CN111208099B - 一种银纳米簇荧光探针及其制备方法和其在检测活性氧种类中的应用 - Google Patents

一种银纳米簇荧光探针及其制备方法和其在检测活性氧种类中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种银纳米簇荧光探针及其制备方法和其在检测活性氧种类中的应用，其中，所述银纳米簇荧光探针包括：蛋白和银纳米团簇。本发明利用该探针能灵敏有效地检测组织或细胞中不同种类的活性氧。

Description

一种银纳米簇荧光探针及其制备方法和其在检测活性氧种类 中的应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种银纳米簇荧光探针及其制备方法和其在检测活性氧种类中的应用。
背景技术
活性氧包括过氧化氢、超氧自由基、羟基等，活性氧含量的增加，会导致严重的氧化应激反应，最终造成DNA、蛋白质及脂质的分子损伤。然而目前，人们对于不同种类活性氧对细胞的具体的作用和影响程度，尚未研究透彻。因此，设计一种可有效检测特定类型活性氧的工具有着重要的意义，为探讨肿瘤发生发展的机制提供参考依据。目前，利用荧光素检测活性氧的方法大多基于氧化还原反应，其可对活性氧进行有效检测，然而，该方法却无法对不同种类的活性氧加以区分。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种银纳米簇荧光探针及其制备方法和其在检测活性氧种类中的应用，本发明利用该探针能灵敏有效地检测组织或细胞中的不同种类的活性氧。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种银纳米簇荧光探针在检测活性氧种类中的用途，所述银纳米簇荧光探针用于识别所述活性氧的种类，其中，所述银纳米簇荧光探针包括蛋白和位于所述蛋白内的银纳米团簇。
在一实施例中，所述银纳米团簇位于所述蛋白的分子链上以及所述蛋白内的间隙中。
在一实施例中，所述银纳米簇荧光探针通过调控所述银纳米簇荧光探针的尺寸和/或价态，区分所述活性氧的种类。
在一实施例中，在特定激发波长下，所述银纳米簇荧光探针识别所述活性氧的种类。
在一实施例中，所述特定激发波长包括350-550nm。
本发明的目的还在于提供一种银纳米簇荧光探针，包括：
蛋白；
银纳米团簇，位于所述蛋白内。
在一实施例中，所述银纳米团簇位于所述的蛋白的分子链上以及所述蛋白内的间隙中。
在一实施例中，所述蛋白为牛血清白蛋白。
本发明的目的还在于提供一种银纳米簇荧光探针的制备方法，至少包括以下步骤：
将银盐溶液与蛋白溶液进行混合，获得第一混合溶液；
向所述第一混合溶液中滴加还原剂，使银离子还原成银纳米团簇位于蛋白内，获得第二混合溶液；
对所述第二混合溶液进行过滤处理，获得所述银纳米簇荧光探针。
在一实施例中，所述还原剂为硼氢化钠溶液，所述硼氢化钠在碱性条件下滴加到所述第一混合溶液中。
在一实施例中，所述过滤处理包括超滤管超滤和滤网过滤。
在本发明中，所述银纳米簇荧光探针是通过在与不同种类的活性氧作用时自身尺寸的变化以及所述银纳米颗粒中银的价态变化的共同作用使自身发射出不同颜色的荧光来检测所述活性氧的种类，可灵敏有效地区分组织或细胞中的不同种类的活性氧。本发明填补了技术领域的空白，首次通过银纳米簇荧光探针将不同种类的活性氧加以区分，为不同种类活性氧对细胞的具体的作用和影响程度提供依据。
附图说明
图1为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针的制备方法流程示意图；
图2为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针检测活性氧的种类的方法流程示意图；
图3为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针的透射电子显微镜图；
图4为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针的水合粒径图；
图5为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针的荧光发射光谱图；
图6为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针的X射线光电子能谱图；
图7为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪分析结果；
图8为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与中活性氧作用后的透射电子显微镜图；
图9为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与中活性氧作用后的水合粒径图；
