CN111228301A - 一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂及其制备方法和应用，属于医药技术领域。所述的复方制剂由分别载三氧化二砷以及骨化三醇的脂质微球ATO‑LMs和VD‑LMs组成。与现有技术相比，本发明的一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂同时包裹三氧化二砷及骨化三醇，既使三氧化二砷及骨化三醇可以充分混合，不需要考虑二者的溶解度，又增加了药物的靶向性以及生物利用度。而骨化三醇与三氧化二砷联用可发挥协同促进作用，进而达到减低三氧化二砷用量以及毒性的目的。本发明的三氧化二砷及骨化三醇脂质微球载体复方制剂可通过抑制VEGF表达进而抑制血管增殖，达到治疗血管增殖性疾病的目的。

Description

一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂及其制备方法和应用。属于医药技术领域。
背景技术
血管在人体内形成广泛的网络，为身体的每一个部位提供氧气和营养，异常的血管生长和功能是炎症性疾病以及癌症的标志，并且在诸多疾病的进展中发挥重要作用。首先，血管生成介导的关节疾病如类风湿关节炎(RA)中，血管翳为其基本病理改变，而血管增殖是RA早期组织病理学改变之一，也是血管翳生成的必要条件，可以确保持续供给病变细胞及炎性细胞氧气和营养，同时共同构成血管翳不断侵蚀破坏关节，最终导致病患残疾。血管新生是该类疾病的重要发病环节，抑制新生血管形成可能成为RA等血管增殖相关关节疾病的一种全新的治疗方法。此外，肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，其中尤其恶性肿瘤可直接影响患者生命。肿瘤在表现其生长、转移等生物学行为时与其中的微血管增生有密切关系。无论是原发性或是转移性肿瘤，其持续生长都必须依赖于新生血管的形成。缺少血供的肿瘤直径只能维持在1-2mm以内。新生血管为恶性肿瘤细胞提供其无限迅速生长所需的氧气及营养，肿瘤中VEGF等表达异常，新生的血管表现为血管结构紊乱、过度迂曲、脆性增加、通透性增高、导致抗肿瘤药物难以很好地作用于靶细胞。拮抗血管新生药物地应用可以暂时性促进肿瘤血管结构正常化，从而增加局部药物浓度。再者，眼内血管新生紊乱是血管新生性眼病的显著特征，它可以导致多种眼科疾病的恶化。在糖尿病视网膜病变和老年黄斑变性等眼科疾病中均出现VEGF等血管增殖因子过量表达导致血管新生，视网膜下新生血管穿越Bruch膜并在视网膜色素上皮下和(或)上增殖形成的纤维血管组织，常伴有视网膜下的浆液性渗出和(或)出血，造成多种眼底疾病导致视力丧失，严重影响人们生活质量。
三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO，As2O3)已被用来治疗白血病以及肿瘤等血管增殖性疾病，引起了全世界的广泛关注。此外，ATO还可以：
诱导致病细胞凋亡：①激活有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路；②抑制端粒酶活性及端粒酶逆转录酶基因的表达；③降低线粒体跨膜电位；④下调原癌基因的表达：下调致癌基因表达如Bcl-2、Bcl-XL等，或上调抑癌基因表达如Bax，P53、Bcl-xs等，也可调节细胞周期依赖基因的表达，引起细胞代谢异常，使细胞增殖能力减弱而凋亡或分化。
诱导肿瘤细胞分化：主要通过降低原癌基因c-myc等表达，以及上调细胞分化抗原CD11b表达，从而促进白血病细胞成熟、分化。
抑制肿瘤细胞增殖：以剂量依赖方式使细胞周期阻滞。细胞周期存在G1/S期和G2/M期转移2个限制点，处于G2/M期的细胞易于凋亡。As2O3通过抑制细胞周期相关蛋白，如上调CDK6等，下调CDK1和cdc-2的表达，并显著增加P21与cdc-2、CDK4等的结合，导致细胞周期阻滞在G1及G2/M期，最终使细胞不能进入有丝分裂末期而凋亡。
抑制肿瘤细胞转移：CD44基因编码产物是一种跨膜糖蛋白，是细胞黏附分子之一，常出现在已发生转移的肿瘤中，认为它是一种肿瘤扩散转移的标志物。研究显示ATO可显著降低胃癌细胞黏附分子CD44基因编码蛋白的表达。
ATO对荷瘤机体免疫功能的影响：免疫功能的降低是导致肿瘤生长、发展的原因之一。机体内具有抗肿瘤、抗病毒、发挥免疫监督功能的免疫细胞。研究表明ATO能提高肝癌小鼠机体免疫功能，抑制肿瘤的生长。ATO这种作用可能与其使免疫细胞的杀伤力显著增强有关。总之，尽管大量实验证明ATO抗血液病及实体肿瘤的机理是多途径、多靶点的。
目前国内批准的有同类产品有注射用三氧化二砷(北京双鹭药业)，其构成是三氧化二砷、甘露醇、甘油、碳酸氢钠，另外还有亚砷酸氯化钠注射液(黑龙江哈尔滨医大药业有限公司)，其构成是三氧化二砷10mg与氯化钠90mg的混合水溶液。上述两种产品均为三氧化二砷的亚砷酸盐溶液状态，采取体内输入给药方式，用于治疗急性早幼粒细胞白血病，慢粒及慢粒加速期，多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤，肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌等实体肿瘤；放疗时应用有增加放疗敏感性、提高放疗疗效的作用；可用于介入治疗及术中动脉灌注；预防肿瘤术后转移。
