CN111233962A - 一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用”，属于药物化学技术领域。所述流感病毒神经氨酸酶抑制剂结构通式如下：
其中：m选自2‑11中的任一自然数，n选自3‑12中的任一自然数，X选自OCOO或O；Y选自
所述
中的R选自：H、或，
所述
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，涉及一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用。
背景技术
流感(Infuenza)全称流行性感冒，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病。近年来不断发生的季节性流感及不时突现的高致病性流感病毒(如H1N1，H5N1及H7N9)时刻警示着人类新一轮大流感暴发的潜在威胁性，针对流感的防控工作重要而紧迫。目前以流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂为代表的oseltamivir(达菲)和zanamivir(瑞乐沙)仍然是防治流感的主要手段。但随着这些药物的广泛使用，不断出现流感病毒的耐药株，寻找新型的抗流感药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一类流感病毒神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用。本发明提供的流感病毒神经氨酸酶抑制剂较现有扎那米韦具有更加高效的抗流感病毒活性，并且水溶性有明显改善，有望制成口服药。
本发明的技术方案具体如下：
一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制剂结构通式如下：
其中：
m选自2-11中的任一自然数，n选自3-12中的任一自然数，X选自OCOO或O；
Y选自
或，
所述
中的R选自：
H、或，
所述
中的R`为H或荧光标记基团，Z选自3-6中的任一自然数。
当R`为荧光基团时，其主要作用是用来标记病毒，但是R`基团所在的化合物
本身也有抗病毒活性。
所述R`选自：生物素，CY3，CY5，或，FITC。
所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂选自化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、 I-12、I-13、I-14或I-15；
化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、I-12、I-13I-14和I-15均具有如下结构通式：
化合物I-1的m为2，n为6，X为O，Y为
I-2的m为2，n为6，X为OCOO，Y为
I-3的m为5，n为6，X为O，Y为
I-4的m为5，n为6，X为OCOO，Y为
I-5的m为11，n为6，X为O，Y为
I-6的m为11，n为6，X为OCOO，Y为
I-7的m为5，n为12，X为O，Y为
I-8的m为5，n为3，X为O，Y为
I-9的m为5，n为5，X为O，Y为
I-10的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为H；
I-11的m为5，n为6，X为OCOO，Y为
其中，
中的R为H；
I-12的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，所述
中的R为
所述
中的Z为6，R`为生物素；
I-13的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为
所述
中的Z为6，R`为CY3；
I-14的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为
所述
中的Z为6，R`为CY5；或，
I-15的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为为
所述
中的Z为3，R`为生物素。
一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，将化合物VIII或化合物XIV经反应条件 g制得所述流感病毒神经氨酸酶抑制剂；
所述化合物VIII的结构式为
其中，m为2-11中的任一自然数，n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y3为
或
所述化合物XIV的结构式为
其中，m为2-11中的任一自然数， n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y5为H或R；所述R指
其中 R`为生物素、CY3或CY5；
所述反应条件g指：将化合物VIII或XIV溶于溶剂中，滴加氢氧化钠水溶液，室温搅拌3小时后，用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩，浓缩后的剩余物溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液中，反应1小时后浓缩，浓缩后的剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化；
滴加氢氧化钠水溶液的作用是碱性条件下脱除甲酯基团；
用Dowex-50(H+)离子交换树脂的作用是中和，同时把Na离子吸附到树脂上，除掉溶液中的金属离子；
浓缩就是蒸干溶剂，因为后续反应不用该溶剂体系，具体操作就是旋转蒸发仪减压浓缩；
浓缩后的剩余物溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液中的作用是脱除Boc和异丙叉基团；
反应1小时后浓缩，是为了后面的“Sephadex G-15凝胶柱分离纯化”需要，凝胶柱上样过程中要求样品浓度不能太稀，否则分离效果不好。具体操作就是旋转蒸发仪减压浓缩；
浓缩后的剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化，这一步的作用是纯化目标化合物，把与目标化合物分子量差距较大的杂质分离掉。
所述化合物VIII由下述步骤制得：
将化合物II与化合物III经反应条件a得到化合物IV前体，再经反应条件b得到化合物IV；
化合物IV与化合物V经反应条件c得到化合物VI；
将化合物VI与化合物VII经反应条件f得到化合物VIII；
所述化合物II为
其中R1为ClCO或Ts；
所述化合物III为
其中n为3-12中的任一自然数，Y1为N3或COOMe；
所述化合物IV为
其中n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y2为 NH2或COOH；
所述化合物V为
其中m为2-11中的任一自然数，R2为
或
所述化合物VI为
其中m为2-11中的任一自然数，n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y3为
或
所述化合物VII为
当所述化合物II的R1为Ts时，所述反应条件a指，将化合物II与化合物III溶于非极性溶剂中， 100-150℃条件下回流反应过夜，溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体；
回流反应过夜的温度条件100-150℃可达到1,4-二氧六环的沸点，溶剂可发生沸腾回流，是化学反应中的惯常说法；
浓缩的作用是为了后面硅胶层析柱分离纯化需要，硅胶层析柱分离上样过程要求样品浓度不能太稀，否则分离效果不好。具体操作就是旋转蒸发仪减压浓缩；
当所述化合物II的R1为ClCO时，所述反应条件a指，化合物II和化合物III溶于吡啶中，室温搅拌反应过夜；向反应液中加入甲醇，浓缩后溶于溶剂，并先后以HCl溶液和NaHCO3溶液洗涤，有机相浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体；
向反应液中加入甲醇的作用是用来消耗过量的化合物II；
当化合物III的Y1为N3时，所述反应条件b指：将化合物IV前体溶于四氢呋喃中，加入去离子水，三苯基磷，反应液加热到40-60℃，优选45℃，搅拌反应1-12h，优选3h；将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV；
加入去离子水的作用是：使反应液为均一体系，加快反应进程，提高产率；加入三苯基磷的作用是把叠氮基团还原成氨基；
当化合物III的Y1为COOMe时，所述反应条件b指：将化合物IV前体溶于溶剂中，滴加氢氧化钠水溶液，室温搅拌1-6小时，优选3小时，然后用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV；
滴加氢氧化钠水溶液起碱性作用，脱除甲酯；用Dowex-50(H+)离子交换树脂的作用是中和并吸附 Na离子；
所述反应条件c指，在氮气保护条件下，将化合物IV和化合物V溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物VI；
加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶的作用是，它们都是酰胺化反应试剂，促进反应正向进行；
所述反应条件f指，在氮气保护条件下，将化合物VII溶于吡啶，搅拌均匀后加入化合物VI和DMAP，室温下反应2-10h，优选5h；将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物VIII。
所述化合物XIV通过下述步骤制得：
化合物IX与化合物X1通过反应条件h得到化合物XI；
化合物XI与化合物IV通过反应条件e得到化合物XII；
化合物XII与化合物V通过反应条件i得到化合物XIII；
化合物XIII与化合物VII通过反应条件f得到化合物XIV；
所述化合物IX为
其中Y4为H或CH2SH；
所述化合物X1为
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物XI为
其中Y5＝H或R，所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物XII为
其中Y5为H或R，所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物XIII为
其中Y5为H或R，所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物IV为
其中n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y2为 NH2或COOH；
所述化合物V为
其中m为2-11中的任一自然数，R2为
所述化合物VII为
所述反应条件h指，在氮气保护条件下，将化合物IX，化合物X1溶于溶剂中，室温反应过夜，溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XI；
优选地，所述化合物IX、X1、无水乙醇的用量比例为1mmol∶1mmol∶2-50ml，优选1mmol∶1mmol∶20ml；
所述溶剂选自由无水乙醇、水、甲醇组成的组，优选乙醇；
所述反应条件e指，在氮气保护条件下，将化合物IV和化合物XI溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XII；
优选地，所述化合物IV、化合物XI、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为 1mmol∶1-2mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.2-1mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2mmol∶1mmol；
所述反应条件i指，将化合物XII溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液中，反应1-3h，优选1小时，然后浓缩，剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化后，得到处理后的化合物XII；
优选地，所述化合物XII、二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液的用量比例为1mmol∶1-50mL，优选1mmol∶10mL；
将所述处理后的化合物XII与化合物V溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XIII；
优选地，所述化合物IV、化合物XI、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为 1mmol∶1-2mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.1-1mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2mmol∶1mmol；
所述反应条件f指：在氮气保护条件下，将化合物VII溶于吡啶，搅拌均匀后加入化合物XIII和DMAP，室温下反应1-12h，优选5h，然后将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XIV。
所述反应条件g中，所述溶剂选自由甲醇、乙醇、水组成的组；
所述化合物VIII或XIV、甲醇、氢氧化钠水溶液、二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液的用量比例为1mmol∶1-100mL∶0.5-2M∶1-100mL。
上述用量比例不是必须的，上述都是常规化学反应，溶剂和碱性用量多少对该反应没有太大影响；
当所述化合物II的R1为Ts时，所述反应条件a中，所述化合物II、化合物III、非极性溶剂的用量比例为1mol∶1-1.5mol∶10-200ml；优选1mol∶1.2mol∶100ml；所述非极性溶剂为1,4-二氧六环；回流反应过夜的温度条件为125℃；
非极性溶剂可以选择本领域常见的非极性溶剂，优选1,4-二氧六环的好处是可使终产物的产率达到最高；
当所述化合物II的R1为ClCO时，所述反应条件a中，所述溶剂选自二氯甲烷或氯仿；所述化合物 II、化合物III、吡啶、甲醇、二氯甲烷、HCl溶液、NaHCO3溶液的用量比例为1mol∶1.2mol∶100mL∶2mL∶100mL∶1M∶1M；
上述体积和浓度用量仅仅是一个大概的添加量，用量的增加或减少都可不影响最终的结果；
当化合物III的Y1为N3时，所述反应条件b中，所述化合物IV、四氢呋喃、去离子水、三苯基磷的用量比例为10mmol∶10-100ml∶10-100ml∶10-50mmol，优选10mmol∶100ml∶20ml∶20mmol；
当化合物III的Y1为COOMe时，所述反应条件b中，所述化合物IV前体、甲醇、氢氧化钠水溶液用量比例为10mmol∶10-200mL∶0.5-2M，优选10mmol∶100mL∶1M；所述溶剂选自由甲醇、乙醇、水组成的组，优选甲醇；
所述反应条件c中，所述化合物IV、化合物V、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为1mmol∶1-3mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.1-2mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2 mmol∶1mmol；
所述反应条件f中，所述化合物VII、吡啶、化合物VI、DMAP的用量比例为体积比1∶1-50∶1-3∶ 0.1-1，优选1∶10∶1.5∶0.2。
本发明所有的反应步骤和反应条件中，除特别说明的以外，所有的浓缩步骤均为了方便后续的分离纯化过柱步骤，经硅胶层析柱处理均为了分离纯化产物；N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶均为酰胺化反应试剂，加入它们是为了促进反应正向进行；同时，所有反应条件中的各物质的用量比例范围仅仅是为了出于说明书清楚、完整的要求考虑，并不以此限制本发明的范围，各物质的用量比例是本领域技术人员可根据实际的反应需要做出常规选择和调整的，在本发明给出的数值范围比例的基础之上适当调整都不影响本发明获得最终产物。
所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂，和/或，所述的制备方法制备得到的流感病毒神经氨酸酶抑制剂在制备抗流感药物方面的应用。
所述药物的剂型选自：口服剂、滴鼻剂、注射剂、鼻喷雾剂。
本发明的化合物结构通式：
R’为生物素，CY3，CY5，FITC等功能基团或荧光分子。
本发明还提供两种神经氨酸酶抑制剂的制备方法，反应方程式如下所示：
方法一：
当化合物II R1＝Ts的时候，用条件a与III反应，若得到的产物是N3化合物，则用条件c得到IV，若得到的产物是COOMe化合物，则用条件d得到IV；当化合物II R1＝ClCO的时候，用条件b与III反应，若得到的产物是N3化合物，则用条件c得到IV，若得到的产物是COOMe化合物，则用条件d得到IV；得到不同的化合物IV之后，后续经过相应的反应就刻意得到不同的化合物I。
具体步骤如下：
当所述化合物II的R1为Ts时，经过下述反应条件a得到化合物IV前体：a.化合物II(R1＝Ts,1mol) 和化合物III(1.2mol)溶于1,4-二氧六环(100mL)中，125℃条件下回流反应过夜。溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体。
当所述化合物II的R1为ClCO时，经过下述反应条件a得到化合物IV前体：a:化合物II(R1＝ClCO, 1mol)和化合物III(1.2mol)溶于吡啶(100mL)中，室温搅拌反应过夜。向反应液中加入甲醇(2mL)，浓缩后溶于二氯甲烷，并先后以1M HCl溶液和1M NaHCO3溶液洗涤，有机相浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体。
当化合物III的Y1为N3时，经过下述反应条件b得到化合物IV：
反应条件b:将叠氮化合物(N3，10mmol)溶于四氢呋喃(100mL)中，加入去离子水20mL，三苯基磷(20mmol)，反应液加热到45℃搅拌反应3h。将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物。此步反应为N3还原得到NH2的条件，所有涉及该类反应的都是此条件。若III(Y1＝N3)做原料就生成IV (Y2＝NH2),若IV+V的产物(N3化合物)用此条件则生成VI，若XIII做原料则生成XIV的前体。
当化合物III的Y1为COOMe时，所述反应条件b指：将羧基甲酯化合物(COOMe，10mmol)溶于甲醇(100mL)中，滴加1M氢氧化钠的水溶液(5mL)，室温搅拌3小时后，用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩，有机相浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物，这一步就是COOMe反应得到COOH的条件，只生成化合物IV。
反应条件c指:在氮气保护条件下，将羧基化合物，例如化合物IV(COOH，1mmol)和氨基化合物，例如化合物V(NH2，1mmol)溶于DMF(10mL)中，加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC，2mmol)和 4-二甲胺基吡啶(DMAP，1mmol)，室温下反应过夜。将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物(该步反应为NH2和COOH发生酰胺化反应得到CONH的条件，所有涉及该类反应均为此条件。如果用IV+V做原料则生成IV的前体(N3),如果IV+XI用该条件则生成XII,如果XII用条件i处理完的产物再与V反应，则生成XIII。)
反应条件f:在氮气保护条件下，将化合物VII(1mmol)溶于吡啶(10mmol)，搅拌均匀后加入氨基化合物，例如化合物VI(NH2，1.5mmol)和DMAP(0.2mmol)，室温下反应5h。将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物。(VI+VII生成VIII；VII+XIV前体生成XIV)。
反应条件g:在氮气保护条件下，将化合物I的保护基前体(化合物VIII或者XIV)(1mmol)溶于甲醇(10mL)中，滴加1M氢氧化钠的水溶液(1mL)，室温搅拌3小时后，用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩，剩余物溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液 (10mL)中，反应1小时后浓缩，剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化后，得白色固体化合物I。
方法二：
具体步骤如下(其中部分反应步骤与方法一相同)：
所述反应条件e指，在氮气保护条件下，将化合物IV和化合物XI溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XII；
优选地，所述化合物IV、化合物XI、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为1mmol∶ 1-2mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.2-1mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2mmol∶1mmol；
h:在氮气保护条件下，将化合物IX(Y4＝CH2SH，1mmol)，化合物X(1mmol)溶于无水乙醇(20mL) 中，室温反应过夜，溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XI。
i:将Boc保护的氨基化合物(就是化合物XII)(1mmol)溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液(10mL)中，反应1小时后浓缩，剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化后，得到氨基化合物 XIII。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的15种神经氨酸酶抑制剂对各种NA均具有抑制效果，特别是对耐扎那米韦的NA仍有较好的抑制效果。
(2)本发明提供的15种神经氨酸酶抑制剂在细胞水平同样具有很好的病毒抑制效果，对耐扎那米韦的流感病毒也具有很好的抑制效果，可以用于各种流感病毒感染的治疗。
(3)本发明提供的15种神经氨酸酶抑制剂通过小鼠实验验证了其口服给药能获得较好的抗流感效果，同时其脂水分配系数较原有药物高出数十倍，极大地改善了原有药物的水溶性，可制成口服剂，在药物剂型上有重大突破。
附图说明
图1为本发明实验例5的实验小鼠体重变化曲线和生存率曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明所有实验例涉及的试剂均可商购获得，如无特别说明，所有实验操作均为有机化学领域技术人员通常理解的常规操作。
实验例1、以合成化合物I-1为例，其结构式如下：
I-1(m＝2,n＝6,X＝O,Y＝
):
a:化合物II(R1＝Ts,1mmol)和化合物III(n＝6,Y1＝N3,1.2mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)中，125℃条件下回流反应过夜。溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体(就是化合物IV中的Y2＝N3)。
c:将叠氮化合物(上一步产物IV的前体N3化合物，1mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，加入去离子水2mL，三苯基磷(2mmol)，反应液加热到45℃搅拌反应3h。将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物IV(n＝6,X＝O,Y2＝NH2)。
e:在氮气保护条件下，将羧基化合物(COOH，1mmol)和氨基化合物(NH2，1mmol)溶于DMF (10mL)中，加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC，2mmol)和4-二甲胺基吡啶(DMAP，1mmol)，室温下反应过夜。将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物。
f:在氮气保护条件下，将化合物VII(1mmol)溶于吡啶(10mmol)，搅拌均匀后加入氨基化合物(NH2， 1.5mmol)和DMAP(0.2mmol)，室温下反应5h。将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到目标化合物。
g:在氮气保护条件下，将化合物I的保护基前体(1mmol)溶于甲醇(10mL)中，滴加1M氢氧化钠的水溶液(1mL)，室温搅拌3小时后，用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩，剩余物溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液(100mL)中，反应1小时后浓缩，剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化后，得白色固体化合物I。
所得化合物：I-1，白色固体，1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.62-5.63(m,1H),5.32(d,J＝4.9Hz, 1H),4.94(d,J＝7.4Hz,1H),4.52–4.39(m,2H),4.19(d,J＝8.0Hz,1H),3.99-3.94(m,3H),3.67-3.49(m, 11H),3.38-3.16(m,4H),2.39(dd,J＝13.0,2.4Hz,1H),2.14(t,J＝12.0Hz,1H),1.98-1.82(m,10H),1.65– 0.76(m,41H),0.71(s,3H).ESI-HRMS:m/z calculated for C51H87N6O12[M+H]+:975.63820,Found: 975.63751.
实验例2、采用类似于实施例1的方法合成化合物I-2～I-15，(化合物I-1～I-9用合成路线一合成，化合物I-10～I-15用合成路线二合成)以下为化合物结构和数据。
I-2(m＝2,n＝6,X＝OCOO,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.63-5.61(m,1H),5.40 (d,J＝4.4Hz,1H),4.94(d,J＝8.0Hz,1H),4.40–4.28(m,3H),4.17(t,J＝8.4Hz,1H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H), 3.99-3.91(m,13),3.60(m,9H),3.34–3.23(m,4H),2.37-2.30(m,2H),2.09–1.82(m,9H),1.77–0.80(m, 41H),0.71(s,3H).ESI-HRMS:m/zcalculated for C53H89N6O14[M+H]+:1433.64368,Found:1433.64259.
I-3(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.48-5.47(m,1H),5.26(d, J＝4.5Hz,1H),4.90(d,J＝7.7Hz,1H),4.36–4.31(m,2H),4.01-3.89(m,4H),3.69–3.40(m,22H),3.32–3.14(m,4H),3.09(ddd,J＝11.0,7.8,4.0Hz,1H),2.21–2.03(m,2H),1.96–1.62(m,10H),1.55–0.64(m, 41H),0.60(s,3H).ESI-HRMS:m/z calculatedfor C58H101N6O15[M+H]+:1121.73249,Found:1121.73201.
I-4(m＝5,n＝6,X＝OCOO,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.49-5.46(m,1H),5.30 (s,1H),4.84(s,1H),4.40–3.87(m,9H),3.76–3.03(m,24H),2.28(d,J＝8.4Hz,2H),2.01–1.71(m,10H), 1.69–0.67(m,41H),0.62(s,3H).ESI-HRMS:m/zcalculated for C59H101N6O17[M+H]+:1165.72232,Found: 1165.72347.
I-5(m＝11,n＝6,X＝O,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.51-5.50(m,1H),5.28(d, J＝4.0Hz,1H),4.94(d,J＝8.1Hz,1H),4.36–4.25(m,4H),4.14(t,J＝9.2Hz,1H),3.98-3.93(m,3H),3.74– 3.39(m,46H),3.36–3.02(m,7H),2.22–2.12(m,2H),1.92–0.69(m,51H),0.65(s,3H).ESI-HRMS:m/z calculated for C70H125N6O21[M+H]+:1385.88978,Found:1385.88900.
I-6(m＝11,n＝6,X＝OCOO,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.44-5.43(m,1H), 5.30-5.29(m,1H),4.88-4.83(m,1H),4.42–3.82(m,9H),3.79–2.89(m,58H),2.27(d,J＝8.1Hz,2H),2.04– 1.79(m,10H),1.74–0.67(m,41H),0.59(s,3H).ESI-HRMS:m/z calculated for C71H125N6O23[M+H]+: 1429.87961,Found:1429.87860.
