CN111206016A - 一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于培养基制备技术领域，公开了一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法，脂肪组织采集；ADSCs培养；制备A‑CM；制备无培养基ADSCs培养上清；制备CM‑透明质酸混合液；流式细胞术分析；利用ELISA法检测A‑CM中生物活性分子。实验表明，A‑CM和Fr‑CM涂抹均能显著抑制粉刺、丘疹、脓包、溃烂和结节，并防止皮损部位累及周围组织，其预防效应与CM浓度呈正相关，是一种预防痤疮的新方法；而生理盐水培养ADSCs获得的FrA‑CM含有多种生物活性成分，不含完全培养基中复杂的生物和化学成分，且具有与A‑CM相似的预防痤疮的潜能，是一种能完全替代A‑CM的原料。

Description

一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法
技术领域
本发明属于培养基制备技术领域，尤其涉及一种预防兔耳痤疮的ADSCs条 件培养基及制备方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：痤疮是常见的慢性炎症型皮肤疾病，多发于青 少年，临床表征为丘疹、粉刺、脓疱、囊肿以及结节，一般I度和II度痤疮可自 愈，至多局部外用维A类药物或抗生素即可，但III度及IV度痤疮经常会导致皮损， 即使及时采用外用-口服联合治疗，由于治疗周期较长，用药剂量较大，长期使 用耐药性明显，使得患者的治疗依从性较差，极容易引起色素沉着、持久性红 斑、凹陷性或肥厚性瘢痕等严重皮肤问题，严重影响患者心理健康和社交。2005 年日本长崎大学NakagawaH等报道，人间充质干细胞移植能加速创口收口和愈 合，降低疤痕纤维化程度，减小疤痕，促进角质层形成；2007年加拿大阿尔伯塔大学Wu.等发现间充质干细胞通过诱导真皮组织血管新生、重建组织结构、创 面上皮化过程，加速创口收口、缩小疤痕；2011年美国费城儿童医院的Mackenzie 等发现，在创口愈合和组织修复过程中，间质基质细胞起到了重要作用。既往 的研究表明，干细胞移植的作用方式可能并不是通过外源细胞再生修复起作用 的，而是通过干细胞分泌的生物活性物质诱导机体的固有修复能力起作用。近 期有几个研究也证明，脂肪干细胞(ADSC)条件培养基(A-CM)中含有多种 生物活性分子，具有抑制炎症、调节免疫细胞活性、促进间质细胞增殖和胶原 分泌、减少肌纤维化、促进微血管网络新生和再生、调节毛囊周期等生理活性，对于皮肤损伤、炎症、毛囊脂肪代谢失调有一定的治疗效果。另外的研究证明 间充质干细胞具有抑制痤疮丙酸杆菌的作用。但既往干细胞治疗痤疮的实验研 究集中在干细胞或其条件培养基修复痤疮所带来的组织损伤、色素沉着方面。 本发明拟以脂肪干细胞条件培养基预防痤疮的发生，为研究其中可能的机制奠 定基础。
最近的一些研究认为间充质干细胞移植治疗中观察到的治疗活性背后主要 的驱动力是这些细胞分泌的旁分泌因子。这些因子能诱导凋亡以抑制损伤组织 进一步变性。与正常的生理环境相比，在患病组织周围可检测到旁分泌梯度， 以诱导组织特异性间充质干细胞向感染或损伤部位迁移，从而促进愈合。因此， 间充质干细胞通过旁分泌作用维持以致增加损伤组织与干细胞壁龛之间的生物 活性因子梯度从而加快恢复过程。因此，移植间充质干细胞条件培养基，即间 充质干细胞体外培养过程中的培养上清，有助于损伤组织愈合和恢复为生理状 态。间充质干细胞条件培养基治疗痤疮的研究也证明了这一点。2016年，ZhouBR. 等采用脂肪来源的间充质干细胞条件培养基联合激光嫩肤治疗萎缩性痤疮疤痕，发现联合治疗显著提高受试者满意度，皮肤光滑度、弹性、水合度、经皮 水流失、黑色素指数等生物物理指标显著改善，同时增加了皮肤胶原和弹性蛋 白密度，并使其排列有序，对疤痕的治疗有明显疗效。2018年，ShanX等在使 用脂肪来源的间充质干细胞和同源的条件培养基治疗新西兰大耳兔痤疮模型的 实验中发现，间充质干细胞联合条件培养基治疗显著降低了炎症反应，对痤疮 疤痕有显著的治疗效果，而且条件培养基在其中起到至关重要的作用，具有治 疗痤疮和痤疮疤痕的前景。2019年，ParkCS等报道了采用激光嫩肤和脂肪来源 的间充质干细胞条件培养基序贯治疗萎缩性痤疮疤痕的劈脸研究结果。结果显示，治疗2个月后，疤痕量减少了23.5％(治疗组)和15.0％(对照组)，皮肤 毛孔减少了7.6％(治疗组)和15.9％(对照组)，而红斑则增加了2.8％(治疗 组)和3.1％(对照组)。综合评价，激光嫩肤联合间充质干细胞条件培养基治 疗对萎缩性痤疮瘢痕和皮肤毛孔改善了至少15.0％，因此，条件培养基能增强 激光治疗萎缩性疤的疗效。2019年，El-DomyatiM等报道了10例微针联合羊水 来源的间充质干细胞条件培养基导入治疗萎缩性痤疮疤痕的劈脸临床试验结 果，同样证明了联合治疗比单独使用微针或单独使用条件培养基的治疗方法有 更好的临床收益，并且有显著的胶原蛋白和弹性蛋白纤维改善，而且面部治疗 部位表皮有显著的厚度增加。
多个间充质干细胞条件培养基用于痤疮疤痕、改善皮肤质量的基础和临床 研究都证明了条件培养基具有降低炎症反应、诱导损伤修复的作用。既往间充 质干细胞的培养体系主要分为三类，分别是含血清的培养体系、含血清替代品 的培养体系、成分限定的无血清培养体系。培养的细胞以ISSCT在2006年公布 的间充质干细胞鉴定标准鉴定免疫表型，包括CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、 CD105，结果表明培养的细胞CD34、CD45、HLA-DR表达率低于2％，而CD73、 CD90、CD105表达率高于95％，符合间充质干细胞的鉴定标准，证明我们培养 的脂肪来源的细胞是间充质干细胞。