然而现有三氧化二砷药物注射液形式输入患者体内并无靶向性，其原因在于人体生物机制复杂，三氧化二砷作为由砷剂金属元素构成的简单分子化学药物难以实现化学修饰来实现生物靶标定向定位，因此三氧化二砷治疗时需要较大剂量来维持稳定的血液浓度，对正常组织细胞会产生较大毒性，有肝脏和肾脏的损伤，也正是由于药物的毒性，使上述三氧化二砷药物仅能局限应用于肿瘤疾病的治疗，且由于其低靶向性，药物对实体瘤疗效欠佳。此外，现有三氧化二砷药物白色粉末或结晶，微溶于水生成亚砷酸，单斜晶体和立方晶体溶于乙醇、酸类和碱类，无定形体溶于酸类和碱类，但不溶于乙醇。由于其特殊理化性质，缺乏良好的配伍药品，目前尚未能够与其有正向协同作用的药物进行良好联合，从而达到降低三氧化二砷给药剂量，进而减毒的作用。
维生素D属于脂溶性的类固醇衍生物，以往都是作为人体必需的营养物质之一。维生素D经血液循环进入肝脏，在25-羟化酶作用下转化为25-羟基维生素D[25(OH)D]，在肾脏经1α-羟化酶作用下转化为有生理活性的1，25-二羟基维生素D[1，25(OH)2D]。其中，以1，25(OH)2D3活性最高，是维生素D主要的活性形式，在体内能直接发挥作用，又名骨化三醇。骨化三醇(Calcitriol)为白色结晶粉末，对光和空气敏感。微溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯。骨化三醇(活性维生素D)主要通过与其受体(VDR)结合而发挥生物学功能，除调节体内钙磷代谢和维持血钙外，最新研究发现1，25(OH)2D3可通过白血病、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌等的抗肿瘤作用抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化、促进细胞凋亡等方式来发挥抗肿瘤作用。维生素D对VEGF生长因子诱导的内皮细胞的增殖、迁移和微血管形成具有抑制作用。Mantell等研究发现,维生素D可通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2，并上调p53基因的表达,诱导内皮细胞的凋亡。肿瘤及类风湿关节炎患者多见于老年患者，多伴有骨质疏松，此外疾病本身以及治疗过程中均会出现骨质疏松并发症，应给予活性维生素D治疗。
但现有骨化三醇的主要制剂形式是软胶囊剂和胶丸；剂型比较单调，并且骨化三醇对光和空气敏感，对于普通有机溶剂溶解度较低，软胶囊剂和胶丸的稳定性不好，有效成分含量极低，生物利用度低。此外，现有骨化三醇药物在患者体内亦无靶向性，其原因在于骨化三醇作为化学药物难以进行有效化学修饰来实现生物靶标定向定位。现有骨化三醇药物虽然被发现对炎症、血管增殖均有良好的治疗作用，但关注点仍仅仅存留于骨化三醇抗骨质疏松的治疗作用，且未将其与化疗药物等治疗联合配伍来达到更加的疗效及减毒效应。
本发明前期研究基础发现ATO可通过靶向作用于维生素D受体发挥作用，正是由于ATO与活性维生素D通过部分重叠的作用靶点来发挥抑制血管生成的作用，二者可协同发挥药效，活性维生素D可协助ATO对RA等血管生成疾病的治疗，同时可减少ATO剂量从而达到ATO减毒作用，ATO联合施用维生素D的活性产物制成复合制剂则可开发出一种多向、高效、减毒、经济的血管生成介导性疾病的治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有药物制剂的高毒性，提供了一种三氧化二砷(ATO)与骨化三醇的复方制剂及其制备方法，三氧化二砷与骨化三醇协同增效，在增强三氧化二砷抗血管增殖治疗疾病的效果的同时，减少三氧化二砷给药剂量以降低三氧化二砷毒性；本发明以脂质微球为药物载体，使药物具有靶向性，使药物聚集于肿瘤及炎症部位发挥药效，从而减少ATO剂量，达到减毒目的；此外，肿瘤、风湿病等血管增殖性疾病多见于老年人，且疾病自身多可导致骨质疏松，骨化三醇则可发挥抗骨质疏松作用，对疾病综合治疗更有益处。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂，其特征在于，所述的复方制剂通过以下方法制备得到：
(1)三氧化二砷溶液的制备：
将纯As2O3粉末与氯化钠按照As2O3粉末与氯化钠质量比为1：8～1：12的比例混合，加入去离子水，得到浓度为1mg/ml的三氧化二砷溶液；
(2)骨化三醇溶液的制备：
将纯化后的骨化三醇溶于乙醇溶液，按照ml：g计，乙醇溶液体积：骨化三醇精品的质量＝0.3:1～0.9:1；
(3)脂质微球复方制剂的制备：
1)三氧化二砷-脂质微球(ATO-LMs)的制备：
将三氧化二砷溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，磁力搅拌加热回流反应，挥尽乙醇，加入中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，置磁力搅拌器中加热搅拌作为有机相，取去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，均质后得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载ATO脂质微球(ATO-LMs)；