I-7(m＝5,n＝12,X＝O,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.48-5.47(m,1H),5.26(d, J＝4.4Hz,1H),4.90(d,J＝8.0Hz,1H),4.36–4.29(m,2H),4.09(t,J＝8.8Hz,1H),3.92-3.86(m,3H),3.66– 3.40(m,20H),3.36–3.03(m,7H),2.21(ddd,J＝13.0,4.4,2.0Hz,1H),2.11–2.06(m,1H),1.95–0.68(m, 53H),0.64(s,3H).ESI-HRMS:m/zcalculated for C64H113N6O15[M+H]+:1205.82639,Found:1205.82797.
I-8(m＝5,n＝3,X＝O,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.49-5.47(m,1H),5.24(d,J ＝4.4Hz,1H),4.92(d,J＝7.6Hz,1H),4.35–4.31(m,2H),4.00–3.89(m,4H),3.66–3.41(m,22H),3.31– 3.15(m,4H),3.04(ddd,J＝11.1,7.8,4.1Hz,1H),2.20–2.01(m,2H),1.94–1.64(m,10H),1.56–0.66(m, 35H),0.60(s,3H).ESI-HRMS:m/zcalculated for C55H95N6O15[M+H]+:1079.68554,Found:1079.68475.
I-9(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.51-5.50(m,1H),5.26(d, J＝4.4Hz,1H),4.90(d,J＝8.0Hz,1H),4.37–4.30(m,2H),4.08(t,J＝9.1Hz,1H),3.89(s,1H),3.69–3.41 (m,24H),3.32–3.15(m,4H),3.06(ddd,J＝11.0,7.8,4.4Hz,1H),2.74-2.69(m,2H),2.25(ddd,J＝13.0,4.4, 2.1Hz,1H),2.14–2.04(m,1H),1.98–1.59(m,10H),1.55–0.68(m,41H),0.60(s,3H).ESI-HRMS:m/z calculated forC58H101N6O15[M+H]+:1121.73249,Found:1121.73396.
I-10(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
R＝H):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ5.49-5.47(m, 1H),5.25(d,J＝4.4Hz,1H),4.92(d,J＝7.8Hz,1H),4.35–4.30(m,2H),4.04-3.89(m,6H),3.69–3.43(m, 22H),3.31–3.07(m,5H),2.20–2.03(m,2H),1.94–0.60(m,54H).ESI-HRMS:m/z calculated for C60H104N7O16[M+H]+:1178.75396,Found:1178.75439.
I-11(m＝5,n＝6,X＝OCOO,Y＝
R＝H):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ 5.47-5.46(m,1H),5.33(s,1H),4.82(s,1H),4.41–3.87(m,11H),3.75–3.03(m,24H),2.22(d,J＝8.5Hz,2H), 2.01–1.71(m,10H),1.69–0.62(m,44H).ESI-HRMS:m/zcalculated for C61H104N7O18[M+H]+:1222.74378, Found:1222.74501.
I-12(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
Z＝6,R’＝Biotin):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ 5.89(s,1H),5.72(d,J＝2.0Hz,1H),5.33–5.31(m,1H),5.02(s,1H),4.58–4.44(m,4H),4.33-4.29(m,2H), 4.15(s,2H),4.04(ddd,J＝9.0,6.4,2.5Hz,1H),3.94-3.10(m,65H),2.94–2.87(m,3H),2.72(d,J＝12.0Hz, 1H),2.59-2.53(m,3H),2.33(ddd,J＝13.0,4.5,2.3Hz,1H),2.22–2.13(m,2H),2.10(s,3H),2.01–1.94(m, 2H),1.90–0.61(s,53H).ESI-HRMS:m/z calculated for C92H157N12O27S2[M+H]+:1926.07225,Found:1926.07108.
I-13(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
Z＝6,R’＝CY3):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ 8.31(t,1H,J＝13.0Hz),7.70–7.64(m,4H),7.16–7.13(m,2H),6.21–6.17(m,2H),5.39–5.38(m,1H),4.55–4.52(m,1H),4.15(s,2H),3.94–3.09(m,55H),2.92–2.85(m,4H),2.52-2.48(m,1H),2.30–1.77(m,11H), 1.67–0.62(m,65H).ESI-HRMS:m/zcalculated for C114H180N12O32S3[M+H]+:2325.19887,Found: 2325.19705.
I-14(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
Z＝6,R’＝CY5):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ 7.82–7.71(m,6H),7.27–7.25(m,2H),6.38(dd,1H,J＝12.4,12.0Hz),6.12–6.04(m,2H),5.74(d,J＝2.2Hz, 1H),5.33–5.29(m,1H),4.50-4.46(m,2H),4.27(dd,J＝10.3,9.1Hz,1H),4.15(s,2H),4.07–3.02(m,61H), 2.91–2.85(m,2H),2.59-2.55(m,1H),2.30–1.80(m,14H),1.70–0.64(m,65H).ESI-HRMS:m/z calculated for C115H182N12O32S3[M+H]+:2339.21452,Found:2339.21549.
I-15(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
Z＝3,R’＝Biotin):1H NMR(500MHz,CDCl3:MeOD＝1:1):δ 5.85(s,1H),5.72(d,J＝1.9Hz,1H),5.31–5.30(m,1H),5.02(s,1H),4.56–4.46(m,4H),4.34-4.26(m,2H), 4.17(s,2H),4.04-3.10(m,54H),2.96–2.90(m,3H),2.71(d,J＝12.0Hz,1H),2.59-2.53(m,3H),2.34–2.19(m, 3H),2.10(s,3H),2.00–1.96(m,2H),1.91–0.60(s,53H).ESI-HRMS:m/z calculated for C86H145N12O24S2[M+ H]+:1793.99361,Found:1793.99429.
