CN111235069B - 一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂m2及其制备方法 - Google Patents

一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂m2及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2及其制备方法，微生物菌剂M2由混合菌液、载体、腐殖酸、硫酸锌、硫酸亚铁以及硫酸钾组成，所述混合菌液由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HR15、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)HR37和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HR55三种菌株按照体积比1:1:1配制的混合菌液，载体为鸡粪有机肥；三种菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2020年3月5日；其中，枯草芽孢杆菌HR15的保藏编号为CGMCC NO.19453；萎缩芽孢杆菌HR37的保藏编号为CGMCC NO.19451；贝莱斯芽孢杆菌HR55的保藏编号为CGMCC NO.19452。本发明的微生物菌剂M2对玉米茎基腐病的预防效果好，增产和促生效果显著。

Description

一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于玉米茎基腐病防治的微生物菌剂M2及其制备方法。
背景技术
玉米是世界上重要的粮食作物，种植规模仅排在小麦之后。随着全球气候条件的变化、重茬连作、高密度栽培等，玉米田生态环境随之改变，土壤中病原菌的优势菌群结构发生改变，病残体的积累数量越来越大，有益微生物群落结构和数量也发生较大变化。这些因素导致玉米田土壤微生物群落结构失衡，玉米茎基腐病的发生日趋严重。
玉米茎基腐病是由多种病原菌复合侵染引起的典型土传病害，是危害世界玉米生产的主要病害之一。一般情况下产量损失在10～25％，严重年份可以达到75％。抗性品种、化学种衣剂和增施钾肥是目前生产上的主要措施，但是品种选育时间较长，化学种衣剂的残留易污染生态环境，也会威胁人类健康，加重土壤的盐渍化，病原菌易产生抗药性。降低土壤中的病原菌数量与干扰其生长的土壤微生态环境是防治玉米茎基腐病的关键手段。因此，研发用于玉米茎基腐病的微生物菌剂对于粮食安全和玉米产业可持续发展具有重要的科学意义和应用价值。
众所周知，土壤中存活着多种病原菌，其数量与活性影响着土壤微生物群落结构的稳定，土壤微生物生态环境的不平衡会会加重农作物土传病害的危害。研究表明，农艺措施和生物制剂对土壤微生物群落多样性以及种群组成的影响显著。微生物菌剂广泛用于改善土壤微生物的生态环境，达到防病、防虫、促生和增产效果。吕宁等研究发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可湿性粉剂滴施后对棉花黄萎病防治效果明显，土壤真菌、细菌和放线菌的数量与物种丰度随着施药量的增加而显著增加。Chen等采用棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)颗粒剂在播种前与化肥混合施入土壤，对玉米茎腐病防效显著。但是目前可以用于玉米病害防治的微生物菌剂较少，有必要研发适用于玉米茎基腐病防治的微生物菌剂。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2及其制备方法，生产的微生物菌剂M2对玉米茎基腐病有较好防治效果。
根据本发明的一个方面，提供了一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂 M2，微生物菌剂M2由混合菌液、载体、腐殖酸、硫酸锌、硫酸亚铁以及硫酸钾组成，所述混合菌液由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HR15、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)HR37和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) HR55三种菌株按照体积比1:1:1配制的混合菌液，载体为鸡粪有机肥；三种菌株保藏于均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2020年3月5日；其中，枯草芽孢杆菌HR15的保藏编号为CGMCCNO.19453；萎缩芽孢杆菌HR37的保藏编号为CGMCC NO.19451；贝莱斯芽孢杆菌HR55的保藏编号为CGMCC NO.19452。
可选择地，载体为鸡粪有机肥，鸡粪有机肥中含有少量氮、五氧化二磷以及氧化钾。
可选择地，微生物菌剂M2包括混合菌液15L、腐殖酸2.75kg、硫酸钙 (CaSO4·2H2O)160g、硫酸锌(ZnSO4)80g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 80g、硫酸钾(K2SO4)80g、鸡粪有机肥30kg，微生物菌剂M2中的芽孢杆菌的活菌数＞10亿CFU/g。
根据本发明的另一个方面，提供了一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂 M2的制备方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55 分别接种到斜面NA培养基上，30～37℃活化培养得到枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落以及贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落，所述斜面NA 培养基为固体培养基。
(2)将活化后的枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落和贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落分别接种到装有NA液体培养基中，在30～37℃条件下，200rpm/min振荡培养10～15h，得到枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液；
