室温度250℃。
9.根据权利要求5-7任意一项所述方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用、超高效液相色谱-质谱联用、高效液相色谱-质谱联用中质谱条件如下之一：
(1)电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围m/z55～500；
(2)电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式：全扫描；分辨率：8000FWHM；
(3)ESI离子源；碰撞气体为氦气，0.4L/min；雾化干燥气体为高纯氮气(99.999％)，6.0L/min；毛细管电压-4000V；端板电压500V；雾化器压力15psi；质量扫描范围m/z 70to2200。
10.根据权利要求4、6-7任意一项所述方法，其特征在于，所述超高效液相色谱、高效液相色谱、超高效液相色谱-质谱联用、高效液相色谱-质谱联用中液相条件如下：
Dionex-Acclaim 120C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％甲酸水溶液，洗脱梯度程序：0～60min，25％～55％A，60～80min，55％～80％A，80～90min，80％～100％A，90～95min，100％A；流速0.4mL min-1，检测波长254nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010168282.1A CN111272899A (zh) | 2020-03-11 | 2020-03-11 | 一种鉴定热科2号所产沉香的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010168282.1A CN111272899A (zh) | 2020-03-11 | 2020-03-11 | 一种鉴定热科2号所产沉香的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111272899A true CN111272899A (zh) | 2020-06-12 |
Family
ID=70997755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010168282.1A Pending CN111272899A (zh) | 2020-03-11 | 2020-03-11 | 一种鉴定热科2号所产沉香的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111272899A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114487199A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-13 | 中国热带农业科学院分析测试中心 | 一种沉香中色酮聚合物的结构解析方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106053645A (zh) * | 2016-06-01 | 2016-10-26 | 中国广州分析测试中心 | 一种鉴别沉香真伪的方法 |
| CN106198791A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-12-07 | 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法 |
| CN106290613A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-04 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种鉴定奇楠沉香真伪的方法 |
| CN109406679A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-01 | 北京三和药业有限公司 | 一种高效液相色谱法测定沉香质量的检测方法 |
-
2020
- 2020-03-11 CN CN202010168282.1A patent/CN111272899A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106053645A (zh) * | 2016-06-01 | 2016-10-26 | 中国广州分析测试中心 | 一种鉴别沉香真伪的方法 |
| CN106198791A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-12-07 | 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法 |
| CN106290613A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-04 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种鉴定奇楠沉香真伪的方法 |
| CN109406679A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-01 | 北京三和药业有限公司 | 一种高效液相色谱法测定沉香质量的检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 梅文莉等: "奇楠沉香中2-(2-苯乙基)色酮的GC-MS分析鉴定", 《热带作物学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114487199A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-13 | 中国热带农业科学院分析测试中心 | 一种沉香中色酮聚合物的结构解析方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Variations in the components of Osmanthus fragrans Lour. essential oil at different stages of flowering | |
| Eyres et al. | Comparison of odor-active compounds in the spicy fraction of hop (Humulus lupulus L.) essential oil from four different varieties | |
| Van Opstaele et al. | Characterization of novel varietal floral hop aromas by headspace solid phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry/olfactometry | |
| Chanthai et al. | Influence of extraction methodologies on the analysis of five major volatile aromatic compounds of citronella grass (Cymbopogon nardus) and lemongrass (Cymbopogon citratus) grown in Thailand | |
| Mockute et al. | Variability of the essential oils composition of Achillea millefolium ssp. millefolium growing wild in Lithuania | |
| CN106290613B (zh) | 一种鉴定奇楠沉香真伪的方法 | |
| Van Opstaele et al. | Characterization of novel single-variety oxygenated sesquiterpenoid hop oil fractions via headspace solid-phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry/olfactometry | |
| Bouwmeester et al. | Enantiomeric composition of carvone, limonene, and carveols in seeds of dill and annual and biennial caraway varieties | |
| Calleja et al. | Volatile composition of Mencıa wines | |
| Silva et al. | Profiling of volatiles in the leaves of Lamiaceae species based on headspace solid phase microextraction and mass spectrometry | |
| Langezaal et al. | Analysis of supercritical carbon dioxide extracts from cones and leaves of a Humulus lupulus L cultivar | |
| CN103952239A (zh) | 一种新鲜佛手精油的提取方法及其在卷烟中的应用 | |
| KR101236020B1 (ko) | 향료 조성물 및 이를 포함하는 피부 외용제 조성물 | |
| Christensen et al. | Direct emission of the allergen primin from intact Primula obconica plants | |
| CN109593607A (zh) | 一种茉莉花露的制备及存储方法 | |
| CN111272899A (zh) | 一种鉴定热科2号所产沉香的方法 | |
| Héthelyi et al. | SPME-GC/MS identification of aroma compounds in rose flowers | |
| KR101470887B1 (ko) | 미선나무 향취를 재현한 향료 조성물 | |
| CN111830145B (zh) | ‘黑枝’玫瑰纯露投料比和蒸馏时间的确定方法 | |
| Guenther et al. | Essential oils and related products | |
| CN105203684B (zh) | 一种茅台酒香气成分的浓缩方法 | |
| Yamanishi et al. | Constituents and composition of steam volatile aroma from Ceylon tea | |
| Rajeswara Rao et al. | Comparative chemical composition of steam-distilled and water-soluble essential oils of South American marigold (Tagetes minuta L.) | |
| Rafieiolhossaini et al. | Fast quality assessment of German chamomile (Matricaria chamomilla L.) by headspace solid-phase microextraction: influence of flower development stage | |
| Da Costa et al. | Identification of aroma chemicals |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200612 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |