CN111196993A - 一种数字pcr芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种数字PCR芯片，该芯片包括基底层和盖板层，基底层与盖板层之间形成密封腔体，盖板层上设置有至少一个进样孔和至少一个出样孔，基底层上设置有至少一个储液池和至少一个通道，储液池与通道连通，储液池中设置有至少一个微孔。相应的，本发明还公开了一种制备上述数字PCR芯片的方法。本发明芯片集成度高，面积小，通过采用湿法刻蚀工艺和硅‑玻璃键合，可以批量制作高通量的数字PCR芯片；通过流体仿真改进芯片结构，可以防止后续进样出现流动死角；进样过程利用矿物油与样品的膨胀系数差异封锁待测样品于微孔中，均匀独立并有助于防止样品污染，便于制作靶基因测试的高通量、高灵敏度、高精度的数字PCR芯片。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种数字PCR芯片及其制备方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)技术是常用于生物样品扩增的技术，从1985年美国科学家KaryMullis发明了PCR技术开始至今已经经历了第一代凝胶电泳PCR技术、第二代实时荧光定量PCR技术和第三代数字PCR技术。其中，数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控技术，通过将样品制备、反应、分离和检测整合到一个微流控芯片中，可以直接数出DNA分子的个数，相比于定量PCR需要依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，数字PCR更快速准确、方便使用。由于这些优异特性，数字PCR在极微量核酸样本检测、表达量微小差异鉴定、稀有突变检测等方面表现优异，在病原体检测、食品检测、疗效评估，癌症标志物稀有突变检测、单细胞基因表达、诊断胎儿发育障碍等诸多方面有着广阔的应用前景。
随着各种微组装技术的发展，提出一种微机电系统(MEMS)加工与生物检测相结合的技术，虽然采用该技术可以制作出比表面积大、集成度高的数字PCR芯片，但是采用该技术制作出的数字PCR芯片存在以下不足：1)采用的芯片制备工艺繁琐复杂，操作难度高，并且工艺设备昂贵，不利于批量生产；2)采用的芯片结构设计在导入流体时易产生空气泡死角影响后续PCR反应；3)采用的芯片结构芯片密封性不足会导致样本损失及样本污染；4)制作出的芯片成本高、芯片集成度、灵敏度和精确度都不够高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种数字PCR芯片及其制备方法，以解决现有技术中存在的上述技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种数字PCR芯片，包括基底层和盖板层，所述基底层与所述盖板层之间形成密封腔体，
所述盖板层上设置有至少一个进样孔和至少一个出样孔，
所述基底层上设置有至少一个储液池和至少一个通道，所述储液池与所述通道连通，所述储液池中设置有至少一个微孔。
优选的，所述基底层上设置有八个储液池和八个通道，各个所述储液池与各个所述通道连通，所述八个通道均匀排布在所述基底层上。
优选的，各个所述通道中设置有适于样品流动的边缘角。
优选的，所述基底层与所述盖板层之间通过键合工艺键合在一起。
优选的，所述基底层采用硅质材料制成，所述盖板层采用透光材料制成。
本发明另一方面提供了一种制备上述数字PCR芯片的方法，该方法包括以下步骤：
S1.准备所述基底层；
S2.在所述基底层正面涂光刻胶，光刻显影，形成所述储液池和所述通道的图形；
S3.刻蚀所述基底层表面的氧化层，将显影后所述光刻胶上的所述储液池与所述通道的图形转移到所述氧化层上，然后去胶；
S4.通过各向异性湿法刻蚀所述基底层，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述储液池和所述通道；
S5.用清洗液清洗后，刻蚀剩余的所述氧化层；
S6.对所述基底层进行氧化形成氧化层；
S7.在所述基底层正面涂光刻胶，光刻显影，形成微孔的图形；
S8.刻蚀所述氧化层，将显影后所述光刻胶上的所述微孔的图形转移到所述氧化层上，然后去胶；
S9.通过各向异性湿法刻蚀所述基底层，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述微孔；
S10.用清洗液清洗后，刻蚀剩余的所述氧化层；
S11.在所述盖板层上打孔形成所述进样孔和所述出样孔，通过键合工艺将所述基底层与所述盖板层键合在一起，即制成所述数字PCR芯片。
优选的，所述步骤S1包括：选择表面为(100)晶面、单面抛光并氧化的硅片作为所述基底层。
优选的，所述步骤S4包括：