实验例3、NA酶活抑制实验：
将纯化后得到的NA蛋白(N1、N5等)分别用20/150的PH值8.0的Tris/NaCl稀释5×、25×、125×、 625×、3125×、15625×后，在黑色96孔酶标板中分别加入10μL不同浓度的NA溶液和10μL PBS后，在 37℃恒温培养箱中孵育30min，每个孔再加入30μL的167μM 4-MUNANA(4-methylumbelliferyl-N- acetylneuraminic acid)荧光底物。用酶标仪测量每分钟的荧光值(excitation wavelengths 355nm、emission wavelengths 460nm)，共测量30min。从结果中选取荧光值在30min内成线性增长且未超过5000RU的 NA浓度作为酶活抑制实验的浓度。将抑制剂(I)分别用PBS按照10倍梯度稀释成合适浓度范围的溶液，然后在黑色96孔板分别加入10μL不同浓度的抑制剂溶液、10μL合适浓度的NA溶液。另外，在其他孔加入10μL的PBS和10μL的合适浓度的NA溶液作为阳性对照，加入20μL的PBS作为阴性对照。将黑色酶标板在37℃恒温培养箱中孵育30min后，每个孔再加入30μL的167μM 4-MUNANA荧光底物后，立即用酶标仪测量30min内荧光值。每个实验重复3次，所得到结果用GraphPadPrism(version 5.0)分析作图后得到不同抑制剂对NA的IC50值。
上表中的I-12、I-13、I-14、I-15化合物的Y基团
中的R为
各自的R基团
中的Z和R`分别如上表所列示。
由上表可以看出，本发明上述各实施例提供的15种流感病毒NA酶抑制剂对各种流感病毒的NA酶均具有抑制效果，特别是对耐扎那米韦的流感病毒(N2(H3N2,E119V))的NA有着更为突出的抑制效果。
实验例4、细胞实验
将通过鸡胚繁殖得到的流感病毒(包括H1N1，H3N2，H3N2(E119V突变株)，H5N1等)按照10 倍梯度用DMEM稀释成不同浓度的病毒溶液。在96孔细胞培养板中接种MDCK细胞，20h后(待细胞长满培养板底部)后，吸除含有血清双抗的DMEM培养基，用灭菌后的PBS溶液冲洗2遍后，加入事前稀释好的病毒溶液100μL。然后将96孔细胞培养板放入37℃含有5％CO2的细胞培养箱中培养48h。每个病毒浓度重复4次。倒置显微镜观察细胞状态，并对每个孔进行ELISA检测试验，所得结果利用 Reed-Muench法计算出流感病毒的TCID50。
将11mM的抑制剂(I)母液用0.22μm的无菌滤器过滤后，加入DMEM培养基按照10倍梯度稀释成合适浓度范围的抑制剂溶液。另外，在96孔细胞培养板中接种MDCK细胞，20h后待细胞长满培养板底部后，吸除含有血清双抗的DMEM培养基，用灭菌后的PBS溶液冲洗2遍后，加入事前稀释好的100 倍TCID50的病毒溶液100μL。然后将96孔细胞培养板放入37℃含有5％CO2的细胞培养箱中孵浴1h后，吸除病毒溶液，用灭菌后的PBS溶液冲洗1遍后，加入不同浓度的抑制剂溶液，然后将96孔细胞培养板放入37℃含有5％CO2的细胞培养箱中培养72h。每个抑制剂浓度重复4次。倒置显微镜观察细胞状态，并对每个孔进行ELISA检测试验，所得结果利用Reed-Muench法计算出不同抑制剂分子针对不同流感病毒的EC50。
由上表可以看出，本发明提供的15种流感病毒NA酶抑制剂在细胞水平同样具有很好的病毒抑制效果，对耐扎那米韦的流感病毒(如上表中的“mutH3N2(E119V)”)也具有更显著的抑制效果，可以用于各种流感病毒感染的治疗。
实验例5、动物实验(连续给药保护小鼠实验)
将30只雌性Balb/c小鼠分成5笼，每笼6只。所有小鼠用5％水合氯醛注射麻醉后，其中4笼每只滴鼻接种104PFU的A/Puerto Rico/8/34(H1N1)流感病毒30μL，另外1笼滴鼻接种PBS 30μL。另外，使用 10％乙醇水溶液分别配置6mg/mL的I-3(m＝5,n＝6,X＝O,Y＝
)溶液与2mg/mL的达菲溶液。
1天后，1笼小鼠麻醉后滴鼻给药15μL剂量为6mg/kg的I-3，1笼小鼠灌胃给药150μL剂量为60mg/kg 的I-3，1笼小鼠灌胃给药150μL剂量为20mg/kg的达菲，1笼小鼠灌胃给药150μL 10％乙醇溶液，最后 1笼小鼠灌胃相同体积的10％乙醇溶液，持续给药7天。每天监测小鼠的体重和体温，持续14天。当小鼠体重下降到起初体重的75％时，视为该小鼠死亡。小鼠体重变化曲线和生存率曲线用GraphPad Prism (version 5.0)分析绘制得到。
由图1的结果可以看出，本发明实验例3提供的化合物I-3在小鼠实验中通过滴鼻和口服给药的方式均可百分百保护感染小鼠，因此本发明的化合物具有开发为口服抗流感药物的潜力。
本发明其它实施例1-2、4-15提供的化合物I1-2、I4-15均能获得如图1所示的类似I-3口服给药抗流感效果，为节约本发明的篇幅，在此不一一赘述。
实验例6、本发明流感病毒NA酶抑制剂的水溶性效果验证
本发明流感病毒NA酶抑制剂的水溶性效果通过测定脂水分配系数进行验证：
将正辛醇和二次蒸馏水在室温下用恒温(37±1)℃摇床振荡24h,使其相互饱和。静置过夜分层后，两相分离，保存备用。精密称取适量待测化合物于10mL容量瓶中，用水饱和的正辛醇溶解，超声振荡30min，定容，得到浓度为1mmol/L的母液。分别用移液枪精密量取一定量总溶液于10mL容量瓶中，用水饱和的正辛醇稀释并定容为10～100μmol/L系列浓度，浓度增加梯度为10μmol/L，分别在200～400nm波长范围内扫描，取最大吸收峰处吸光度绘制化合物的标准回归方程。
分别用移液枪精密量取500μL和1000μL待测化合物母液于250mL容量瓶中，以水饱和的正辛醇溶解，超声振荡30min，定容，分别取3份5mL的该溶液与5mL正辛醇饱和的水混合后置于恒温摇床中，室温下振荡24h，然后离心使两相充分分离，紫外可见分光光度计室温下分别测定化合物在有机相和水相的紫外吸收光谱，根据标准回归方程即可计算有机相、水相中待测化合物的浓度，然后再按公式log Po/w＝log(co/cw)计算化合物的脂水分配系数，每种浓度测定3次，取平均值计得该化合物的脂水分配系数。
脂水分配系数(log P)是衡量药物能否透过由脂质双分子层构成的生物膜的主要指标，关系到药物在人体的吸收、分配、代谢、排泄等药代动力学过程，log P数值越小，说明化合物的疏水性越强，在体内越容易被代谢，具有较高的清除率(例如扎那米韦)，log P数值越大说明化合物的亲脂性越强。通过上述数据说明，本发明所设计化合物的脂水分配系数普遍较扎那米韦较有显著提高，能够达到改善扎那米韦水溶性的目的，预期能够显著改善化合物的药代动力学性质，具有很好的成药潜力。
以下为本发明涉及的其他中间体化合物数据：
IV-1(n＝6,X＝O,Y2＝NH2):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.39–5.37(m,1H),3.42(td,J＝6.7,2.4Hz,2H), 3.17(tt,J＝11.0,4.0Hz,1H),2.76(t,J＝7.1Hz,2H),2.35(ddd,J＝13.0,4.4,2.0Hz,1H),2.20–2.15(m,1H), 2.03–1.92(m,2H),1.90–1.77(m,3H),1.67–0.79(m,41H),0.68(s,3H).ESI:m/z calculated for C33H60NO [M+H]+:486.5,found:486.4.
IV-2(n＝6,X＝OCOO,Y2＝NH2):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.44–5.41(m,1H),4.44(ddd,J＝16.2, 10.8,5.3Hz,1H),4.11(t,J＝6.6Hz,2H),2.67(t,J＝6.9Hz,2H),2.44–2.31(m,2H),2.06–1.79(m,5H),1.77 –0.80(m,41H),0.68(s,3H).ESI:m/z calculatedfor C34H60NO3[M+H]+:530.4,found:530.5.
IV-3(n＝12,X＝O,Y2＝NH2):δ5.32–5.31(m,1H),3.46(td,J＝6.4,2.0Hz,2H),3.17(tt,J＝11.2,4.4Hz, 1H),2.76(t,J＝7.0Hz,2H),2.34(ddd,J＝13.0,4.4,2.0Hz,1H),2.27–2.17(m,1H),2.04–1.96(m,2H),1.90 –1.76(m,3H),1.60–0.70(m,53H),0.65(s,3H).ESI:m/z calculated for C39H72NO[M+H]+:570.6,found: 570.5.
