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一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，本发明首先将共轭亚油酸乙酯化，然后使用四区模拟移动床系统依次去除后杂和前杂，最后进行异构体分离，分别收集萃取口和萃余口流出液，减压旋蒸至干，得到共轭亚油酸两个异构体。本发明利用高效模拟移动床技术分离制备具有降糖、降脂关键活性的CLA单一异构体c9,t11‑CLA和t10,c12‑CLA，建立了共轭亚油酸两个异构体c9,t11‑CLA和t10,c12‑CLA分离技术体系。本发明的方法可以规模化生产高纯度共轭亚油酸两个异构体c9,t11‑CLA和t10,c12‑CLA，从而实现CLA高值化利用，进一步提升共轭亚油酸产品研发。

Description

一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的 方法
技术领域
本发明属于亚油酸单体制备领域，具体涉及一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法。
背景技术
共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是亚油酸的异构体，是普遍存在于人和动物体内的天然活性营养物质，是天然的脂类、糖类代谢调节因子。国内外大量的研究证明，CLA具有抗癌、降低人和动物体内脂肪、增加肌肉、抗动脉粥样硬化、抗氧化、提高免疫力、增加骨骼密度、调节血糖等多种重要生理功能。共轭亚油酸已广泛应用于保健品、功能食品及食品添加剂等领域。
CLA是一类含有共轭双键的十八碳二烯酸异构体混合物。c9，t11-CLA和t10，c12-CLA是共轭亚油酸中含量最多的两种异构体。共轭亚油酸众多的生理作用主要与c9，t11-CLA和t10，c12-CLA异构体有关。共轭亚油酸异构体单体生物学功能差异很大，国内外研究证实两个主要异构体c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的生理功能有所不同，t10，c12-CLA异构体具有降脂和提高免疫力功能，而c9，t11-CLA具有抗癌和降血糖功能，这两种异构体是CLA中主要的功能因子。
目前国内外食用的共轭亚油酸医用食品、新资源食品和保健品等产品都是多种异构体组成混合物，不是单一的异构体，为了实现共轭亚油酸营养功能的专一性，更好实现其特定营养作用，尽可能避免其它多种功能的干扰，目前共轭亚油酸功能性产品发展的趋势是生产这两种异构体中一种为主(最好是单一异构体)产品。CLA单一异构体产品功效要比共轭亚油酸异构体混合物有极大提升，能实现单一成分产品对症治疗，并为其药用开发奠定坚实的基础。
国内外尚未见共轭亚油酸异构体单一组分产品的研发，常规的尿素包埋方法很难制备高纯CLA，更无法分离其异构体单体。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，利用该方法可以规模化生产高纯度共轭亚油酸两个异构体c9，t11-CLA和t10，c12-CLA，从而实现CLA高值化利用。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将共轭亚油酸和无水乙醇混合，滴加氯化亚砜，搅拌得到混合液；将混合液旋蒸，加入正己烷、食盐水，分液取有机相，洗涤、干燥、过滤，旋蒸得共轭亚油酸乙酯；
(2)将共轭亚油酸乙酯溶于无水乙醇，得到进样液1，将所述进样液1利用四区模拟移动床系统去后杂，以按比例混合的乙醇和水为洗脱液，收集萃余口流出液，得中间体1；
(3)将中间体1溶于无水乙醇，得到进样液2，将所述进样液2利用四区模拟移动床系统去前杂，以按比例混合的乙醇和水为洗脱液，收集萃取口流出液，得到中间体2；
(4)将中间体2溶于甲醇，得到进样液3，将所述进样液3通入四区模拟移动床系统中，以甲醇、乙腈和水为洗脱液，收集萃取口流出液得c9，t11-CLA，收集萃余口流出液得t10，c12-CLA。
进一步的，所述步骤(2)和(3)中四区模拟移动床系统中使用的色谱柱为C18硅胶柱。
进一步的，所述步骤(2)中乙醇和水的体积比75∶25～60∶40。
进一步的，所述步骤(2)中进样液1的浓度为20～25mg/mL。
进一步的，所述步骤(3)中乙醇和水的体积比为40∶60～50∶50。
进一步的，所述步骤(3)中进样液2的浓度为20～25mg/mL。
进一步的，所述步骤(4)中进样液3浓度为20～30mg/mL。
进一步的，所述步骤(4)中甲醇：乙腈：水体积比为45∶25∶30～40∶30∶30。