采用三类培养体系制备的间充质干细胞条件培养基治疗痤疮，能够避免使 用活细胞的各种限制，包括病原微生物污染、免疫排斥反应、致瘤性、异常分 化等，但是三类用于培养间充质干细胞的培养基中均含有无法确定的或者非间 充质干细胞分泌的其它极其复杂的成分，包括激素、细胞因子、基质蛋白成分， 甚至含有异种蛋白，存在不可预估的与治疗目的无关的风险，以及质量控制困 难的缺陷，因此制备比较纯粹的间充质干细胞分泌产物是条件培养基制备工艺 中的重要问题。生理盐水是人血浆的等渗液，经常用于组织细胞清洗、细胞制 剂制备液等。既往我们的研究发现，采用生理盐水作为细胞制剂的制备液时， 其中的细胞持续分泌细胞因子，且在2-8℃条件下，维持7天不会损失间充质干细 胞的生物学活性。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有干细胞治疗痤疮的实验研究集中 在干细胞或其条件培养基修复痤疮所带来的组织损伤、色素沉着方面。以脂肪 干细胞条件培养基预防痤疮的发生的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件 培养基及制备方法。
本发明是这样实现的，一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法， 包括以下步骤：
步骤一，脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹 部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、 运输。
步骤二，ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和 沉淀层。以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬 细胞。
步骤三，制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h 的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清。过滤上清液，收集滤液备 用。
步骤四，制备无培养基ADSCs培养上清(FrA-CM)：以生理盐水重悬P3代 ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中培养。
步骤五，制备CM-透明质酸(CM-HA)混合液：以终浓度0.1％的HA为增稠 剂和保湿剂，以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA。将CM、HA、生理盐水混 合均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用。
步骤六，流式细胞术分析：以单克隆抗体与细胞悬液避光孵育，离心弃上 清。以PBS重悬沉淀，上机检测。
步骤七，利用ELISA法检测A-CM中生物活性分子。
进一步，步骤二中，所述ADSCs培养具体包括：
(1)无菌条件下小心剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，剪碎呈流体状， 少见颗粒。以2倍体积的医用生理盐水(含50ug/mL硫酸庆大霉素)重悬，500g 离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，小心吸弃表面油脂，收集脂 肪层和沉淀层。
(2)以二倍体积的消化液(0.15mg/mLCollagenaseNB1(17455.03，SERVA)，50IU/mLrhDNase-I(ENZ-319，ProSpec))重悬脂肪层和沉淀层，37 度水浴，190r/min，震荡消化30分钟；吸弃上层油脂、悬浮絮状物；200目筛网 过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸 弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清。
(3)以生理盐水洗涤2次。以ADSCs完全培养基(UltraCULTURE(12-725F， LONZA)，2％UltroserGserumsubstitute(15950-017，PALL))重悬细胞，调整 细胞密度为5X105/mL，接种至175cm2组织培养瓶(EasyFlask，NUNC)中，饱 和湿度，5％CO2，37℃培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换 液，以后隔天换液，至70-80％汇合时收获。
(4)收获时吸弃培养上清，以生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋 白酶溶液(T6424-1VL，Biologicalindustries)，室温消化5分钟，加入1mL抑肽 酶溶液(A1250000，Sigma)终止消化；收集细胞悬液，400g离心，5分钟，弃 上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液； 400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs。