IV-4(n＝3,X＝O,Y2＝NH2):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.49–5.47(m,1H),4.46(ddd,J＝16.0,10.2,5.0 Hz,1H),4.14(t,J＝6.2Hz,2H),2.66(t,J＝6.7Hz,2H),2.42–2.29(m,2H),2.14–1.79(m,5H),1.75–0.74 (m,35H),0.64(s,3H).ESI:m/z calculatedfor C30H54NO[M+H]+:444.4,found:444.5.
IV-5(n＝6,X＝O,Y2＝COOH):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.35–5.34(m,1H),3.45(td,J＝6.6,2.3Hz, 2H),3.12(tt,J＝11.3,4.4Hz,1H),2.42-2.35(m,3H),2.22–2.15(m,1H),2.05–1.94(m,2H),1.92–1.77(m, 3H),1.64–0.77(m,41H),0.68(s,3H).ESI:m/zcalculated for C33H57O3[M+H]+:501.4,found:501.4.
VI-1(m＝2,n＝6,X＝O,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.98(br s,1H),5.39–5.37(m,1H), 3.98(s,2H),3.89-3.72(m,6H),3.42(td,J＝6.7,2.4Hz,2H),3.22-3.19(m,3H),2.76(t,J＝7.1Hz,2H),2.35 (ddd,J＝13.0,4.4,2.0Hz,1H),2.20–2.15(m,1H),2.03–1.92(m,2H),1.90–1.77(m,3H),1.67–0.79(m, 41H),0.68(s,3H).ESI:m/zcalculated for C38H69N2O4[M+H]+:617.5,found:617.5.
VI-2(m＝2,n＝6,X＝OCOO,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.96(br s,1H),5.44–5.41(m, 1H),4.44(ddd,J＝16.2,10.8,5.3Hz,1H),4.11(t,J＝6.6Hz,2H),3.98(s,2H),3.89-3.72(m,6H),3.22-3.19(m, 2H),2.67(t,J＝6.9Hz,2H),2.44–2.31(m,2H),2.06–1.79(m,5H),1.77–0.80(m,41H),0.68(s,3H).ESI: m/z calculated for C40H71N2O6[M+H]+:675.5,found:675.5.
VI-3(m＝5,n＝6,X＝O,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.97(br s,1H),5.38–5.36(m,1H), 3.92(s,2H),3.79-3.42(m,20H),3.21-3.17(m,3H),2.78(t,J＝7.0Hz,2H),2.35-2.31(m,1H),2.22–2.17(m, 1H),2.03–1.92(m,2H),1.90–1.72(m,3H),1.64–0.79(m,44H).ESI:m/z calculated for C45H83N2O7[M+ H]+:763.6,found:763.6.
VI-4(m＝5,n＝6,X＝OCOO,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.98(br s,1H),5.44–5.42(m, 1H),4.46(ddd,J＝16.0,10.6,5.0Hz,1H),4.13(t,J＝6.8Hz,2H),3.88(s,2H),3.74-3.42(m,18H),3.22-3.19 (m,2H),2.67(t,J＝6.8Hz,2H),2.44–2.36(m,2H),2.02–1.81(m,5H),1.76–0.80(m,41H),0.68(s,3H). ESI:m/z calculated for C46H83N2O9[M+H]+:807.6,found:807.6.
VI-5(m＝11,n＝6,X＝O,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.96(br s,1H),5.38–5.37(m,1H), 3.96(s,2H),3.72-3.42(m,44H),3.22-3.17(m,3H),2.74(t,J＝7.2Hz,2H),2.31-2.26(m,1H),2.19–2.15(m, 1H),2.03–1.96(m,2H),1.91–1.77(m,3H),1.67–0.72(m,41H),0.64(s,3H).ESI:m/z calculated for C57H103N2O13[M+H]+:1023.7,found:1023.8.
VI-6(m＝11,n＝6,X＝OCOO,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.01(br s,1H),5.44–5.42(m, 1H),4.44-4.41(m,1H),4.15(t,J＝6.8Hz,2H),3.89(s,2H),3.74-3.22(m,44H),2.64(t,J＝6.7Hz,2H),2.44– 2.31(m,2H),2.04–1.79(m,5H),1.75–0.80(m,41H),0.66(s,3H).ESI:m/z calculated for C58H106N2O15[M+ H]+:1070.8,found:1070.7.
VI-7(m＝5,n＝12,X＝O,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.01(br s,1H),5.35–5.33(m,1H), 3.88(s,2H),3.79-3.62(m,18H),3.42-3.40(m,2H),3.22-3.16(m,3H),2.79(t,J＝7.2Hz,2H),2.34-2.30(m, 1H),2.26–2.17(m,1H),2.03–1.96(m,2H),1.92–1.76(m,3H),1.62–0.70(m,56H).ESI:m/z calculated for C51H95 N2O7[M+H]+:847.7,found:847.7.
VI-8(m＝5,n＝3,X＝O,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.94(br s,1H),5.37–5.35(m,1H), 3.94(s,2H),3.76-3.42(m,20H),3.20-3.17(m,3H),2.75(t,J＝7.2Hz,2H),2.36-2.31(m,1H),2.22–2.16(m, 1H),2.02–1.95(m,2H),1.90–1.74(m,3H),1.66–0.75(m,38H).ESI:m/z calculated for C42H77N2O7[M+ H]+:721.6,found:721.5.
VI-9(m＝5,n＝6,X＝O,Y3＝
):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.09(br s,1H),5.36–5.34(m,1H), 3.89-3.72(m,18H),3.44-3.12(m,6H),2.49-2.35(m,3H),2.20–2.12(m,1H),2.02–1.94(m,2H),1.92–1.77 (m,3H),1.67–0.72(m,41H),0.64(s,3H).ESI:m/zcalculated for C45H83N2O7[M+H]+:763.6,found:763.6.
XII-1(n＝6,X＝O,Y5＝H):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.29(br s,1H),5.39–5.32(m,2H),3.46-3.22(m, 6H),3.10(tt,J＝11.0,4.4Hz,1H),2.31(ddd,J＝13.0,4.4,2.0Hz,1H),2.22–2.15(m,1H),2.02–1.94(m,2H), 1.90–1.77(m,3H),1.64–0.64(m,53H).ESI:m/zcalculated for C40H71N2O4[M+H]+:643.5,found:643.6.
XII-2(n＝6,X＝OCOO,Y5＝H):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.36(br s,1H),5.49–5.39(m,2H),4.41(ddd, J＝16.0,10.4,5.4Hz,1H),4.17(t,J＝6.8Hz,2H),3.44-3.29(m,4H),2.41–2.30(m,2H),2.04–1.78(m,5H), 1.73–0.68(m,53H).ESI:m/z calculated forC41H71N2O6[M+H]+:687.5,found:687.5.