进一步的，所述步骤(4)中所述四区模拟移动床系统中使用的色谱柱为氰基色谱柱。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：本发明利用高效模拟移动床技术分离制备具有降糖、降脂关键活性的CLA单一异构体c9，t11-CLA和t10，c12-CLA，突破了≥90％高纯度c9，t11-CLA和t10，c12-CLA单体制备的技术瓶颈，建立了共轭亚油酸两个异构体c9，t11-CLA和t10，c12-CLA分离技术体系。利用该方法可以规模化生产高纯度共轭亚油酸两个异构体c9，t11-CLA和t10，c12-CLA，从而实现CLA高值化利用，进一步提升共轭亚油酸产品研发。
附图说明
图1为SMBC四区结构示意图；
图2为共轭亚油酸原料的气相分析色谱图；
图3为中间体1的气相分析色谱图；
图4为中间体2的气相分析色谱图；
图5为产品1的气相分析色谱图；
图6为产品2的气相分析色谱图；
图7为对照品c9，t11-CLA的气相色谱图；
图8为对照品t10，c12-CLA的气相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
一、原料
由青岛澳海生物有限公司提供，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA合计含量约为80％。
二、仪器
仪器型号为：CSEP9116模拟移动床，德国诺尔科学仪器有限公司生产。
应用四区模拟移动床进行分离，每区布置2根色谱柱(SB-CN)，纯化分离工艺流程见图1。
原料液(Feed)和洗脱液(Desorbent)连续流入模拟移动床色谱(SMBC)系统，c9，t11-CLA从萃取口(Extract)流出，t10，c12-CLA从萃余口(Raffinate)流出。
三、利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法
1、乙酯化
所供原料为酸，为有效进行分离，需进行乙酯化。乙酯化由CLA与乙醇在氯化亚砜的催化下进行反应，为避免乙酯化时CLA发生构型变化，反应在低温下进行。具体步骤如下：
(1)向烧瓶中加入共轭亚油酸14.12g(50mmol)和无水乙醇282mL，搅拌，冷至0℃以下，向反应液中滴加氯化亚砜8.33g(70mmol)，控制滴加速度为每秒1滴，滴毕，0℃搅拌0.5小时，撤除冰浴，室温搅拌6.0h，TLC确认到达反应终点。
(2)控制水浴40℃以下，旋蒸去除过量的氯化亚砜和乙醇，加乙醇20mL共蒸二次，加入正己烷200mL，食盐水200mL，搅拌30分钟，分液，取有机相，用去离子水200mL洗2-3次，少量无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸脱溶得共轭亚油酸乙酯约15g，直接用于分离。
经乙酯化后，进行了气相色谱分析，气相检测结果见图2、表1，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA合计含量为80.5％。
表1.共轭亚油酸原料分析结果
Figure BDA0002387055140000041
2、SMB分离
(1)去后杂，目的是将共轭亚油酸后面的杂质去掉。
去除CLA气相色谱图中，主峰后面的杂质。
色谱柱：C18硅胶柱，5μm，4.6mm×150mm。
流动相：乙醇∶水(73∶27)。
原料溶液：将乙酯化的原料用无水乙醇配成浓度为25mg/mL的溶液。
切换时间：5min，I-IV区流量依次4.0mL/min、3.5mL/min、3.5mL/min和3.0mL/min。
收集萃余口流出液，减压旋蒸至干得中间体1，直接用于下步分离。
中间体1气相色谱分析图见图3、表2，表明后杂去除干净。
表2 中间体1气相分析色谱图分析结果
Figure BDA0002387055140000051
(2)去前杂，目的是将共轭亚油酸前面的杂质去掉。
样品在去除CLA后杂后，再去除前杂。
色谱柱：C18硅胶柱，5μm，4.6mm×150mm。
流动相：乙醇∶水(43∶57)。
中间体1溶液：将中间体1用无水乙醇配成浓度为25mg/mL的溶液。
切换时间：4.5min，I-IV区流量依次3.5mL/min、3.0mL/min、3.5mL/min和2.5mL/min。
收集萃取口流出液，减压旋蒸至干中间体2，直接用于下步分离。
中间体2气相色谱分析图见图4、表3，表明前杂去除基本干净。
表3 中间体2气相分析色谱图分析结果
Figure BDA0002387055140000052
(3)异构体分离
将去除杂质后的CLA混合物进行分离，分离出单体。
色谱柱：氰基色谱柱，5μm，4.6mm×150mm。
流动相：甲醇∶乙腈∶水(46∶26∶28)。
中间体2溶液：将中间体2用甲醇配成浓度为25mg/mL的溶液。