(5)传代时，以ADSCs完全培养基重悬P0代细胞，按10000细胞/cm2接种， 隔夜完全换液，培养至90％以上融合时收获，记为P1代ADSCs。继续传代至P2 代时收获。
进一步，步骤三中，所述离心速率设定升速9降速1，离心时间为30min。收 集上清后，以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。
进一步，步骤四中，所述制备无培养基ADSCs培养上清的方法具体包括：
以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组 织处理培养瓶中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养。收集接种后24h、48h、72h的 细胞悬液各50mL，4℃，3000Xg，设定升速9降速1，离心30min，收集上清。以 0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。
进一步，步骤五中，所述制备CM-透明质酸(CM-HA)混合液的方法具体 包括：
1)以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA(
Figure BDA0002373846910000061
HA-EP2，华熙生物)， 4℃过夜。不足25mL注射用水，于40℃恒温水浴中混合均匀，于4℃保存备用。
2)按照配比，将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃ 保存备用。
进一步，步骤2)中，所述CM、HA、生理盐水的配比包括：
①所述A-CM-HA的配比为：
组别A-CM-HA-G100：100％,v/v的A-CM。
组别A-CM-HA-G80：80％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；10mL的生理盐 水。
组别A-CM-HA-G60：60％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；30mL的生理盐 水。
组别A-CM-HA-G40：40％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；50mL的生理盐 水。
组别A-CM-HA-G20：20％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；70mL的生理盐 水。
②所述FrA-CM-HA的配比为：
组别FrA-CM-HA-G100：100％,v/v的FrA-CM。
组别FrA-CM-HA-G80：80％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；10mL的生理 盐水。
组别FrA-CM-HA-G60：60％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；30mL的生理 盐水。
组别FrA-CM-HA-G40：40％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；50mL的生理 盐水。
组别FrA-CM-HA-G20：20％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；70mL的生理 盐水。
③所述对照组的配比为：
组别HA-G0：10％,v/v的1％HA；90mL的生理盐水。
进一步，步骤六中，所述流式细胞术分析的方法为：
收获P3代ADSCs，以PBS洗涤、重悬细胞，调整细胞密度至1X106/mL，以 单克隆抗体(免疫荧光标记)与细胞悬液避光孵育15min，加入2mL溶血素I室温 避光溶血15min，离心弃上清，以PBS重悬沉淀，上机检测，检查CD34、CD45、 HLA-DR、CD73、CD90、CD105表达水平。
进一步，步骤七中，所述ELISA法检测A-CM中生物活性分子具体包括：
(Ⅰ)按照ELISA试剂盒规定上机检测1.1.3采集的A-CM、FrA-AM中hEGF、 hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、hHgf、hTGF-β浓度。即分别设空白孔、标 准孔、待测样品孔，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混 匀。
(Ⅱ)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；每孔加入酶标 试剂50μl，空白孔除外。
(Ⅲ)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(Ⅳ)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃ 避光显色15分钟；每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；终止反 应后15分钟，以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养 基的制备方法制备的预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供的一种预防兔耳痤疮 的ADSCs条件培养基的制备方法，实验结果表明，ADSCs经ADSCs完全培养基 和生理盐水培养均能分泌hEGF、hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、hHgf、hTGF-β 7中生物活性因子，最优收获时间为培养第48小时。A-CM和Fr-CM涂抹均能显著 抑制粉刺、丘疹、脓包、溃烂和结节，并防止皮损部位累及周围组织，其预防 效应与CM浓度呈正相关，是一种预防痤疮的新方法。而生理盐水培养ADSCs获 得的FrA-CM含有多种生物活性成分，不含完全培养基中复杂的生物和化学成 分，且具有与A-CM相似的预防痤疮的潜能，是一种能完全替代A-CM的原料。