图10为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与中活性氧作用后的荧光发射光谱图；
图11为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与中活性氧作用后的X射线光电子能谱图；
图12为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与高活性氧作用后的透射电子显微镜图；
图13为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与高活性氧作用后的水合粒径图；
图14为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与高活性氧作用后的荧光发射光谱图；
图15为本发明一实施例中银纳米簇荧光探针与高活性氧作用后的X射线光电子能谱图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。在本发明中如出现术语“第一”、“第二”、仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
本发明通过在与不同种类的活性氧作用时银纳米簇荧光探针自身尺寸的变化以及所述银纳米颗粒中银的价态变化的共同作用使自身发射出不同颜色的荧光来检测所述活性氧的种类，可灵敏有效地检测组织或细胞中的不同种类的活性氧。
请参阅图1，本发明一实施例中提供一种银纳米簇荧光探针的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将银盐溶液与蛋白溶液进行混合，获得第一混合溶液；
S2、向所述第一混合溶液中滴加还原剂，使银离子还原成银纳米团簇位于蛋白内，获得第二混合溶液；
S3、对所述第二混合溶液进行过滤处理，获得所述银纳米簇荧光探针。
具体的，在S1步骤中，所述银盐溶液例如为硝酸银溶液。所述蛋白为牛血清白蛋白。例如将AgNO3溶液(1-20mmol，1-10mL)加入牛血清白蛋白BSA溶液(0.01-0.1g/mL，1-10mL)中，搅拌混匀1-10分钟。
具体的，在S2步骤中，所述还原剂例如为硼氢化钠。例如将氢氧化钠NaOH溶液(0.1-10M，0.1-1mL)逐滴加入第一混合溶液中，搅拌混匀1-10分钟，然后将硼氢化钠NaBH4溶液(1-50mmol，50-500μL)逐滴加入上述溶液中，搅拌混匀1-10分钟。所述蛋白为团簇状。所述银纳米团簇位于所述蛋白的分子链上以及所述蛋白内的间隙中。
具体的，在S3步骤中，将第二混合溶液用例如3kDa超滤管超滤，再将上述溶液用例如0.08-0.1μm滤网过滤，在温度为-20℃至-40℃保存，获得所述银纳米簇荧光探针，所述银纳米簇荧光探针，包括：蛋白和银纳米团簇，所述银纳米团簇附着在所述蛋白的分子链上以及所述蛋白的空隙内。
本发明的目的还在于提供一种银纳米簇荧光探针的用途，所述银纳米簇荧光探针在检测不同种类的活性氧中的应用。所述银纳米簇荧光探针用于识别所述活性氧的种类。所述银纳米簇荧光探针通过调控所述银纳米簇荧光探针的尺寸和/或价态，区分所述活性氧的种类。
请参阅图2，一实施例提供一种银纳米簇荧光探针检测活性氧的种类的方法，至少包括以下步骤：
S101、提供一待测物；
S102、将所述待测物与所述银纳米簇荧光探针混合，获得混合体系；
S103、通过观察所述混合体系在特定激发波长下的荧光颜色来检测所述活性氧的种类。
具体的，在S101步骤中，所述待测物例如为待测组织或者待测细胞，组织或细胞包括所有种类的癌组织或细胞，例如，膀胱癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、胰腺癌细胞、骨癌细胞、黑色素瘤细胞、白血病细胞等。
具体的，在S102步骤中，例如将待测组织或细胞制作冰冻切片，然后取0.1-1mL的1-50mg/mL的银纳米簇荧光探针与上述冰冻切片共孵育20-240分钟，获得混合体系。
具体的，在S103步骤中，例如，利用激光共聚焦显微镜，在特定激发波长下收集特定范围内的发射光并拍照，具体过程如下：用磷酸盐缓冲溶液PBS洗步骤S102中所得冰冻切片3-5次，用激光共聚焦显微镜观察，例如在350-550nm范围内收集发射光并拍照。
