CN109971609A - 一种数字pcr芯片及其制备方法 - Google Patents

一种数字pcr芯片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种数字PCR芯片，一种数字PCR芯片，包括有机玻璃支撑层、高分子材料层和芯片基层，所述高分子材料层为高分子树脂材料，所述数字PCR芯片为边长7mm的方形以及一种数字PCR芯片的制备方法：选择一单面抛光的芯片基片；将硅基材料单一面抛光后将高分子材料键合在抛光面硅基表面；在高分子材料表面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光在表面形成图形列阵；在图形阵列掩膜下干法刻蚀芯片，形成沟槽和微孔；去胶，丙酮水浴后超声清洗，然后在硫酸和过氧化氢混合溶液中浸泡，最后使用去离子水冲洗；划片，完成芯片制备。解决了现有技术中数字PCR芯片加工工艺复杂、成本昂贵、芯片的通量低以及芯片使用的简易性等问题。

Description

一种数字PCR芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于PCR技术领域，具体涉及一种数字PCR芯片及其制备方法。
背景技术
数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，数字PCR先将样品稀释到单分子水平，再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。与实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，qPCR)对每个循环进行实时荧光测定的方法不同，数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。理论上，在样品中目标DNA浓度极低的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是，通常每反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，就需要使用泊松概率分布函数(Poisson distribution)进行计算，根据反应单元总数、有荧光信号的单元数以及样品的稀释系数，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。
随着微流体技术、纳米制造技术和微电子技术等的发展，微流控芯片技术的使用使数字PCR能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元，进行多步平行反应，成本低、体积小和高通量，是理想的数字PCR平台。目前已报道的数字PCR系统主要采用硅、玻璃、PDMS等构成，其中PDMS材料具有优良的生物惰性、较好的透光性，在数字芯片中得到了广泛的应用。但是在数字PCR芯片的应用中具有一定的局限性，主要是由于PDMS具有一定程度的透气性，而PCR的热循环温度较高，高温一般在94-95℃，同时在预变性过程中还需要在高温阶段维持5-10分钟，由于PCR热循环过程的高温已经接近水的沸点100℃，如果密封材料具有一定透气性势必会使水蒸气挥发造成反应液中水溶剂减少，反应液的成分浓度发生变化，当热循环温度降低时，由于反应池高温时水分的挥发形成负压，环境中的气体同样会由于PDMS的透气性进入到反应池中形成气泡，进而影响反应池的密封。同时PDMS的热导率较差(约0.18W/mK)，利用其制备的PCR芯片在热循环过程中热传递效率较低，如果在不延长热循环时间的前提下必然会对PCR扩增效率造成影响。
现有技术目前采用全部硅基制作，价格贵、加工周期长、操作复杂、加工工艺繁琐等等缺点，这些缺点的主要原因在于之前专利内容所述所采用的材料为硅基加工芯片，硅基芯片本身价格昂贵，而且由于芯片本身材料的问题加工工艺及成本问题会造成量产及实际使用等方面的困难。现有发明CN105039153B一种硅基阵列微反应池数字PCR芯片及其制备方法。该芯片主要包括上盖和芯片，其中在芯片上有蜂窝状排列的微孔，上盖固定于芯片槽上。具体步骤为选择一单面抛光的硅片，清洗，在硅片抛光面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光形成圆形的图形阵列，在圆形的图形阵列掩膜下干法刻蚀硅，形成微孔结构，去胶划片，完成芯片制备。但是该发明在芯片的制备过程中需要对芯片表面和微孔内部进行二次修饰。现有专利CN108373969A公开了一种数字PCR芯片及其制备方法以及使用方法。该数字PCR芯片包括自下而上依次设置的：玻璃支撑层、密封层、反应层、空腔层以及防水层，其中，所述密封层、反应层和空腔层由聚二甲基硅氧烷制成，所述防水层由聚对二甲苯制成。