采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀所述基底层，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述储液池和所述通道。
优选的，所述步骤S9包括：
采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀所述基底层，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述微孔。
优选的，所述步骤S11包括：
在所述盖板层的设定位点采用激光打孔法打出所述进样孔和所述出样孔，通过键合工艺将所述基底层与所述盖板层键合在一起，即制成所述数字PCR芯片。
本发明具有如下有益效果：
1、采用的芯片制备方法简单易行，提高了芯片的一致性和重复性；
2、芯片集成度高，面积小，通过采用湿法刻蚀工艺和硅-玻璃键合，可以批量制作高通量的数字PCR芯片，且微孔大小和间隙尺寸可自行调整不受工艺影响；
3、通过流体仿真改进芯片结构，可以防止后续进样出现流动死角；
4、进样过程利用矿物油与样品的膨胀系数差异封锁待测样品于微孔中，均匀独立并有助于防止样品污染，便于制作靶基因测试的高通量、高灵敏度、高精度的数字PCR芯片。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或者现有技术中的技术方案，下面将对实施例或者现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1是本发明实施例一提供的数字PCR芯片的结构示意图，其中：1-进样孔，2-出样孔，3-储液池，4-微孔，5-通道；
图2是本发明实施例二和实施例三提供的制备数字PCR芯片的方法流程示意图，其中：
a-单面抛光氧化的硅片清洗 b-正面涂光刻胶
c-光刻、显影 d-BOE刻蚀氧化层/去胶
e-KOH刻蚀储液池 f-BOE刻蚀剩余氧化层
g-生长氧化层 h-正面涂光刻胶
i-光刻、显影 j-BOE刻蚀氧化层
k-去胶 l-KOH刻蚀出微腔
m-BOE刻蚀剩余氧化层 n-硅-玻璃键合
6-基底层 7-氧化层
8-光刻胶 9-盖板层；
图3是本发明实施例四提供的数字PCR芯片的进样方法的流程示意图；
图4是本发明实施例五提供的明场为50×50μm数字PCR芯片局部正置显微镜照片；
图5是本发明实施例五提供的暗场为50×50μm数字PCR芯片局部正置显微镜照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
实施例一
本实施例提供了一种数字PCR芯片，如图1所示，包括基底层和盖板层。优选的，基底层采用硅质材料(例如硅片)制成，盖板层采用透光材料(例如硼硅玻璃)制成。盖板层上设置有至少一个进样孔1和至少一个出样孔2，进样孔1和出样孔2分别用于样品及矿物油的进出。优选的，进样孔1和出样孔2通过激光打孔法形成。基底层上设置有至少一个储液池3和至少一个通道5，储液池3与通道5连通，储液池3中设置有至少一个微孔4。优选的，基底层上设置有八个储液池3和八个通道5，各个储液池3与各个通道5连通，八个通道5均匀排布在基底层上，可实现样品的导入均分。每个通道5的边角通过流体仿真确定最符合液体流动的边缘角。基底层与盖板层之间采用硅-玻璃键合工艺键合在一起形成密封腔体。优选的，基底层的表面氧化的氧化层可以作为阻挡层防止湿法刻蚀腐蚀基底层，其氧化厚度随储液池3的深度变化而变化。
实施例二
本实施例提供了一种制备50×50μm的上述数字PCR芯片的方法，如图2所示，该方法包括以下步骤：
1)选择表面为(100)晶面、单面抛光并氧化的硅片清洗去除表面有机无机杂质，并进行脱水热烘干燥，将清洗后的硅片作为基底层6，氧化层7厚度为
左右，硅片表面平整度小于1μm，如图2a所示；
2)在基底层6正面甩涂光刻胶8(正胶)，光刻显影后坚膜，形成储液池及通道的图形，如图2b、2c所示；
3)用BOE腐蚀液刻蚀所述基底层6表面的氧化层7，将显影后光刻胶8上的储液池与通道的图形转移到氧化层7上然后去胶，如图2d所示；
4)采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀基底层6，通过控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出储液池和通道，深度20μm，如图2e所示；
5)先用硫酸溶液清洗，再用BOE腐蚀液刻蚀剩余的氧化层7，如图2f所示；
6)对基底层6进行氧化形成氧化层7，氧化层7厚度为
左右，硅片表面平整度小于1μm，如图2g所示；
7)在基底层6正面甩涂光刻胶8(正胶)，光刻显影，形成微孔的图形，如图2h、2i所示；
8)用BOE腐蚀液刻蚀氧化层7，将显影后光刻胶8上的微孔图形转移到氧化层7上，如图2j所示；
9)然后去胶，如图2k所示；