(3)将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌 HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液分别按照6％的接种比例接种到LB液体培养基的发酵罐中，30～37℃条件下，200rpm/min振荡培养48～72h得到枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液。
(4)取步骤(3)中的枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37 发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液按照体积比1:1:1比例配制得到混合菌液，将混合菌液与腐殖酸、硫酸钙、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸钾以及载体混合均匀，配制成微生物菌剂M2粉剂，低温保存。
可选择地，步骤(1)中斜面NA培养基为肉汁胨培养基(NA)，包括牛肉膏0.3％，蛋白胨0.7％，NaCl 0.3％，琼脂15～20g，pH7.2。
可选择地，步骤(4)中载体为鸡粪有机肥。
可选择地，防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2的制备方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55 分别接种到斜面NA培养基上，37℃活化培养得到枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落以及贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落，斜面NA培养基为固体培养基。
(2)将活化后的枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落和贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落分别接种到装有NA液体培养基中，在37℃条件下，200rpm/min振荡培养12h，得到枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液；
(3)将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌 HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液分别按照6％的接种比例接种到LB液体培养基的发酵罐中，37℃条件下，200rpm/min振荡培养 48h得到枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液。
(4)取步骤(3)中的枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37 发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液按照体积比1:1:1比例配制得到混合菌液，向15L混合菌液中加入2.75kg腐殖酸、160g硫酸钙、80g硫酸锌、80 g硫酸亚铁、80g硫酸钾、30kg鸡粪有机肥，混合均匀配制成微生物菌剂 M2粉剂，低温保存。
根据本发明的再一个方面，提供了一种微生物菌剂M2用于防治玉米茎基腐病的用途。
本发明的有益效果是：本发明的微生物菌剂M2对玉米茎基腐病的预防效果在58.31％～65.8％，明显降低土壤中的病原菌丰度，增加土壤中真菌群落的多样性和均匀度；有效增加玉米田土壤中有机碳、有机质、硝态氮、全氮、全磷、有效磷和速效钾含量；提高玉米出苗率48.34％，增加玉米株高 16.23％、提高玉米茎粗5.89％；增产效果显著，产量增产率达到52.10％，有效增加有效穗数、穗长、穗粗、穗重、玉米粒行数、穗粒数和降低秃头率，对玉米产业可持续发展具有重要的科学意义和应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是3种功能菌株之间的相容性测试图。
图2是本发明实施例中各处理组对玉米的田间促生效果对比图。
图3是本发明实施例中各处理组在收获期的玉米穗对比图。
图4是微生物菌剂M2施用后玉米农田土壤细菌群落结构的影响。
图5是微生物菌剂M2施用后玉米农田土壤真菌群落结构的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征向量可以相互任意组合。
本发明的防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2，微生物菌剂M2由混合菌液、载体、腐殖酸、硫酸锌、硫酸亚铁以及硫酸钾组成，所述混合菌液由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HR15、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) HR37和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HR55三种菌株按照体积比1:1:1 配制的混合菌液，载体为鸡粪有机肥；三种菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2020年3月5日；其中，枯草芽孢杆菌HR15的保藏编号为CGMCC NO.19453；萎缩芽孢杆菌 HR37的保藏编号为CGMCC NO.19451；贝莱斯芽孢杆菌HR55的保藏编号为CGMCC NO.19452。
载体为鸡粪有机肥，鸡粪有机肥中含有少量氮、五氧化二磷以及氧化钾。例如，在实际操作过程中可以选择烘干鸡粪作为载体。
可选择地，微生物菌剂M2包括混合菌液15L、腐殖酸2.75kg、硫酸钙 160g、硫酸锌80g、硫酸亚铁80g、硫酸钾80g、鸡粪有机肥30kg，微生物菌剂M2中芽孢杆菌的活菌数＞10亿次CFU/g。
根据本发明的另一个方面，提供了一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂 M2的制备方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55 分别接种到斜面NA培养基上，30～37℃活化培养得到枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落以及贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落，所述斜面NA 培养基为固体培养基。