发明内容
本发明为解决现有技术中数字PCR芯片加工工艺复杂、成本昂贵、芯片的通量低以及芯片使用的简易性等问题，提供了一种数字PCR芯片及其制备方法，具体技术方案如下：
一种数字PCR芯片，包括有机玻璃支撑层、高分子材料层和芯片基层，所述高分子材料层为环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、聚对二甲苯、聚酰亚胺、硅橡胶、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的任意一种材料或者是任意至少两种材料的复合。
具体地，所述高分子层为聚甲基丙烯酸甲脂与聚对二甲苯的复合。
具体地，所述芯片基层为硅基层或硬质硅胶层。
具体地，所述数字PCR芯片为边长7mm的方形。
一种数字PCR芯片的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：选择一单面抛光的芯片基片作为芯片基层；
步骤2：将硅基材料单一面抛光后，再将高分子材料键合在硅基表面的抛光面上；
步骤3：在步骤2键合后的高分子材料表面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光在表面形成图形列阵；
步骤4：在步骤3中得到的图形阵列掩膜下干法刻蚀芯片，形成沟槽和微孔；
步骤5：去胶，将步骤4中得到的芯片经丙酮水浴后超声清洗，然后在硫酸和过氧化氢混合溶液中浸泡，最后使用去离子水冲洗；
步骤6：划片，完成芯片制备。
优选地，所述步骤2中高分子材料的厚度为45μm。
优选地，所述步骤3中图形阵列为正六边形图形阵列或方形图形阵列。
优选地，所述正六边形图形阵列中，正六边形对边之间的距离范围为0.022-0.049mm，正六边形间隙为0.013mm。
优选地，所述方形图形阵列中，方形边长为0.0335mm，方形间隙为0.065mm。
具体地，所述步骤5中丙酮水浴10min，超声10min，在硫酸和过氧化氢混合溶液浸泡20min，最后使用去离子水冲洗20遍以上。
本发明具有以下有益效果：
一、采用了密排孔的设计，一方面微孔间隙小于孔径，另一方面微孔深宽比较小从而能够保证反应试剂的高进孔率、减少空孔率，以免一旦发生热循环反应气体会将上层液体排出微孔，从而确保了PCR反应发生的效率。
二、高分子材料由于其本身具有亲水性、生物兼容性以及隔光等效果，避免了在加工完反应微孔后的二次加工修饰，降低了操作的复杂性及难易度。
三、芯片尺寸大幅度减小；反应微孔的尺寸减小，数量增加，从而在减小芯片尺寸的基础上扩大了单个样本的检测通量。
附图说明
图1为数字PCR芯片尺寸示意图；
图2为数字PCR芯片正六边形图形阵列示意图；
图3为数字PCR芯片正六边形图形阵列右上角尺寸示意图；
图4为数字PCR芯片正六边形图形阵列左下角尺寸示意图；
图5为数字PCR芯片方形图形阵列示意图；
图6为数字PCR芯片方形图形阵列右上角尺寸示意图；
图7为数字PCR芯片方形图形阵列左下角尺寸示意图。
具体实施例
实施例1
一种数字PCR芯片，包括有机玻璃支撑层、高分子材料层和芯片基层，所述高分子材料层设置在芯片基层上，所述高分子材料层上方有有机玻璃支撑层，所述高分子材料层为耐热、具有生物兼容性、固态稳定的聚甲基丙烯酸甲脂与聚对二甲苯的复合，由于其本身具有亲水性、生物兼容性以及隔光等效果，避免了在加工完反应微孔后的二次加工修饰，降低了操作的复杂性及难易度，所述芯片基层为硬质硅胶层，所述数字PCR芯片为边长H为7mm的方形。
一种数字PCR芯片的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：选择一单面抛光的芯片基片作为芯片基层；
步骤2：将硬质硅胶层单一面抛光后，再将复合后的聚甲基丙烯酸甲脂与聚对二甲苯作为高分子材料键合在硅基表面抛光面上，所述高分子材料的厚度为45μm；
步骤3：在高分子材料表面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光在表面形成正六边形图形列阵，所述正六边形图形阵列中，如图2所示，正六边形对边之间的距离D为0.049mm，正六边形间隙d为0.013mm；
步骤4：在步骤3中得到的图形阵列掩膜下干法刻蚀芯片，形成沟槽和微孔；一方面微孔间隙小于微孔孔径，另一方面微孔深宽比较小从而能够保证反应试剂的高进孔率、减少空孔率，以免一旦发生热循环反应气体会将上层液体排出微孔，从而确保了PCR反应发生的效率；
步骤5：去胶，将步骤4中得到的芯片经丙酮水浴10min后超声清洗10min，然后在硫酸和过氧化氢混合溶液中浸泡20min，最后使用去离子水冲洗20遍以上；