2)骨化三醇-脂质微球(VD-LMs)的制备：
将骨化三醇溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，磁力搅拌加热回流反应，挥尽乙醇，加入中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，置磁力搅拌器中加热搅拌作为有机相，取去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，均质后得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载骨化三醇脂质微球(VD-LMs)；
3)将所得的ATO-LMs与VD-LMs按照质量比为800:1～2000:1混合，优选为1000:1～2000:1，即获得所述的复方制剂。
其中，优选的，步骤(1)中As2O3粉末与氯化钠质量比为1：10；步骤(2)中，按照ml：g计，乙醇溶液体积：骨化三醇精品的质量＝0.4:1～0.6:1，优选为0.5:1；步骤(3)中，所述的低温高速离心是指在4℃下，以25,000rpm进行离心。
其中，优选的，步骤(3)-1)中，将三氧化二砷溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，氧化二砷溶液或卵磷脂与无水乙醇的体积比为1:1～1:2，75℃磁力搅拌加热回流反应1h，挥尽乙醇，加入等体积的中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，中链甘油三酯和大豆油体积比为1:1，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌30min作为有机相，取9倍有机相体积的去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌5min，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，以80 000kPa压力均质8次得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，121℃高压蒸汽灭菌8min，以冰水浴迅速降温即得载ATO脂质微球(ATO-LMs)；
步骤(3)-2)中，将骨化三醇溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，骨化三醇溶液或卵磷脂与无水乙醇的体积比为1:2～1:3，75℃磁力搅拌加热回流反应2h，挥尽乙醇，加入等体积的中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，中链甘油三酯和大豆油体积比为1:1，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌1h作为有机相，取9倍有机相体积的去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌5min，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，以80000kPa压力均质8次得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载骨化三醇脂质微球(VD-LMs)。
其中，优选的，步骤(1)中所述的纯As2O3粉末通过以下方法制备得到：
采用As(OR)3水解制纯As2O3：AsCl3与醇反应生成As(OR)3，经过滤、精馏、As(OR)3水解、过滤、干燥得到纯As2O3，其中R为CH3或C2H5。
其中，优选的，步骤(1)中所述的纯As2O3粉末通过以下方法制备得到：
AsCl3与甲醇或乙醇反应生成As(OCH3)3或As(OC2H5)3，过滤后，得到的As(OCH3)3或As(OC2H5)3沉淀在343K、363K、373K、413K温度条件下进行精馏，精馏时间分别为43min、19min、14min、3min和116min、55min、17min、4min；按质量比As(OR)3:H2O＝1:1.6-3进行水解，水解的温度为293±5K；过滤后，取沉淀在真空干燥箱中，对As2O3进干燥处理，加热速度为1.5℃/min；在359K温度条件下加热至恒重，制得纯As2O3粉末，为立方晶体。
其中，优选的，步骤(2)中骨化三醇的纯化包括以下步骤：
将骨化三醇粗品在30-50℃温度下溶解于醇类溶剂中，所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇，优选为乙醇，搅拌均匀，其中醇类溶剂体积：骨化三醇粗品的质量＝0.3ml:1g～2ml:1g，优选的，醇类溶剂体积：骨化三醇粗品的质量＝0.5ml:1g；再加入甲酸甲酯，析晶，过滤晶体，干燥，其中甲酸甲酯与醇类溶剂的体积比为4:1～40:1，优选为10:1～30:1，更优选为20:1。