附图说明
图1是本发明实施例提供的预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法 流程图。
图2是本发明实施例提供的P3代ADSCs免疫表型示意图。
图3是本发明实施例提供的不同收集时间CM的因子浓度示意图。
图4是本发明实施例提供的不同浓度CM对病灶发生时间的影响示意图。
图5是本发明实施例提供的不同浓度CM对D15病灶数量的影响示意图。
图6是本发明实施例提供的D15天时煤焦油局部涂抹累及周围组织的面积 示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
现有干细胞治疗痤疮的实验研究集中在干细胞或其条件培养基修复痤疮所 带来的组织损伤、色素沉着方面。以脂肪干细胞条件培养基预防痤疮的发生的 研究尚未见报道。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件 培养基及制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的 制备方法包括以下步骤：
S101：脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹部、 腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、运 输。
S102：ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和沉 淀层。以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬细 胞。
S103：制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的 培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清。过滤上清液，收集滤液备用。
S104：制备无培养基ADSCs培养上清(FrA-CM)：以生理盐水重悬P3代 ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中培养。
S105：制备CM-透明质酸(CM-HA)混合液：以终浓度0.1％的HA为增稠剂 和保湿剂，以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA。将CM、HA、生理盐水混合 均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用。
S106：流式细胞术分析：以单克隆抗体与细胞悬液避光孵育，离心弃上清。 以PBS重悬沉淀，上机检测。
S107：利用ELISA法检测A-CM中生物活性分子。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
1、材料和方法
1.1A-CM制备
1.1.1脂肪组织采集在专业医师的操作下完成，本发明采用负压干性抽脂法 采集腹部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃ 保存、运输。
1.1.2ADSCs培养
无菌条件下小心剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少 见颗粒。以2倍体积的医用生理盐水(含50ug/mL硫酸庆大霉素)重悬，500g离 心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，小心吸弃表面油脂，收集脂肪 层和沉淀层。以二倍体积的消化液(0.15mg/mLCollagenaseNB1(17455.03，SERVA)，50IU/mLrhDNase-I(ENZ-319，ProSpec))重悬脂肪层和沉淀层，37 度水浴，190r/min，震荡消化30分钟；吸弃上层油脂、悬浮絮状物；200目筛网 过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸 弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清。以生理盐水洗涤2次。以ADSCs完全培 养基(UltraCULTURE(12-725F，LONZA)，2％UltroserGserumsubstitute (15950-017，PALL))重悬细胞，调整细胞密度为5X105/mL，接种至175cm2组 织培养瓶(EasyFlask，NUNC)中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养，24小时半 量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合时收 获。