步骤6：划片，完成芯片制备。
采用上述方法制得的芯片，如图1所示，所述硬质硅胶层与芯片边缘的距离h1和h2为0.172mm，所述正六边形图形阵列与所述硬质硅胶层上下边缘的距离h3为0.2mm，所述正六边形图形阵列与所述硬质硅胶层右边缘的距离h4为0.5mm，如图3和图4所示，所述上下沟槽宽度a2和a3为0.0205mm，所述左右沟槽宽度a4和a1为0.01565mm。
采用刮液的方式注液，能够一次性在两万多个阵列微反应池中有效注液。微孔排列为正六边形状，目的是在有限芯片面积上尽可能多的分布微孔，微孔阵列外围设计一定宽度的方框沟槽，可以防止在刮液操作过程中液体溢出芯片表面，节约生物试剂，还能减少热循环过程中微孔反应试剂挥发，保证PCR正常扩增效率。
实施例2
与实施例1相比，该实施例中所述正六边形图形阵列中，正六边形对边之间的距离D为0.03mm，正六边形间隙d为0.013mm；所述上下沟槽宽度a2和a3为0.02775mm，所述左右沟槽宽度a4和a1为0.0248mm。
实施例3
与实施例1相比，该实施例中所述正六边形图形阵列中，正六边形对边之间的距离D为0.022mm，正六边形间隙d为0.013mm；所述上下沟槽宽度a2和a3为0.02825mm，所述左右沟槽宽度a4和a1为0.02015mm。
实施例4
与实施例1相比，该实施例中通过曝光在表面形成正方图形列阵，如图5所示，所述正方图形阵列中，正方形边长B为0.0335mm，正方形间隙b为0.065mm，如图6和图7所示，所述上下沟槽宽度a2和a3为0.01125mm，所述左右沟槽宽度a4和a1为0.02125mm。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种数字PCR芯片，包括有机玻璃支撑层、高分子材料层和芯片基层，其特征在于，所述高分子材料层为环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、聚对二甲苯、聚酰亚胺、硅橡胶、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的任意一种材料或者是任意至少两种材料的复合。
2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述高分子层为聚甲基丙烯酸甲脂与聚对二甲苯的复合。
3.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片基层为硅基层或硬质硅胶层。
4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述数字PCR芯片为边长7mm的方形。
5.一种如权利要求1所述数字PCR芯片的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1：选择一单面抛光的芯片基片作为芯片基层；
步骤2：将硅基材料单一面抛光后，再将高分子材料键合在硅基表面抛光面上；
步骤3：在步骤2键合后的高分子材料表面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光在表面形成图形列阵；
步骤4：在步骤3中得到的图形阵列掩膜下干法刻蚀芯片，形成沟槽和微孔；
步骤5：去胶，将步骤4中得到的芯片经丙酮水浴后超声清洗，然后在硫酸和过氧化氢混合溶液中浸泡，最后使用去离子水冲洗；
步骤6：划片，完成芯片制备。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中高分子材料的厚度为45μm。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中图形阵列为正六边形图形阵列或方形图形阵列。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述正六边形图形阵列中，正六边形对边之间的距离范围为0.022-0.049mm，正六边形间隙为0.013mm。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方形图形阵列中，方形边长为0.0335mm，方形间隙为0.065mm。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中丙酮水浴10min，超声10min，在硫酸和过氧化氢混合溶液浸泡20min，最后使用去离子水冲洗20遍以上。
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