进一步的，本发明还提出了所述的复方制剂在制备抑制血管生成的药物中的用途。以及
所述的复方制剂在制备治疗血管生成介导的疾病的药物中的用途。
其中，优选的，所述的血管生成介导的疾病包括类风湿关节炎(RA)、肿瘤以及血管新生性眼病。
其中，优选的，所述的血管新生性眼病包括新生血管性青光眼、新生血管相关视网膜疾病、新生血管相关脉络膜疾病。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明的一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂同时包裹三氧化二砷及骨化三醇，既使三氧化二砷及骨化三醇可以充分混合，不需要考虑二者的溶解度，又增加了药物的靶向性以及生物利用度。而骨化三醇与三氧化二砷联用可发挥协同促进作用，进而达到减低三氧化二砷用量以及毒性的目的。具体的，本发明的有益效果体现在以下几个方面：
1.由于复方制剂中骨化三醇的填加，与同等剂量单药三氧化二砷相比，复方制剂血管生成抑制率提升20％；
2.由于复方制剂中骨化三醇的填加，与发挥同等效力血管生成抑制率的单药三氧化二砷相比，复方制剂三氧化二砷给药剂量降低了20％以上；
3.由于复方制剂中骨化三醇的填加，与发挥同等效力血管生成抑制率的单药三氧化二砷相比，复方制剂三氧化二砷给药毒性(细胞死亡率)降低了10％；
4.本发明提供了用于治疗血管增殖介导的关节疾病的方法，其包括向哺乳动物施用在治疗上足够量的三氧化二砷(As2O3)及骨化三醇，施用此复方制剂可使哺乳动物的关节疾病的病变在临床上有显著改善。在本发明中，疾病症状临床上有显著改善包括以下的一项或多项改善：a)减轻或抑制疼痛；b)减轻或抑制肿胀；c)减轻或抑制发红；d)降低或抑制受影响组织的温度；以及e)减少或抑制畸形及功能性丧失；
5.本发明采用脂质球微粒包裹药物，使药物集聚于病变组织血管富集炎症病变，大大增强药物靶向性治疗效果。
总之，本三氧化二砷与骨化三醇脂微球复方制剂的给药，可以实现三氧化二砷减量减毒等效的治病目的。
附图说明
图1是本发明实施例提供的本发明三氧化二砷与骨化三醇联用显著提升二者分别用药血管生成抑制率效果图；
其中：A：为不同给药组的VEGF的浓度检测结果；B为不同给药组的血管生成量；C为采用相差显微镜对不同给药组的内皮细胞成管观察结果；
图2是本发明实施例提供的载三氧化二砷与骨化三醇脂质微球ATO-LMs(A)和VD-LMs(B)的体外释药曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂的制备
(1)纯As2O3粉末的制备
AsCl3与乙醇反应生成As(OCH3)3或As(OC2H5)3，过滤后，得到的As(OC2H5)3沉淀在343K、363K、373K、413K温度条件下进行精馏，精馏时间分别为43min、19min、14min、3min和116min、55min、17min、4min；按质量比As(OC2H5)3:H2O＝1:2进行水解，水解的温度为293K；过滤后，取沉淀在真空干燥箱中，对As2O3进干燥处理，加热速度为1.5℃/min；在359K温度条件下加热至恒重，制得纯As2O3粉末，为立方晶体；
(2)骨化三醇的纯化
将骨化三醇粗品在40℃温度下溶解于乙醇溶液中，搅拌均匀，其中乙醇溶液体积：骨化三醇粗品的质量＝0.5ml:1g；再加入甲酸甲酯，析晶，过滤晶体，干燥，得到纯化后的骨化三醇，其中甲酸甲酯与醇类溶剂的体积比为20:1；
(3)三氧化二砷溶液的制备：
将步骤(1)得到的纯As2O3粉末与氯化钠按照As2O3粉末与氯化钠质量比为1：10的比例混合，加入去离子水，得到浓度为1mg/ml的三氧化二砷溶液；
(4)骨化三醇溶液的制备：
将纯化后的骨化三醇溶于乙醇溶液，按照ml：g计，乙醇溶液体积：骨化三醇精品的质量＝0.5:1；
(5)脂质微球复方制剂的制备：
1)三氧化二砷-脂质微球(ATO-LMs)的制备：
将三氧化二砷溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，氧化二砷溶液与无水乙醇的体积比为1:1，卵磷脂与无水乙醇的体积比为1:2，75℃磁力搅拌加热回流反应1h，挥尽乙醇，加入等体积的中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，中链甘油三酯和大豆油体积比为1:1，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌30min作为有机相，取9倍有机相体积的去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌5min，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，以80000kPa压力均质8次得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，121℃高压蒸汽灭菌8min，以冰水浴迅速降温即得载ATO脂质微球(ATO-LMs)；