切换时间：5.0min，I-IV区流量依次3.5mL/min、3.5mL/min、3.3mL/min和3.0mL/min。
分别收集萃取口和萃余口流出液，减压旋蒸至干，得产品1和产品2。
产品1和产品2气相色谱分析图见图5、表4和图6、表5，经与标准品气相色谱图比较，证明产品1为c9，t11-CLA，产品2为t10，c12-CLA。
表4 产品1气相分析色谱图分析结果
Figure BDA0002387055140000061
表5 产品2气相分析色谱图分析结果
Figure BDA0002387055140000062
四、结构表征
本发明产品采用与对照品气相色谱图保留时间比较的方式鉴定结构。
1、对照品
对照品c9，t11-CLA和t10，c12-CLA均购自Sigma公司。两者都是自由酸形式。
2、溶液的制备
2.1对照品溶液的制备
向烧瓶中加入共轭亚油酸(c9，t11-CLA)5mg和无水乙醇2mL，搅拌，冷至0℃以下，向反应液中滴加氯化亚砜1滴，控制0℃搅拌0.5小时，撤除冰浴，室温搅拌6.0h。水浴40℃以下，旋蒸去除过量的氯化亚砜和乙醇，加乙醇2mL共蒸一次，加入正己烷10mL，食盐水5mL，搅拌30分钟，分液，取有机相，用去离子水5mL洗2-3次，旋蒸脱溶，加入无水乙醇2mL共蒸两次至干，再加无水乙醇溶解，定容至50mL即为共轭亚油酸(c9，t11-CLA)对照品溶液。
共轭亚油酸(t10，c12-CLA)对照品溶液同法制备。
2.2样品溶液的制备
精密称取产品12mg置20mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，得产品1样品溶液。
产品2样品溶液同法制取。
3、气相条件
色谱仪：Agilent 7890气相色谱仪。
色谱柱规格：Agilent DB-FFAP(30m×0.32mm，0.25um)。
进样口温度250℃，分流比3∶1，载气为氮气，流量4mL/min(恒流)，检测器温度260℃，进样体积1ul。
升温程序：初始值190℃，保持4分钟，以每分钟2℃升温至230℃。保持10分钟。
将对照品溶液和样品溶液各1ul进入色谱仪，记录色谱图，比较样品溶液和对照品深液主成分色谱峰保留时间，确定产品1和产品2构型。
产品1和产品2气相色谱图见图5、表4和图6、表5，对照品c9，t11-CLA和t10，c12-CLA色谱图见图7、表6和图8、表7。
表6 对照品c9，t11-CLA气相色谱图分析结果
Figure BDA0002387055140000071
表7 对照品t10，c12-CLA气相色谱图分析结果
Figure BDA0002387055140000072
比较图5、图6和图7、图8气相色谱图，确定产品1构型为9Z，11E，产品2构型为10E，12Z，也即产品1为c9，t11-CLA，产品2为t10，c12-CLA。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）将共轭亚油酸和无水乙醇混合，滴加氯化亚砜，搅拌得到混合液；将混合液旋蒸，加入正己烷、食盐水，分液取有机相，洗涤、干燥、过滤，旋蒸得共轭亚油酸乙酯；
（2）将共轭亚油酸乙酯溶于无水乙醇，得到进样液1，将所述进样液1利用四区模拟移动床系统去后杂，以乙醇和水为洗脱液，收集萃余口流出液，得中间体1；所述乙醇和水的体积比75︰25~60︰40；
（3）将中间体1溶于无水乙醇，得到进样液2，将所述进样液2利用四区模拟移动床系统去前杂，以乙醇和水为洗脱液，收集萃取口流出液，得到中间体2；所述乙醇和水的体积比为40︰60~50︰50；
（4）将中间体2溶于甲醇，得到进样液3，将所述进样液3通入四区模拟移动床系统中，以甲醇、乙腈和水为洗脱液，收集萃取口流出液得c9,t11-CLA，收集萃余口流出液得t10,c12-CLA；所述甲醇︰乙腈︰水体积比为45︰25︰30~40︰30︰30；
所述步骤（2）和（3）中四区模拟移动床系统中使用的色谱柱为C18硅胶柱；所述步骤（4）中所述四区模拟移动床系统中使用的色谱柱为氰基色谱柱。
2.根据权利要求1所述的利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中进样液1的浓度为20~25mg/mL。
3.根据权利要求1所述的利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，其特征在于：所述步骤（3）中进样液2的浓度为20~25mg/mL。
4.根据权利要求1所述的利用四区模拟移动床系统制备共轭亚油酸异构体单体的方法，其特征在于：所述步骤（4）中进样液3浓度为20~30mg/mL。
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