收获时吸弃培养上清，以生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶 溶液(T6424-1VL，Biologicalindustries)，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶 液(A1250000，Sigma)终止消化；收集细胞悬液，400g离心，5分钟，弃上清， 收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g 离心，5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs。传代时，以ADSCs 完全培养基重悬P0代细胞，按10000细胞/cm2接种，隔夜完全换液，培养至90％ 以上融合时收获，记为P1代ADSCs。继续传代至P2代时收获。
1.1.3制备A-CM
P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，设定升速9降速1，离心30min，收集上清。以0.22um无菌滤器过滤上清 液，收集滤液，-80℃冻存备用。
1.1.4制备无培养基ADSCs培养上清(FrA-CM)
以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组 织处理培养瓶中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养。收集接种后24h、48h、72h的 细胞悬液各50mL，4℃，3000Xg，设定升速9降速1，离心30min，收集上清。以 0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。
1.2制备CM-透明质酸(CM-HA)混合液
CM含有的多肽成分可能为有效成分，易于变性失活。本发明以终浓度0.1％ 的HA为增稠剂和保湿剂。
1.2.1以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA(
Figure BDA0002373846910000114
HA-EP2，华熙生 物)，4℃过夜。不足25mL注射用水，于40℃恒温水浴中混合均匀，于4℃保存备 用。
1.2.2按表1配比，将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃ 保存备用。
表1条件培养基-HA配比表
A-CM-HA配比：
Figure BDA0002373846910000111
FrA-CM-HA配比：
Figure BDA0002373846910000112
对照组配比：
Figure BDA0002373846910000113
1.2流式细胞术分析
收获P3代ADSCs，以PBS洗涤、重悬细胞，调整细胞密度至1X106/mL，以 单克隆抗体(免疫荧光标记)与细胞悬液避光孵育15min，加入2mL溶血素I室温 避光溶血15min，离心弃上清，以PBS重悬沉淀，上机检测，检查CD34、CD45、 HLA-DR、CD73、CD90、CD105表达水平。
1.3ELISA法检测A-CM中生物活性分子
按照ELISA试剂盒规定上机检测1.1.3采集的A-CM、FrA-AM中hEGF、 hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、hHgf、hTGF-β浓度。简单说分别设空白孔、 标准孔、待测样品孔，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动 混匀；用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干， 每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；每孔加入酶标试剂50μl， 空白孔除外；用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；每孔先加入显 色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔 加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；终止反应后15分钟，以空白空 调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
1.4实验分组和方法
1.4.1实验动物选用日本大耳白兔(JapaneseWhiteRabbit)35只，12周龄左 右，雄性，体重2.5-3kg。35只大耳兔随机分组，其中5只为对照组，其余30只为 实验组。
1.4.2给药方法
按表2给药。简单描述，以生理盐水擦洗兔耳内侧面耳导管开口处约4cmX 4cm范围，晾干。实验组30只大耳兔以规定浓度A-CM的条件培养基试剂0.5mL 涂抹兔耳内侧面耳导管开口处4cmX4cm范围(盐水擦洗范围)，晾干20分钟。 以2％煤焦油溶液(纯度50％煤焦油溶液，以95％酒精溶液配制而成，现用现配) 1mL涂抹兔耳内侧面耳导管开口处2cmX2cm范围(A-CM涂抹处中心区域)。对 照组(左耳)盐水擦洗后不做任何其他处理，为阴性对照；对照组(右耳)涂 抹HA-G0和煤焦油，为阳性对照。对照组和实验组每天处理一次，连续处理15 天。
表2动物实验分组
Figure BDA0002373846910000121
Figure BDA0002373846910000131