XII-3(n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝6,R’＝Biotin):1H NMR(500MHz,MeOD):δ5.86(s,1H),5.35–5.34(m, 1H),5.06(s,1H),4.58–4.51(m,2H),4.33-4.30(m,1H),3.84-3.80(m,3H),3.66–3.62(m,24H),3.53-3.40(m, 8H),3.46-3.10(m,7H),2.94–2.90(m,3H),2.73(d,J＝12.6Hz,1H),2.55-2.52(m,3H),2.31(ddd,J＝13.0,4.4, 2.0Hz,1H),2.24–2.15(m,2H),2.02–1.94(m,2H),1.90–1.77(m,3H),1.64–0.64(s,59H).ESI:m/z calculated forC72H124N7O15S2[M+H]+:1390.9,found:1390.9.
XII-4(n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝6,R’＝CY3):1H NMR(500MHz,MeOD):δ8.30(t,1H,J＝13.4Hz), 7.70–7.62(m,4H),7.18–7.15(m,2H),6.20–6.15(m,2H),5.39–5.38(m,1H),4.56–4.52(m,1H),3.94–3.09 (m,35H),2.94–2.85(m,4H),2.50-2.46(m,1H),2.31–1.77(m,11H),1.64–0.64(m,74H).ESI:m/z calculated for C93H147N7O20S3[M+H]+:1778.0,found:1778.0.
XII-5(n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝6,R’＝CY5):1H NMR(500MHz,MeOD):δ7.88–7.72(m,6H),7.27–7.25(m, 2H),6.32(dd,1H,J＝12.4,12.0Hz),6.10–6.02(m,2H),5.31–5.26(m,1H),4.07–3.02(m,37H),2.92–2.86 (m,2H),2.55-2.52(m,1H),2.30–1.82(m,11H),1.72–0.64(m,74H).ESI:m/z calculated for C95H149N7O20S3 [M+H]+:1804.0,found:1804.0.
XII-6(n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝3,R’＝Biotin):1H NMR(500MHz,MeOD):δ5.89(s,1H),5.34–5.32(m, 1H),5.02(s,1H),4.56–4.50(m,2H),4.33-4.28(m,1H),3.83-3.77(m,3H),3.66–3.62(m,12H),3.53-3.10(m, 15H),2.97–2.92(m,3H),2.71(d,J＝12.0Hz,1H),2.58-2.54(m,3H),2.31–2.19(m,3H),2.00–1.93(m,2H), 1.90–0.64(s,62H).ESI:m/zcalculated for C66H112N7O12S2[M+H]+:1258.8,found:1258.8.
XIII-1(m＝5,n＝6,X＝O,Y5＝H):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.75(br s,1H),6.42(br s,1H),5.39–5.37 (m,1H),4.12(s,2H),3.76-3.22(m,27H),3.12(tt,J＝11.2,4.5Hz,1H),2.30(ddd,J＝13.2,4.7,2.1Hz,1H), 2.20–2.15(m,1H),2.00–1.93(m,2H),1.90–1.79(m,3H),1.64–0.65(m,44H).ESI:m/z calculated for C47H84N5O8[M+H]+:846.6,found:846.6.
XIII-2(m＝5,n＝6,X＝OCOO,Y5＝H):1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.68(br s,1H),6.46(br s,1H),5.41– 5.39(m,1H),4.40(ddd,J＝15.8,10.2,5.3Hz,1H),4.19-4.15(m,3H),3.76-3.29(m,24H),2.40–2.31(m,2H), 2.02–0.68(m,49H).ESI:m/z calculated forC48H84N5O10[M+H]+:890.6,found:890.6.
XIII-3(m＝5,n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝6,R’＝Biotin):1H NMR(500MHz,MeOD):δ5.89(s,1H),5.34– 5.32(m,1H),5.04(s,1H),4.56–4.50(m,2H),4.34-4.32(m,1H),4.18(s,2H),3.84-3.10(m,62H),2.92–2.87 (m,3H),2.74(d,J＝12.4Hz,1H),2.58-2.53(m,3H),2.30(ddd,J＝13.1,4.4,2.2Hz,1H),2.22–2.13(m,2H), 2.02–1.94(m,2H),1.91–1.78(m,3H),1.64–0.61(s,50H).ESI:m/z calculated for C79H137N10O19S2[M+H]+: 1594.0,found:1593.9.
XIII-4(m＝5,n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝6,R’＝CY3):1H NMR(500MHz,MeOD):δ8.31(t,1H,J＝13.0Hz), 7.70–7.64(m,4H),7.16–7.13(m,2H),6.21–6.17(m,2H),5.39–5.38(m,1H),4.55–4.52(m,1H),4.15(s,2H), 3.94–3.09(m,55H),2.92–2.85(m,4H),2.52-2.48(m,1H),2.30–1.77(m,11H),1.67–0.62(m,65H).ESI: m/z calculated for C100H160N10O24S3[M+H]+:1981.1,found:1981.1.
XIII-5(m＝5,n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝6,R’＝CY5):1H NMR(500MHz,MeOD):δ7.86–7.70(m,6H), 7.27–7.25(m,2H),6.39(dd,1H,J＝12.4,12.0Hz),6.14–6.06(m,2H),5.30–5.28(m,1H),4.19(s,2H),4.07– 3.02(m,57H),2.90–2.85(m,2H),2.57-2.53(m,1H),2.30–1.80(m,11H),1.70–0.61(m,65H).ESI:m/z calculated for C102H162N10O24S3[M+H]+:2007.1,found:2007.1.