在一实施例中，将AgNO3溶液(1-20mmol，1-10mL)加入牛血清白蛋白BSA溶液(0.01-0.1g/mL，1-10mL)中，搅拌混匀1-10分钟。将氢氧化钠NaOH溶液(0.1-10M，0.1-1mL)逐滴加入第一混合溶液中，搅拌混匀1-10分钟，然后将硼氢化钠NaBH4溶液(1-50mmol，50-500μL)逐滴加入上述溶液中，搅拌混匀1-10分钟。将加入硼氢化钠后的溶液用例如3kDa超滤管超滤，再将上述溶液用例如0.08-0.1μm滤网过滤，在温度为-20℃至-25℃保存，获得所述银纳米簇荧光探针。将待测组织例如肝脏组织、甲状腺组织或者甲状腺癌组织制作冰冻切片，然后取0.1-1mL的1-50mg/mL的银纳米簇荧光探针与上述冰冻切片共孵育20-240分钟，获得混合体系。用磷酸盐缓冲溶液PBS清洗所得冰冻切片3-5次，利用激光共聚焦显微镜，例如在350-550nm范围内收集发射光并拍照。激光共聚焦显微镜结果显示，肝脏组织切片可发出弱绿色及亮红色荧光，表明肝脏组织中存在一定量的过氧化氢。甲状腺组织均显示弱红色荧光，这是由于甲状腺本身要激活一定量的活性氧，以便产生甲状腺素导致的。值得注意的是，对于甲状腺癌组织切片，无绿色或红色荧光信号出现，这表明其中分布着大量的高活性氧，也证明了高活性氧对甲状腺癌组织的影响程度较高。
请参阅图3，透射电子显微镜结果显示，银纳米簇荧光探针为大小均一、单分散的球形颗粒，其平均粒径约为4nm左右，可见明显晶格条纹，说明本发明的银纳米簇荧光探针为晶型良好的晶体。
请参阅图4，水合粒径测量结果显示，银纳米簇荧光探针的水合粒径范围为2-5nm左右，平均水合粒径约为3.615nm左右。
请参阅图5，荧光发射光谱显示，在350-550nm范围内的激发波长激发下，银纳米簇可发射强烈红色荧光。
请参阅图6，X射线光电子能谱图显示，银纳米簇中的银离子存在两种价态，分别为Ag(0)和Ag(1)。
请参阅图7，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪分析结果显示，牛血清白蛋白的质量峰为66.29kDa，荧光银纳米簇的质量峰为67.52kDa，这种差异是由于荧光银纳米簇探针核心中插入的11个银原子导致的。
在本发明中，银纳米簇荧光探针可发射强烈的红光，加入中活性氧后，其红光减弱，可发射强绿光。当加入高活性氧后，其荧光淬灭，无任何荧光，造成这种现象的原因见下述，请参阅图8至图11，当银纳米簇荧光探针与中活性氧例如过氧化氢H2O2共孵育后，请参阅图8，透射电子显微镜图结果显示，其粒径仍较小，约为3nm左右。请参阅图9，水合粒径测量结果显示，其水合粒径范围约为2-4nm左右，平均水合粒径约为2.696nm左右。请参阅图10，荧光发射光谱结果显示，在350-550nm的激发波长激发下，该材料发射红光的能力减弱，发射绿光的能力增强。请参阅图11，X射线光电子能谱图XPS结果显示，该材料中，银的价态仅有一种，为Ag(0)，这说明银纳米簇中的Ag(1)被H2O2还原。
请参阅图12至图15，当银纳米簇荧光探针与高活性氧共孵育后，例如超氧自由基O2-或羟基自由基·OH，请参阅图12，透射电子显微镜图片结果显示，该材料发生团聚，其粒径增大至约50nm。请参阅图13，该材料的水合粒径也显著增大，其范围约为50-150nm，平均水合粒径约为91.28nm。请参阅图14，荧光发射光谱结果显示，该材料在350-550nm的激发波长激发下，无显著荧光发射，这是由于材料的团聚，导致荧光淬灭，与上述甲状腺癌组织的检测结果一致。请参阅图15，X射线光电子能谱图XPS结果显示，该材料中，银的价态仅有一种，为Ag(0)，这说明银纳米簇中的Ag(1)倍超氧自由基O2-或羟基自由基·OH还原。
在本发明中，所述银纳米簇荧光探针是通过在于不同种类的活性氧作用时自身尺寸的变化以及所述银纳米颗粒中银的价态变化的共同作用使自身发射出不同颜色的荧光来检测所述活性氧的种类，可灵敏有效地检测组织或细胞中的不同种类的活性氧。本发明填补了技术领域的空白，首次通过银纳米簇荧光探针将不同种类的活性氧加以区分，利用本发明的银纳米簇银光探针检测出组织或细胞中含有什么类型的活性氧(如：对高活性氧及中活性氧的区分)，然后对组织或者细胞加以分类即分型(如：高活性氧往往聚集于恶性肿瘤细胞中，而中活性氧往往聚集于正常细胞或良性肿瘤细胞中)，为研究不同种类活性氧对细胞的具体的作用和影响程度提供依据。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种银纳米簇荧光探针在检测活性氧种类中的用途，其特征在于，所述银纳米簇荧光探针用于识别所述活性氧的种类，其中，所述银纳米簇荧光探针包括蛋白和位于所述蛋白内的银纳米团簇；
所述银纳米簇荧光探针通过在与不同种类的活性氧作用时自身尺寸的变化以及所述银纳米团簇 中银的价态变化的共同作用使自身发射出不同颜色的荧光来检测所述活性氧的种类。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述银纳米团簇位于所述蛋白的分子链上以及所述蛋白内的间隙中。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在特定激发波长下，所述银纳米簇荧光探针识别所述活性氧的种类。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述特定激发波长包括350-550nm。
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