1.5按中国痤疮治疗指南(2014版)依据三度IV级法评价A-CM对煤焦油诱 导的兔耳痤疮的干预效果：
轻度(I级)：粉刺为主要的皮损，可有少量丘疹和脓包，总病灶数少于30 个。
中度(II～III级)：其中二级有粉刺，伴有中等数量的丘疹和脓包，总病灶数 在30～50之间；III级有粉刺，伴有大量丘疹和脓包，偶见大的炎性损害，分布广 泛，总病灶数在50～100之间，有少量结节。
重度(IV级)：除了上述皮疹外，还伴有3个以上结节与囊肿。
2、统计学分析
采用SPSS17.0进行统计学处理。数据以
Figure BDA0002373846910000132
表示，均值比较采用独立样本 t-test，频数比较采用χ2检验，P<0.05有统计学意义。
3、结果
3.1A-CM制备
脂肪组织来源的原代细胞在体外培养，24小时时可观察到贴壁细胞，呈梭 形、方形、多角形。72小时时可观察到散在的贴壁细胞集落形成。继续培养至 第五天，有典型的类似间充质干细胞集落，即长梭形细胞成旋涡状生长。培养 至第7到7天即可达到70％以上汇合。收集到的P0代ADSCs经两次连续传代至P2 代，收获后继续培养P3代以制备A-CM，收集到的A-CM呈淡橙红色透明。淡橙 红色的A-CM配制成不同浓度的A-CM-HA，颜色依A-CM浓度降低而色度降低， 略粘。收获的P3代ADSCs以生理盐水重悬以制备FrA-CM，收集到的FrA-CM呈无色透明。收获的FrA-CM配制成不同浓度的FrA-CM-HA，呈无色透明，微粘。
3.2P3代ADSCs高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD34、CD45、HLA-DR。P3代ADSCs免疫表型如图2所示。
3.3A-CM和FrA-CM中均含有hEGF、hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、 hHgf、hTGF-β，48小时收集的CM与24小时收集的CM相比，各种因子浓度显著 增长(P＜0.05)，但与72小时收集的CM相比因子浓度没有显著性差异(P＞0.05)。 A-CM和FrA-CM相比，不同采集时间的因子含量之间没有显著性差异(P＞ 0.05)。不同收集时间CM的因子浓度如图3所示。
3.4ADSCs条件培养基能有效推迟煤焦油诱导的大耳兔兔耳粉刺、丘疹发生 时间，降低煤焦油诱导的大耳兔兔耳痤疮发生的程度。
稀释煤焦油涂抹对照组左侧兔耳，24小时即可见到兔耳涂抹部位皮肤发红； 第3天可见局部肿胀，毛孔扩张，皮肤粗糙；第5天可见少量粉刺；第7天可见大 量粉刺，少量直径小于2mm的红色丘疹，没有脓包；第9天起出现大量丘疹，呈 黑色、红色、棕褐色、灰白色等不同颜色，大小1-4mm，有的丘疹发生融合破溃 形成脓包；至第15天用药终点时，涂抹部位严重溃烂，触摸有典型丘疹结节， 并累计周围组织，分布大量粉刺、丘疹(见图4)。实验组在涂抹煤焦油之前涂 抹不同的CM-HA，A-CM或FrA-CM分别涂抹在大耳兔的左耳和右耳，浓度相同。 实验组大耳兔涂抹A-CM或FrA-CM或再涂抹煤焦油，与阳性对照组相同，24小 时即可见兔耳涂抹部位皮肤发红，第3天可见局部肿胀，毛孔扩张，皮肤粗糙； 粉刺的出现时间在低浓度实验组(CM浓度≤20％)为4.6-5.4天(图4)，用药第 15天(D15)的粉刺数量与阳性对照组相比没有显著性差异(p＞0.05)(图5)， 高浓度实验组(CM浓度＞20％)为5.4-10.2天不等(图4)，D15粉刺数量与阳性 对照组相比差异显著(p＜0.05)(图5)，与CM浓度呈负相关趋势(图4，图5)， 但实验组两组之间的粉刺出现时间和D15粉刺数量相比没有显著性差异(p＞ 0.05)(图4，图5)；丘疹的出现时间在实验组(CM浓度≥20％)晚于用药第11 天(图4)，至D15数量与对照组相比差异显著(p＜0.05)(图5)，与CM浓度呈 负相关趋势(图4，图5)，而实验组两组之间的丘疹发生时间和D15丘疹数量相 比没有显著性差异(p＞0.05)(图4，图5)。
在实验组，脓包仅在G20组接近用药终点时发生1-2例，涂抹部位直至D15 也没有出现溃烂和结节。至D15，CM浓度与病灶总数成负相关趋势，与GO相比 有显著性差异(P＜0.05)(图5)，但G40、G60、G80和G100四个剂量组之间没 有显著性差异(p＞0.05)(图5)。而对应的痤疮分级，两个实验组均表现为G0 为典型的IV级，G20为III级，G40和G60为II级，G80和G100为I级。在实验组， 涂抹CM-HA后再涂抹煤焦油同样累及周围组织，但与G0相比，G40-G100组的累 及面积显著减小(P＜0.05)(图6)。
4、本发明实验结果表明，ADSCs经ADSCs完全培养基和生理盐水培养均能 分泌hEGF、hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、hHgf、hTGF-β7中生物活性因 子，最优收获时间为培养第48小时。A-CM和Fr-CM涂抹均能显著抑制粉刺、丘 疹、脓包、溃烂和结节，并防止皮损部位累及周围组织，其预防效应与CM浓度 呈正相关，是一种预防痤疮的新方法。而生理盐水培养ADSCs获得的FrA-CM含 有多种生物活性成分，不含完全培养基中复杂的生物和化学成分，且具有与 A-CM相似的预防痤疮的潜能，是一种能完全替代A-CM的原料。