(2)将活化后的枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落和贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落分别接种到装有NA液体培养基中，在30～37℃条件下，180～220rpm/min振荡培养10～15h，得到枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液。
(3)将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌 HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液分别按照6％的接种比例接种到LB液体培养基的发酵罐中，30～37℃条件下，180～220rpm/min振荡培养48～72h得到枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液。
(4)取步骤(3)中的枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37 发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液按照体积比1:1:1比例配制得到混合菌液，将混合菌液与腐殖酸、硫酸钙、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸钾以及载体混合均匀，配制成微生物菌剂M2粉剂，低温保存。
步骤(1)中斜面NA培养基为肉汁胨培养基(NA)，包括牛肉膏0.3％，蛋白胨0.7％，NaCl 0.3％，琼脂15～20g，pH7.2。步骤(4)中载体为鸡粪有机肥。
优选地，防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2的制备方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55 分别接种到斜面NA培养基上，37℃活化培养得到枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落以及贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落，斜面NA培养基为固体培养基。
(2)将活化后的枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落和贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落分别接种到装有NA液体培养基中，在37℃条件下，200rpm/min振荡培养12h，得到枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液。
(3)将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌 HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液分别按照6％的接种比例接种到LB液体培养基的发酵罐中，37℃条件下，200rpm/min振荡培养48 h得到枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液。
(4)取步骤(3)中的枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37 发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液按照体积比1:1:1比例配制得到混合菌液，向15L混合菌液中加入2.75kg腐殖酸、160g硫酸钙、80g硫酸锌、80 g硫酸亚铁、80g硫酸钾、30kg鸡粪有机肥，混合均匀配制成微生物菌剂 M2粉剂，低温保存。
下面对本发明的制备方法制备的微生物菌剂M2进行具体说明：
实施例1菌株之间相容性的测定
参考Barbosa的测定方法，在LB固体培养基平板上一半划线接种一种功能菌株，同时在其另一半垂直划线接种另一种功能菌株,每个处理重复3 次。将平板放置在37℃的生化培养箱中培养，24h后观察和记录两菌株之间的相容性反应。两菌株之间不产生抑菌条带的为相容，反之为不相容。相容性结果见图1。
LB固体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL， pH7.4～7.6，15～20g琼脂粉，121℃灭菌30min。
实施例2微生物菌剂M2粉剂的制备
斜面菌种：采用固体NA培养基，分别将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55接种到斜面NA培养基上，在培养箱中37℃条件下培养1～2d。
肉汁胨液体培养基(NA)：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.7％，NaCl 0.3％，pH7.2。肉汁胨固体培养基(NA)：在液体培养基基础上加入15～20g琼脂粉，即获得固体培养基。
芽孢杆菌发酵液的制备：将活化24h的菌株HR15、HR37和HR55单菌落分别接种到的装有液体NA培养基的种子发酵罐中，37℃条件下，200 rpm/min振荡培养12h得到种子发酵液。分别将3种菌株种子发酵液按照6％的比例转移到发酵罐中，37℃条件下，200rpm/min振荡培养48h。
微生物菌剂M2粉剂的配制：
微生物菌剂M2主要由以下成分组成：枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55作为功能菌(芽孢杆菌的活菌数＞10亿次)按照1:1:1比例制备的混合液15L、腐殖酸2.75kg、硫酸钙160g、硫酸锌80g、硫酸亚铁80g、硫酸钾80g，载体为鸡粪有机肥约30kg，以上组分混合均匀，低温保存。鸡粪有机肥包含少量的氮、五氧化二磷以及氧化钾。
测试例微生物菌剂生物活性的测定
测试例1微生物菌剂M2在玉米农田的拌土处理：
在宁夏回族自治区石嘴山市惠农区种植玉米——品种为济玉901，种植前将微生物菌剂M2均匀撒施在农田土壤表面(40kg/亩)，然后用旋耕机采用旋耕(深度为30cm左右)方式将微生物菌剂与土壤均匀混合。设计6个处理：微生物菌剂(M2)；空白对照(CK)：不施用任何农药和肥料；噁霉灵可湿性粉剂+生根粉(ES)；微生物菌剂对照(MCK)：枯草芽孢杆菌为主要成分的微生物肥料(美国微生物总公司)。试验小区面积为60m2，每个处理4个重复小区，每组处理试验面积240m2。以下研究均在此实验田进行。