XIII-6(m＝5,n＝6,X＝O,Y5＝R,Z＝3,R’＝Biotin):1H NMR(500MHz,MeOD):δ5.88(s,1H),5.33– 5.32(m,1H),5.00(s,1H),4.58–4.53(m,2H),4.32-4.28(m,1H),4.16(s,2H),3.83-3.10(m,50H),2.97–2.92 (m,3H),2.70(d,J＝12.2Hz,1H),2.58-2.54(m,3H),2.33–2.19(m,3H),2.00–1.93(m,2H),1.90–0.63(s, 53H).ESI:m/z calculated forC73H125N10O16S2[M+H]+:1461.9,found:1461.9。
Claims (10)
1.一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制剂结构通式如下：
其中：
m选自2-11中的任一自然数，n选自3-12中的任一自然数，X选自OCOO或O；
Y选自
或，
所述
中的R选自：
H、或，
所述
中的R`为H或荧光标记基团，Z选自3-6中的任一自然数。
2.根据权利要求1所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述R`选自：生物素，CY3，CY5，或，FITC。
3.根据权利要求1所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，其选自化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、I-12、I-13、I-14或I-15；
化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、I-12、I-13I-14和I-15均具有如下结构通式：
化合物I-1的m为2，n为6，X为O，Y为
I-2的m为2，n为6，X为OCOO，Y为
I-3的m为5，n为6，X为O，Y为
I-4的m为5，n为6，X为OCOO，Y为
I-5的m为11，n为6，X为O，Y为
I-6的m为11，n为6，X为OCOO，Y为
I-7的m为5，n为12，X为O，Y为
I-8的m为5，n为3，X为O，Y为
I-9的m为5，n为5，X为O，Y为
I-10的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为H；
I-11的m为5，n为6，X为OCOO，Y为
其中，
中的R为H；
I-12的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，所述
中的R为
所述
中的Z为6，R`为生物素；
I-13的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为
所述
中的Z为6，R`为CY3；
I-14的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为
所述
中的Z为6，R`为CY5；或，
I-15的m为5，n为6，X为O，Y为
其中，
中的R为为
所述
中的Z为3，R`为生物素。
4.一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，将化合物VIII或化合物XIV经反应条件g制得所述流感病毒神经氨酸酶抑制剂；
所述化合物VIII的结构式为
其中，m为2-11中的任一自然数，n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y3为
所述化合物XIV的结构式为
其中，m为2-11中的任一自然数，n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y5为H或R；所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述反应条件g指：将化合物VIII或XIV溶于溶剂中，滴加氢氧化钠水溶液，室温搅拌3小时后，用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩，浓缩后的剩余物溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液中，反应1小时后浓缩，浓缩后的剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化。
5.根据权利要求4所述的一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述化合物VIII由下述步骤制得：
将化合物II与化合物III经反应条件a得到化合物IV前体，再经反应条件b得到化合物IV；
化合物IV与化合物V经反应条件c得到化合物VI；
将化合物VI与化合物VII经反应条件f得到化合物VIII；
所述化合物II为
其中R1为ClCO或Ts；
所述化合物III为
其中n为3-12中的任一自然数，Y1为N3或COOMe；
所述化合物IV为
其中n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y2为NH2或COOH；
所述化合物V为
其中m为2-11中的任一自然数，R2为
所述化合物VI为
其中m为2-11中的任一自然数，n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y3为
所述化合物VII为
当所述化合物II的R1为Ts时，所述反应条件a指，将化合物II与化合物III溶于非极性溶剂中，100-150℃条件下回流反应过夜，溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体；
当所述化合物II的R1为ClCO时，所述反应条件a指，化合物II和化合物III溶于吡啶中，室温搅拌反应过夜；向反应液中加入甲醇，浓缩后溶于溶剂，并先后以HCl溶液和NaHCO3溶液洗涤，有机相浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV的前体；
当化合物III的Y1为N3时，所述反应条件b指：将化合物IV前体溶于四氢呋喃中，加入去离子水，三苯基磷，反应液加热到40-60℃，优选45℃，搅拌反应1-12h，优选3h；将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV；
当化合物III的Y1为COOMe时，所述反应条件b指：将化合物IV前体溶于溶剂中，滴加氢氧化钠水溶液，室温搅拌1-6小时，优选3小时，然后用Dowex-50(H+)离子交换树脂中和至溶液pH值为7，过滤后溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物IV；
所述反应条件c指，在氮气保护条件下，将化合物IV和化合物V溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物VI；
所述反应条件f指，在氮气保护条件下，将化合物VII溶于吡啶，搅拌均匀后加入化合物VI和DMAP，室温下反应2-10h，优选5h；将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物VIII。
6.根据权利要求4所述的一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述化合物XIV通过下述步骤制得：
化合物IX与化合物X1通过反应条件h得到化合物XI；
化合物XI与化合物IV通过反应条件e得到化合物XII；
化合物XII与化合物V通过反应条件i得到化合物XIII；
化合物XIII与化合物VII通过反应条件f得到化合物XIV；
所述化合物IX为
其中Y4为H或CH2SH；
所述化合物X1为
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物XI为
其中Y5＝H或R，所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物XII为
其中Y5为H或R，所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物XIII为
其中Y5为H或R，所述R指
其中R`为生物素、CY3或CY5；
所述化合物IV为
其中n为3-12中的任一自然数，X为OCOO或O，Y2为NH2或COOH；
所述化合物V为
其中m为2-11中的任一自然数，R2为
所述化合物VII为
所述反应条件h指，在氮气保护条件下，将化合物IX，化合物X1溶于溶剂中，室温反应过夜，溶液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XI；
优选地，所述化合物IX、X1、无水乙醇的用量比例为1mmol∶1mmol∶2-50ml，优选1mmol∶1mmol∶20ml；
所述溶剂选自由无水乙醇、水、甲醇组成的组，优选乙醇；
所述反应条件e指，在氮气保护条件下，将化合物IV和化合物XI溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XII；
优选地，所述化合物IV、化合物XI、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为1mmol∶1-2mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.2-1mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2mmol∶1mmol；
所述反应条件i指，将化合物XII溶于二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液中，反应1-3h，优选1小时，然后浓缩，剩余物经Sephadex G-15凝胶柱分离纯化后，得到处理后的化合物XII；
优选地，所述化合物XII、二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液的用量比例为1mmol∶1-50mL，优选1mmol∶10mL；
将所述处理后的化合物XII与化合物V溶于DMF中，加入N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶，室温下反应过夜，将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XIII；
优选地，所述化合物IV、化合物XI、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为1mmol∶1-2mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.1-1mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2mmol∶1mmol；
所述反应条件f指：在氮气保护条件下，将化合物VII溶于吡啶，搅拌均匀后加入化合物XIII和DMAP，室温下反应1-12h，优选5h，然后将反应液浓缩后经硅胶层析柱分离，得到化合物XIV；
优选地，所述化合物VII、化合物XIII、吡啶、DMAP的用量比例为体积比1∶2-50∶1-3∶0.1-1，优选1∶10∶1.5∶0.2。
7.根据权利要求4所述的一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述反应条件g 中，所述溶剂选自由甲醇、乙醇、水组成的组；
所述化合物VIII或XIV、甲醇、氢氧化钠水溶液、二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1/1的混合溶液的用量比例为1mmol∶1-100mL∶0.5-2M∶1-100mL。
8.根据权利要求5所述的一种流感病毒神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，
当所述化合物II的R1为Ts时，所述反应条件a中，所述化合物II、化合物III、非极性溶剂的用量比例为1mol∶1-1.5mol∶10-200ml；优选1mol∶1.2mol∶100ml；所述非极性溶剂为1,4-二氧六环；回流反应过夜的温度条件为125℃；
当所述化合物II的R1为ClCO时，所述反应条件a中，所述溶剂选自二氯甲烷或氯仿；所述化合物II、化合物III、吡啶、甲醇、二氯甲烷、HCl溶液、NaHCO3溶液的用量比例为1mol∶1.2mol∶100mL∶2mL∶100mL∶1M∶1M；
当化合物III的Y1为N3时，所述反应条件b中，所述化合物IV、四氢呋喃、去离子水、三苯基磷的用量比例为10mmol∶10-100ml∶10-100ml∶10-50mmol，优选10mmol∶100ml∶20ml∶20mmol；
当化合物III的Y1为COOMe时，所述反应条件b中，所述化合物IV前体、甲醇、氢氧化钠水溶液用量比例为10mmol∶10-200mL∶0.5-2M，优选10mmol∶100mL∶1M；所述溶剂选自由甲醇、乙醇、水组成的组，优选甲醇；
所述反应条件c中，所述化合物IV、化合物V、DMF、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲胺基吡啶用量比例为1mmol∶1-3mmol∶1-50ml∶1-6mmol∶0.1-2mmol，优选1mmol∶1mmol∶10ml∶2mmol∶1mmol；
所述反应条件f中，所述化合物VII、吡啶、化合物VI、DMAP的用量比例为体积比1∶1-50∶1-3∶0.1-1，优选1∶10∶1.5∶0.2。
9.权利要求1-3任一所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂，和/或，权利要求5-8任一所述的制备方法制备得到的流感病毒神经氨酸酶抑制剂在制备抗流感药物方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自：口服剂、滴鼻剂、注射剂、鼻喷雾剂。
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