10)采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀基底层6，通过控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出微孔，如图2l所示；
11)先用硫酸溶液清洗，再用BOE腐蚀液刻蚀剩余的氧化层7，如图2m所示；
12)选择可与硅片键合的BYF33玻璃作为盖板层9，采用激光打孔法在设定位点打出直径为1-2mm的进样孔和出样孔，并通过硅-玻璃键合工艺将基底层6与盖板层9键合在一起，如图2n所示，即制得50×50μm数字PCR芯片。
本实施例通过氢氧化钾湿法刻蚀工艺，可以将晶面表面为(100)单抛光的氧化硅片沿(111)晶面各向异性腐蚀，由此得到的微腔呈倒四棱锥形状，排列整齐且大小均一。
实施例三
本实施例提供了一种制备20×20μm的上述数字PCR芯片的方法，如图2所示，该方法包括以下步骤：
1)选择表面为(100)晶面、单面抛光并氧化的硅片清洗去除表面有机无机杂质，并进行脱水热烘干燥，将清洗后的硅片作为基底层6，氧化层7厚度为
左右，硅片表面平整度小于1μm，如图2a所示；
2)在基底层6正面甩涂光刻胶8(正胶)，光刻显影后坚膜，形成储液池及通道的图形，如图2b、2c所示；
3)用BOE腐蚀液刻蚀所述基底层6表面的氧化层7，将显影后光刻胶8上的储液池与通道的图形转移到氧化层7上然后去胶，如图2d所示；
4)采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀基底层6，通过控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出储液池和通道，深度20μm，如图2e所示；
5)先用硫酸溶液清洗，再用BOE腐蚀液刻蚀剩余的氧化层7，如图2f所示；
6)对基底层6进行氧化形成氧化层7，氧化层7厚度为
左右，硅片表面平整度小于1μm，如图2g所示；
7)在基底层6正面甩涂光刻胶8(正胶)，光刻显影，形成微孔的图形，如图2h、2i所示；
8)用BOE腐蚀液刻蚀氧化层7，将显影后光刻胶8上的微孔图形转移到氧化层7上，如图2j所示；
9)然后去胶，如图2k所示；
10)采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀基底层6，通过控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出微孔，如图2l所示；
11)先用硫酸溶液清洗，再用BOE腐蚀液刻蚀剩余的氧化层7，如图2m所示；
12)选择可与硅片键合的BYF33玻璃作为盖板层9，采用激光打孔法在设定位点打出直径为1-2mm的进样孔和出样孔，并通过硅-玻璃键合工艺将基底层6与盖板层9键合在一起，如图2n所示，即制得20×20μm数字PCR芯片。
实施例四
本实施例提供了一种实施例二制得的数字PCR芯片的进样方法。
具体的，PCR预混液(10μL)包含5μL Roche 480Probe Premix，各125nM EGFR基因19外显子上下游引物，100nM TaqMan探针，5ng基因组DNA。
如图3所示，该进样方法包括以下步骤：
S1：制备PCR预混液，在进样孔注入PCR预混液，液体通过表面张力自发流入芯片并均匀铺满；
S2：通过移液枪或者简易负压泵将矿物油注入，矿物油把在储液池的样品排出，填满于整个储液池，仅留存样品于池底微孔当中；
S3：进行PCR扩增；
S4：将进样孔与出样孔用矿物油相封闭。
本实施例无需进行表面亲水修饰，进样过程通过毛细作用自发导入，进样往往只需几秒便可完成，方便快捷；矿物油的密度比样品低，将其从进样孔打入芯片将储液池内部的多余样品排出芯片，所有的样品都被封锁于微孔阵列里，使每个微孔里均匀存留样品独立进行PCR反应，确保反应过程的洁净度和独立性。
实施例五
本实施例提供了一种实施例二制得的数字PCR芯片的PCR方法。该PCR方法具体为：
将该芯片放于PCR仪进行在片原位PCR扩增(in situ PCR)，PCR循环程序为：95℃10min预变性，95℃10s，58℃40s循环，共45个循环，最后10℃保温，采用正置显微镜观察结果，CCD照相，计数微腔中阳性荧光信号。
PCR扩增后明暗场图如图4和图5所示，图4为明场为50×50μm数字PCR芯片局部正置显微镜照片，从图4中可以看出，微孔呈倒金字塔型排成阵列，整体在八通道内均匀分布，一共46200个微孔。图5为暗场为50×50μm数字PCR芯片局部正置显微镜照片。从图5中可以明显的看到单个微腔中的强荧光，说明芯片进行PCR后可以清晰分辨出单个野生型突变基因，达到了数字PCR要求。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、采用的芯片制备方法简单易行，提高了芯片的一致性和重复性；