本发明采用生理盐水和间充质干细胞完全培养基孵育间充质干细胞，在不 同的时间点收集培养上清作为条件培养基，检测二者的区别。间充质干细胞具 有极其复杂的分泌行为，分泌物质包括分泌泡、外泌体、基质蛋白成分、激素、 细胞因子、趋化因子、核酸成分、酶类等等，其调节免疫功能、调节微环境代 谢行为、抑制炎症、调节细胞生长和繁殖、调节细胞凋亡等生物学活性与其分 泌行为直接相关。挑选了与调节细胞增殖、炎症反应、免疫调节有关的细胞因 子，包括hEGF、hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、hHGF、hTGF-β，检测结果发现除了hHGF外，其它几种细胞因子的浓度在A-CM和FrA-CM中基本相当， 没有显著性差异，说明生理盐水孵育间充质干细胞得到的条件培养基与完全培 养基孵育间充质干细胞得到的条件培养基在治疗效应上可能会有相似性。
透明质酸是特殊用途化妆品中常用的保湿剂、增稠剂，终浓度0.1％即可提 高CM的粘度，防止CM的有效成分在涂抹在作用部位后快速干燥失活。本发明将A-CM或FrA-CM与透明质酸调配成不同CM浓度的CM-HA制剂，涂抹在煤焦油诱导 的痤疮部位，观察痤疮发生情况。既往的研究并没有任何有关CM抑制痤疮发生 的报道，仅有的少量研究也集中在采用CM治疗痤疮疤痕方面。因此本发明没有 更多的参考信息和数据。本发明在兔耳涂抹煤焦油之后，接着涂抹CM-HA，考察 A-CM和FrA-CM两种条件培养基是否具有抑制痤疮发生的功能以及在抑制痤疮发 生上有没有区别。按照三度IV级法，痤疮发生初期一般是粉刺和少量丘疹，随着 病情严重，逐步出现脓包、囊肿，最终出现结节。研究发现，无论A-CM还是FrA-CM处理煤焦油涂抹部位，≥40％的CM浓度就可以显著推迟粉刺出现的时间，而≥20％ 的CM浓度就可以显著推迟丘疹出现的时间，但二者之间对粉刺和丘疹出现时间 的影响没有显著性差异。本发明在用药第15天时计数病灶总数，发现使用了含 ≥20％的CM浓度的制剂就能显著减少痤疮相关的各种病灶数量，总病灶数在40％ 的CM浓度时是0％的CM浓度的38.1％，超过40％的CM浓度处理也能减少病灶数， 但与40％的CM浓度时相比差异并不显著。因此体积比40％的CM浓度时最佳制剂 浓度。更重要的是，经CM处理的煤焦油涂抹皮肤，极少出现脓包、溃烂和结节， 也没有囊肿发生。A-CM和FrA-CM配制的制剂相比，无论对病灶出现时间、病灶 形成数量，还是累及组织面积等指标相比都没有显著差异。因此，一方面本发 明确定了CM涂抹用药在预防痤疮方面有显著效果，另一方面本发明确定了以生 理盐水孵育间充质干细胞48h及以上获得的CM与使用间充质干细胞完全培养基 制备的CM在预防煤焦油涂抹诱导的痤疮发生方面效果相似，是可靠的替代方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法包括以下步骤：
步骤一，脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、运输；
步骤二，ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和沉淀层；以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬细胞；
步骤三，制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清；过滤上清液，收集滤液备用；
步骤四，制备无培养基ADSCs培养上清：以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中培养；
步骤五，制备CM-透明质酸混合液：以终浓度0.1％的HA为增稠剂和保湿剂，以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA；将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用；
步骤六，流式细胞术分析：以单克隆抗体与细胞悬液避光孵育，离心弃上清；以PBS重悬沉淀，上机检测；
步骤七，利用ELISA法检测A-CM中生物活性分子。
2.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述ADSCs培养具体包括：
(1)无菌条件下小心剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少见颗粒；以2倍体积的医用生理盐水重悬，500g离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，小心吸弃表面油脂，收集脂肪层和沉淀层；
(2)以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，37度水浴，190r/min，震荡消化30分钟；吸弃上层油脂、悬浮絮状物；200目筛网过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清；
(3)以生理盐水洗涤2次，以ADSCs完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为5X105/mL，接种至175cm2组织培养瓶中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合时收获；
(4)收获时吸弃培养上清，以生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；收集细胞悬液，400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；