测试例2微生物菌剂M2对玉米田土壤营养状况的改良效果
玉米乳熟期和蜡熟期采集农田土壤(距离植株15cm，深度为0～20cm)，土壤样本装入自封袋中放入冰盒带回实验室，检测土壤pH值、有机碳、有机质、全氮、全磷、硝态氮、有效磷、速效钾等理化指标，乳熟期的结果见表2，蜡熟期的结果见表3。
表2微生物菌剂M2对玉米田土壤的改良作用(乳熟期)
Figure RE-GDA0002467027640000081
表3微生物菌剂M2对玉米田土壤的改良作用(蜡熟期)
Figure RE-GDA0002467027640000082
Figure RE-GDA0002467027640000091
测试例3微生物菌剂M2对盐碱地玉米的促生作用：玉米种植30d 后调查出苗率和测量株高，种植75d测量茎粗(第一节部位植株周长)，计算微生物菌剂M2对玉米的促生效果，结果见表4和图2。
表4微生物菌剂M2对玉米的促生效果
Figure RE-GDA0002467027640000092
测试例4微生物菌剂M2对玉米的增产作用
玉米成熟期(种植约5个月)调查结穗率和有效穗数，采集成熟玉米穗，测量玉米穗长、千粒重、单粒重、秃头、穗粒数、行粒数、穗粗(穗中部位置的周长)和亩产，评价微生物菌剂M2对玉米的增产效果，结果见表5和表6和图3。
表5微生物菌剂M2对玉米穗的增产效果
Figure RE-GDA0002467027640000093
表6微生物菌剂M2对玉米产量的增产效果
Figure RE-GDA0002467027640000094
Figure RE-GDA0002467027640000101
测试例5微生物菌剂M2对玉米茎基腐病的预防效果
在玉米乳熟期和蜡熟期调查玉米茎基腐病的病情指数，结果见表7。茎基腐病调查方法按《农药田间药效试验准则》，玉米茎基腐病分级标准(植株个体受害程度)：1级：全株生长正常，中下部叶片出现青枯/青黄枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常；3级：全株叶片出现青枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常；5级：全株叶片出现典型青枯症状，茎基部变色且稍有水浸状，果穗基本正常；7级：植株叶片出现典型青枯症状，茎基部明显变软但不倒状，果穗下垂，籽粒不饱满；9级：全株枯死且倒伏，茎基部维管束破裂，籽粒干瘪。
表7微生物菌剂M2对玉米茎基腐病的预防效果
Figure RE-GDA0002467027640000102
测试例6微生物菌剂M2对玉米田土壤微生物群落结构的影响：
玉米乳熟期和蜡熟期采集农田土壤(距离植株15cm，深度为0～20cm)，土壤样本采用冰盒带回实验室。提取各个处理组的土壤样本基因组总DNA，然后利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。细菌扩增引物为338F： 5′-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R： 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，对细菌16S rRNA基因V3–V4可变区进行PCR扩增，引物由上海美吉生物医药科技有限公司设计合成，测序区域合成带有barcode的特异引物。PCR正式试验采用20μL反应体系： 10×PCR Buffer 2μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，5μmol/L正向引物0.8μL， 5μmol/L反向引物0.8μL，rTaq Polymerase 0.2μL，BSA 0.2μL，TemplateDNA10 ng，补ddH2O至20μL。PCR扩增条件：95℃ 3min；循环数×(95℃ 30s，55℃ 30s，72℃45s)；72℃ 10min，10℃直到反应结束。对第二轮PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。将PCR产物用QuantiFluorTM-ST 蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后进行相应比例的混合。混合后的产物用Illumina公司的Miseq 2×300平台测序。微生物菌剂 M2对玉米田土壤细菌群落结构的影响见图4。
真菌扩增引物为ITS1F：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'，ITS2R 5′-CTCGGACGAGGATCCTCGCC-3′，ITS1-ITS2区进行PCR扩增。ITS扩增的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)体系(25μL)：ddH2O 17.25μL，Bufferl 2.5μL，dNTPs 2μL，引物ITS1F 1μL，引物ITS2R 1μL， HiFi酶0.25μL，模板DNA 1μL。PCR反应条件：93℃预变性3min，93℃变性45s，57℃复性45s，72℃延伸90s，35个循环。扩增产物回收后，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。微生物菌剂M2对玉米田土壤微生物真菌群落结构的影响见图5。
测试例7微生物菌剂M2对玉米农田土壤微生物群落多样性的影响：
高通量测序得到的原始数据进行质量控制和软件拼接，过滤掉低质量的序列。将有效序列相似性在≥97％序列聚类成为分类单元(Operational Taxonomic Units)。再用QIIME软件进行单样品组成分析，计算样品的 Coverage、Chao、Shannon指数等。Shannoneven值数值越大，说明群落均匀度越低。Shannon值越大，说明群落多样性越高。Coverage是覆盖度指数，表征微生物样本序列的检测概率，数值越高表明检测出的序列概率越高，能够反映样本中微生物的真实情况。Sobs指丰富度指数，数值越大丰富度越高。微生物菌剂M2对玉米农田土壤细菌群落多样性的影响见表8。微生物菌剂 M2对玉米田土壤微生物真菌群落多样性的影响见表9。
表8微生物菌剂M2对玉米田土壤微生物细菌群落多样性的影响
Figure RE-GDA0002467027640000111
表9微生物菌剂M2对玉米田土壤微生物真菌群落多样性的影响
Figure RE-GDA0002467027640000121