2、芯片集成度高，面积小，通过采用湿法刻蚀工艺和硅-玻璃键合，可以批量制作高通量的数字PCR芯片，且微孔大小和间隙尺寸可自行调整不受工艺影响；
3、通过流体仿真改进芯片结构，可以防止后续进样出现流动死角；
4、进样过程利用矿物油与样品的膨胀系数差异封锁待测样品于微孔中，均匀独立并有助于防止样品污染，便于制作靶基因测试的高通量、高灵敏度、高精度的数字PCR芯片。
应当注意的是，以上实施例只为解释说明所用，而不应被当成是对本发明所包含内容范围的限制。由于受篇幅限制，发明人仅对较为典型的实施方法进行了描述，但本领域技术人员应当充分认识到本发明可以针对未脱离发明内容主旨的创新点及优点作相关修改，且所有这类修改都应包含在本发明所定义的和等同意义的内容范围之内。
Claims (10)
1.一种数字PCR芯片，其特征在于，包括基底层(6)和盖板层(9)，所述基底层(6)与所述盖板层(9)之间形成密封腔体，
所述盖板层(9)上设置有至少一个进样孔(1)和至少一个出样孔(2)，
所述基底层(6)上设置有至少一个储液池(3)和至少一个通道(5)，所述储液池(3)与所述通道(5)连通，所述储液池(3)中设置有至少一个微孔(4)。
2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述基底层(6)上设置有八个储液池(3)和八个通道(5)，各个所述储液池(3)与各个所述通道(5)连通，所述八个通道(5)均匀排布在所述基底层(6)上。
3.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，各个所述通道(5)中设置有适于样品流动的边缘角。
4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述基底层(6)与所述盖板层(9)之间通过键合工艺键合在一起。
5.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述基底层(6)采用硅质材料制成，所述盖板层(9)采用透光材料制成。
6.一种制备如权利要求1-5中任一项所述的数字PCR芯片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.准备所述基底层(6)；
S2.在所述基底层(6)正面涂光刻胶(8)，光刻显影，形成所述储液池(3)和所述通道(5)的图形；
S3.刻蚀所述基底层(6)表面的氧化层(7)，将显影后所述光刻胶(8)上的所述储液池(3)与所述通道(5)的图形转移到所述氧化层(7)上，然后去胶；
S4.通过各向异性湿法刻蚀所述基底层(6)，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述储液池(3)和所述通道(5)；
S5.用清洗液清洗后，刻蚀剩余的所述氧化层(7)；
S6.对所述基底层(6)进行氧化形成氧化层(7)；
S7.在所述基底层(6)正面涂光刻胶(8)，光刻显影，形成微孔(4)的图形；
S8.刻蚀所述氧化层(7)，将显影后所述光刻胶(8)上的所述微孔(4)的图形转移到所述氧化层(7)上，然后去胶；
S9.通过各向异性湿法刻蚀所述基底层(6)，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述微孔(4)；
S10.用清洗液清洗后，刻蚀剩余的所述氧化层(7)；
S11.在所述盖板层(9)上打孔形成所述进样孔(1)和所述出样孔(2)，通过键合工艺将所述基底层(6)与所述盖板层(9)键合在一起，即制成所述数字PCR芯片。
7.根据权利要求6所述的制备所述数字PCR芯片的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：选择表面为(100)晶面、单面抛光并氧化的硅片作为所述基底层(6)。
8.根据权利要求6所述的制备所述数字PCR芯片的方法，其特征在于，所述步骤S4包括：
采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀所述基底层(6)，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述储液池(3)和所述通道(5)。
9.根据权利要求6所述的制备所述数字PCR芯片的方法，其特征在于，所述步骤S9包括：
采用30％KOH腐蚀液，在50℃条件下通过各向异性湿法刻蚀所述基底层(6)，控制腐蚀速率和腐蚀时间制备出所述微孔(4)。
10.根据权利要求6所述的制备所述数字PCR芯片的方法，其特征在于，所述步骤S11包括：
在所述盖板层(9)的设定位点采用激光打孔法打出所述进样孔(1)和所述出样孔(2)，通过键合工艺将所述基底层(6)与所述盖板层(9)键合在一起，即制成所述数字PCR芯片。
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