2)骨化三醇-脂质微球(VD-LMs)的制备：
将骨化三醇溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，骨化三醇溶液与无水乙醇的体积比为1:3，卵磷脂与无水乙醇的体积比为1:2，75℃磁力搅拌加热回流反应2h，挥尽乙醇，加入等体积的中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，中链甘油三酯和大豆油体积比为1:1，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌1h作为有机相，取9倍有机相体积的去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌5min，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，以80000kPa压力均质8次得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载骨化三醇脂质微球(VD-LMs)。
3)将所得的ATO-LMs与VD-LMs按照质量比为1500:1混合，即获得所述的复方制剂。
实施例2As2O3联合骨化三醇对RA患者滑膜血管新生的作用
本发明通过Matrigel成管实验进一步验证As2O3联合骨化三醇对RA患者滑膜血管新生的作用。
Matrigel成管实验中，预先冷却加样枪头和96孔培养板，Matrigel胶冰上溶化后，在96孔培养板上每孔加入50μL，5％CO2、37℃湿润环境中放置30min使其凝固。取出96孔培养板，分别加入浓度为20μM、50μM的ATO，5nM的骨化三醇以及骨化三醇5nM联合ATO 20μM。然后，96孔培养板上每孔加100μL无血清DMEM培养的HDMECs细胞悬液。孵育6h后，对RA成纤维样滑膜细胞上清液中VEGF表达情况进行检测，并应用相差显微镜对内皮细胞成管观察。
结果如图1所示，从图1结果可以看出，结果展示为ATO 20μM和50μM均可显著抑制RA成纤维样滑膜细胞上清液中VEGF表达，抑制内皮细胞成管，骨化三醇5nM有轻度抑制作用，其中ATO 50μM比ATO 20μM抑制率高20％，骨化三醇5nM联合ATO 20μM则可与ATO 50μM达到等效抑制效果。
实施例2载三氧化二砷与骨化三醇的脂质微球ATO-LMs和VD-LMs的体外释药情况
取实施例1制备得到的脂质微球ATO-LMs以及VD-LMs分别装于透析袋中，加入5ml纯化水后将透析袋两端扎紧，透析袋置于10ml释放介质中(前2h为0.1mol*L-1盐酸，2h后改成pH为6.8的PBS)，37.0℃，100rpm恒温震荡，于1、2、4、6、8、10、12h更换透析袋外的全部释放介质，测定介质中药物含量，计算各时刻的累计释放率(Q)。
图2是本发明实施例提供的载三氧化二砷与骨化三醇脂质微球ATO-LMs和VD-LMs的体外释药情况。
结果显示ATO-LMs以及VD-LMs均平稳释药，载药微球释药性能佳，较单纯无载体给药能够更好地维持药物浓度稳定。

Claims (10)

1.一种用于治疗血管生成介导疾病的复方制剂，其特征在于，所述的复方制剂通过以下方法制备得到：
(1)三氧化二砷溶液的制备：
将纯As2O3粉末与氯化钠按照As2O3粉末与氯化钠质量比为1：8～1：12的比例混合，加入去离子水，得到浓度为1mg/ml的三氧化二砷溶液；
(2)骨化三醇溶液的制备：
将纯化后的骨化三醇溶于乙醇溶液，按照ml：g计，乙醇溶液体积：骨化三醇精品的质量＝0.3:1～0.9:1；
(3)脂质微球复方制剂的制备：
1)三氧化二砷-脂质微球(ATO-LMs)的制备：
将三氧化二砷溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，磁力搅拌加热回流反应，挥尽乙醇，加入中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，置磁力搅拌器中加热搅拌作为有机相，取去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，均质后得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载ATO脂质微球(ATO-LMs)；
2)骨化三醇-脂质微球(VD-LMs)的制备：
将骨化三醇溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，磁力搅拌加热回流反应，挥尽乙醇，加入中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，置磁力搅拌器中加热搅拌作为有机相，取去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，均质后得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载骨化三醇脂质微球(VD-LMs)；
(4)将所得的ATO-LMs与VD-LMs按照质量比为800:1～2000:1混合，优选为1000:1～2000:1，即获得所述的复方制剂。