(5)传代时，以ADSCs完全培养基重悬P0代细胞，按10000细胞/cm2接种，隔夜完全换液，培养至90％以上融合时收获，记为P1代ADSCs；继续传代至P2代时收获。
3.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述离心速率设定升速9降速1，离心时间为30min；收集上清后，以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。
4.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述制备无培养基ADSCs培养上清的方法具体包括：
以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养；收集接种后24h、48h、72h的细胞悬液各50mL，4℃，3000Xg，设定升速9降速1，离心30min，收集上清；以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。
5.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述制备CM-透明质酸混合液的方法具体包括：
1)以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA，4℃过夜；不足25mL注射用水，于40℃恒温水浴中混合均匀，于4℃保存备用；
2)按照配比，将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用。
6.如权利要求5所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述CM、HA、生理盐水的配比包括：
①所述A-CM-HA的配比为：
组别A-CM-HA-G100：100％,v/v的A-CM；
组别A-CM-HA-G80：80％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；10mL的生理盐水；
组别A-CM-HA-G60：60％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；30mL的生理盐水；
组别A-CM-HA-G40：40％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；50mL的生理盐水；
组别A-CM-HA-G20：20％,v/v的A-CM；10％,v/v的1％HA；70mL的生理盐水；
②所述FrA-CM-HA的配比为：
组别FrA-CM-HA-G100：100％,v/v的FrA-CM；
组别FrA-CM-HA-G80：80％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；10mL的生理盐水；
组别FrA-CM-HA-G60：60％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；30mL的生理盐水；
组别FrA-CM-HA-G40：40％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；50mL的生理盐水；
组别FrA-CM-HA-G20：20％,v/v的FrA-CM；10％,v/v的1％HA；70mL的生理盐水；
③所述对照组的配比为：
组别HA-G0：10％,v/v的1％HA；90mL的生理盐水。
7.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述流式细胞术分析的方法为：
收获P3代ADSCs，以PBS洗涤、重悬细胞，调整细胞密度至1X106/mL，以免疫荧光标记的单克隆抗体与细胞悬液避光孵育15min，加入2mL溶血素I室温避光溶血15min，离心弃上清，以PBS重悬沉淀，上机检测，检查CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105表达水平。
8.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤七中，所述ELISA法检测A-CM中生物活性分子具体包括：
(Ⅰ)按照ELISA试剂盒规定上机检测1.1.3采集的A-CM、FrA-AM中hEGF、hFGF-β、hPGE2、hVEGF、hIGF-1、hHgf、hTGF-β浓度；即分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(Ⅱ)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
(Ⅲ)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(Ⅳ)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50μl，终止反应；终止反应后15分钟，以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。
9.一种利用权利要求1～8任意一项所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法制备的预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养。
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