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2，其特征在于，所述微生物菌剂M2由混合菌液、载体、腐殖酸、硫酸锌、硫酸亚铁以及硫酸钾组成，所述混合菌液由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HR15、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)HR37和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HR55三种菌株按照体积比1:1:1配制的混合菌液，所述载体为鸡粪有机肥；所述三种菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2020年3月5日；其中，所述枯草芽孢杆菌HR15的保藏编号为CGMCC NO.19453；所述萎缩芽孢杆菌HR37的保藏编号为CGMCC NO.19451；所述贝莱斯芽孢杆菌HR55的保藏编号为CGMCC NO.19452。
2.如权利要求1所述的防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2，其特征在于，所述载体为鸡粪有机肥，所述鸡粪有机肥中含有氮、五氧化二磷以及氧化钾。
3.如权利要求2所述的防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2，其特征在于，所述微生物菌剂M2包括混合菌液15L、腐殖酸2.75kg、硫酸钙160g、硫酸锌80g、硫酸亚铁80g、硫酸钾80g、鸡粪有机肥30kg，所述微生物菌剂M2中芽孢杆菌的活菌数＞10亿CFU/g。
4.一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55分别接种到斜面NA培养基上，30～37℃活化培养得到枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落以及贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落，所述斜面NA培养基为固体培养基；所述枯草芽孢杆菌HR15、所述萎缩芽孢杆菌HR37和所述贝莱斯芽孢杆菌HR55三种菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2020年3月5日；其中，所述枯草芽孢杆菌HR15的保藏编号为CGMCC NO.19453；所述萎缩芽孢杆菌HR37的保藏编号为CGMCCNO.19451；所述贝莱斯芽孢杆菌HR55的保藏编号为CGMCC NO.19452；
(2)将活化后的枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落和贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落分别接种到装有NA液体培养基中，在30～37℃条件下，180～220rpm/min振荡培养12h，得到枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液；
(3)将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液分别按照6％的接种比例接种到LB液体培养基中，30～37℃条件下，180～220rpm/min振荡培养48～72h得到枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液；
(4)取步骤(3)中的枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液按照体积比1:1:1比例配制得到混合菌液，将混合菌液与腐殖酸、硫酸钙、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸钾以及载体混合均匀，配制成微生物菌剂M2粉剂，低温保存。
5.如权利要求4所述的防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述斜面NA培养基为肉汁胨培养基(NA)，包括牛肉膏0.3％，蛋白胨0.7％，NaCl0.3％，琼脂15～20g，pH7.2。
6.如权利要求4所述的防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述载体为鸡粪有机肥。
7.如权利要求6所述的防治玉米茎基腐病的微生物菌剂M2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55分别接种到斜面NA培养基上，37℃活化培养得到枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落以及贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落，所述斜面NA培养基为固体培养基；
(2)将活化后的枯草芽孢杆菌HR15菌落、萎缩芽孢杆菌HR37菌落和贝莱斯芽孢杆菌HR55菌落分别接种到装有NA液体培养基中，在37℃条件下，200rpm/min振荡培养12h，得到枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液；
(3)将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌HR15种子发酵液，萎缩芽孢杆菌HR37种子发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55种子发酵液分别按照6％的接种比例接种到LB液体培养基中，37℃条件下，200rpm/min振荡培养48h得到枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液；
(4)取步骤(3)中的枯草芽孢杆菌HR15发酵液、萎缩芽孢杆菌HR37发酵液和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液按照体积比1:1:1比例配制得到混合菌液，向15L混合菌液中加入2.75kg腐殖酸、160g硫酸钙、80g硫酸锌、80g硫酸亚铁、80g硫酸钾、30kg鸡粪有机肥，混合均匀配制成微生物菌剂M2粉剂，低温保存。
8.如权利要求1～3任一项所述的微生物菌剂M2的用途，用于防治玉米茎基腐病的用途。
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贝莱斯芽孢杆菌E69预防稻瘟病等多种真菌病害的潜力;沙月霞等;《中国农业科学》;20190601(第11期);全文 *

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