2.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，步骤(1)中As2O3粉末与氯化钠质量比为1：10；步骤(2)中，按照ml：g计，乙醇溶液体积：骨化三醇精品的质量＝0.4:1～0.6:1，优选为0.5:1；步骤(3)中，所述的低温高速离心是指在4℃下，以25,000rpm进行离心。
3.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，步骤(3)-1)中，将三氧化二砷溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，氧化二砷溶液或卵磷脂与无水乙醇的体积比为1:1～1:2，75℃磁力搅拌加热回流反应1h，挥尽乙醇，加入等体积的中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，中链甘油三酯和大豆油体积比为1:1，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌30min作为有机相，取9倍有机相体积的去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌5min，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，以80 000kPa压力均质8次得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，121℃高压蒸汽灭菌8min，以冰水浴迅速降温即得载ATO脂质微球(ATO-LMs)；
步骤(3)-2)中，将骨化三醇溶液、卵磷脂分别加入无水乙醇中，骨化三醇溶液或卵磷脂与无水乙醇的体积比为1:2～1:3，75℃磁力搅拌加热回流反应2h，挥尽乙醇，加入等体积的中链甘油三酯(MCT)和注射用大豆油组成的混合油相，中链甘油三酯和大豆油体积比为1:1，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌1h作为有机相，取9倍有机相体积的去离子水作为水相，将水相缓慢加入至有机相中，待完全加入后，继续加热搅拌5min，得初乳；将初乳冷却至室温，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，低温高速离心，以80 000kPa压力均质8次得终乳；终乳复溶于去离子水定容至全量，封罐氮气，高压蒸汽灭菌，以冰水浴迅速降温即得载骨化三醇脂质微球(VD-LMs)。
4.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，步骤(1)中所述的纯As2O3粉末通过以下方法制备得到：
采用As(OR)3水解制纯As2O3：AsCl3与醇反应生成As(OR)3，经过滤、精馏、As(OR)3水解、过滤、干燥得到纯As2O3，其中R为CH3或C2H5。
5.如权利要求4所述的复方制剂，其特征在于，步骤(1)中所述的纯As2O3粉末通过以下方法制备得到：
AsCl3与甲醇或乙醇反应生成As(OCH3)3或As(OC2H5)3，过滤后，得到的As(OCH3)3或As(OC2H5)3沉淀在343K、363K、373K、413K温度条件下进行精馏，精馏时间分别为43min、19min、14min、3min和116min、55min、17min、4min；按质量比As(OR)3:H2O＝1:1.6-3进行水解，水解的温度为293±5K；过滤后，取沉淀在真空干燥箱中，对As2O3进干燥处理，加热速度为1.5℃/min；在359K温度条件下加热至恒重，制得纯As2O3粉末，为立方晶体。
6.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，步骤(2)中骨化三醇的纯化包括以下步骤：
将骨化三醇粗品在30-50℃温度下溶解于醇类溶剂中，所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇，优选为乙醇，搅拌均匀，其中醇类溶剂体积：骨化三醇粗品的质量＝0.3ml:1g～2ml:1g，优选的，醇类溶剂体积：骨化三醇粗品的质量＝0.5ml:1g；再加入甲酸甲酯，析晶，过滤晶体，干燥，其中甲酸甲酯与醇类溶剂的体积比为4:1～40:1，优选为10:1～30:1，更优选为20:1。
7.权利要求1-6任一项所述的复方制剂在制备抑制血管生成的药物中的用途。
8.权利要求1-6任一项所述的复方制剂在制备治疗血管生成介导的疾病的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的血管生成介导的疾病包括类风湿关节炎(RA)、肿瘤以及血管新生性眼病。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的血管新生性眼病包括新生血管性青光眼、新生血管相关视网膜疾病、新生血管相关脉络膜疾病。
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