CN111194307A - 用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的溶血‑二酰基甘油基三甲基高丝氨酸(lyso‑DGTS)或其衍生物，并且进一步提供了特别此类溶血‑DGTS衍生物。

Description

用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的组合物和方法
技术领域
本发明提供了用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物组合物和方法。
背景技术
动脉粥样硬化是一种多因素疾病，且是心脏病发作、中风和外周血管疾病的常见原因，它们一起被称为“心血管疾病”(CVD)。动脉粥样硬化性CVD是一种以脂质和化合物在动脉壁内沉积为特征的病理过程，被认为是西方世界发病率和死亡率的主要原因。
使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(他汀类)降低低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇已成为降低心血管风险的策略的组成部分。然而，他汀类使CVD风险降低不超过40％，并且它们具有一些副作用，例如肌肉疼痛和损伤、肝脏问题、消化问题、皮疹或潮红、血糖升高以及记忆丧失或混乱。高密度脂蛋白(HDL)的调节由于其抗动脉粥样硬化性质而成为降低CVD风险的替代策略，例如胆固醇逆向转运(Khera等人，2011；Miller等人，1985)、抗氧化剂、消炎药(Barter等人，2007)、抗凋亡、血管舒张和细胞保护作用以及内皮功能改善。在过去的几年中，越来越多的证据来自流行病学数据、动物研究和临床试验，其支持HDL作为降低他汀类治疗的高危患者的残留心血管风险的下一个靶标(Zakiev等人，2017)。然而，HDL-胆固醇(HDL-C)水平升高将导致CVD风险降低的假设尚未得到真正证实。开发用于增加血液HDL水平的方法不能降低CVD风险。例如，尽管血液HDL胆固醇水平增加了72％，但由于过量的不良事件和无效性而终止了使用胆固醇酯转移蛋白抑制剂的临床试验。烟酸和布酸(fabric acid)衍生物会增加HDL胆固醇水平，但将这些增加与临床风险降低联系起来是有问题的。相反，最近的研究表明，重点应该在于改善HDL功能(HDL“质量”)，其真实地反映HDL的实际有益效果并负责HDL的实际有益效果，而不是增加HDL-C水平(HDL-C“数量”)(Santos-Gallego等人，2015；Zheng等人，2012；Pirillo等人，2013)。
HDL包含脂蛋白种类的异质家族，其在表面电荷、大小以及脂质和蛋白质组成上不同(Hafiane等人，2015)。最近已发现脂质(如鞘氨醇-1-磷酸(S1P))是HDL功能障碍的机制原因和治疗靶标(Sattler等人，2009)。冠状动脉疾病(CAD)患者比健康志愿者表现出更低的HDL-结合的S1P，同时发现CAD-HDL功能障碍，其证明了更低的内皮信号激活和血管舒张诱导。向具有HDL功能障碍的动物补充S1P逆转HDL质量(Levkau等人，2015；Poti等人，2014；Sattler等人，2015)。
HDL功能性和动脉粥样硬化保护作用的大部分也归因于其相关的酶对氧磷酶1(PON1；EC3.1.8.1)(Gu等人，2016)。发现PON1缺陷小鼠对动脉粥样硬化的发展易感，而人PON1在小鼠中的过表达则抑制其发展(Shih等人，1995；2000)。PON1活性与颈动脉内中膜厚度逆相关(Gur等人，2014)，减弱巨噬细胞对氧化LDL的摄取，抑制巨噬细胞胆固醇生物合成速率，并刺激HDL介导的胆固醇从巨噬细胞中流出(Cohen等人，2014；Tavori等人，2009，2011a，2011b)。流行病学证据证明了PON1活性低与心血管事件和CVD的风险增加相关(Gugliucci等人，2015)。PON1对有机磷酸酯三酯、芳基酯、环状氨基甲酸酯、葡糖苷酸、雌激素酯和硫代内酯具有许多活性，而PON1的“天然”底物假定为内酯(Tavori等人，2008)。作为HDL携带的抗氧化酶，PON1可以通过脂内酯酶活性水解脂蛋白中的脂质过氧化物，从而降低血清脂蛋白、巨噬细胞和动脉粥样硬化病变中的氧化应激(Rosenblat等人，2006；Ben-David等人，2012)。
微藻被用作食物来源和水产养殖的可补充饲料以用于生产软体动物和一些鱼类。微藻由于其高油含量和快速的生物质生产而被认为是生物燃料生产的潜在良好来源。藻类成分在化妆品中常用作增稠剂、水结合剂和抗氧化剂。微藻提取物由于其高含量的类胡萝卜素，包括多酚在内的酚类化合物和脂质(如磷脂、全水解的糖脂和未水解的糖脂、溶血脂质、游离脂肪酸、蜡以及甾醇和甾醇酯)而广泛用作治疗和食品补充剂。
几种微藻(包括微拟球藻属(Nannochloropsis sp.)和微藻微拟球藻(Nannochloropsis salina))已被描述为ω-3脂肪酸(如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的潜在来源。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的载体和式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
I R1-C(O)-R2-R3-COOH
其中，
R1为(C15-C21)烷基、(C15-C21)烯基或(C15-C21)炔基；
R2为-O-CH2-CHR4-CH2-O-、-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-；
R3是被式-N+(R5)3的基团取代，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代的(C1-C8)亚烷基；
R4为-OH、-O-C(O)-R6或-NH-C(O)-R6；
R5各自独立地为(C1-C8)烷基；和
R6为(C15-C21)烷基、(C15-C21)烯基或(C15-C21)炔基。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的如上所定义的式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一方面，本发明涉及如上所定义的式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物中的用途。
在另一方面，本发明涉及一种用于在有需要的受试者中治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如上所定义的式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一方面，本发明提供了一种如上所定义的式I化合物，但不包括其中R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-的化合物，即其中R2是-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-的式I化合物。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上所定义的式I化合物(但不包括其中R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-的化合物)、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体。
附图说明
图1A-1B示出了与0、1、5、10、50和100μg/ml浓度的溶血-DGTS在37℃下于Tris缓冲液(pH＝8.4)中温育2、4、24或48小时后的rePON1内酯酶活性(1A)；与0、1、5、10、50和100μg/ml浓度的溶血-DGTS于Tris缓冲液(pH＝8.4)中在37℃下温育2或4小时后的rePON1芳基酯酶活性(1B)。每个实验分别重复至少三次。*p<0.05，***p<0.0001与对照(不含溶血-DGTS的rePON1)有关。使用单向方差分析和Graphpad prism 5软件分析统计数据。
图2示出了人血清PON1内酯酶活性。用PBS将人血清稀释20倍，并分别与0、1、5、10或50μg/ml浓度的溶血-DGTS在37℃下于Tris缓冲液(pH＝8.0)中温育4小时，使用二氢香豆素测定法测定PON1内酯酶活性。每个实验分别重复至少三次。*p＜0.05，***p＜0.0001与对照(不含溶血-DGTS的血清)有关。使用单向方差分析和Graphpad prism 5软件分析统计数据。
图3A-3B示出了在黑色96孔板中用/不用1、5、10、25、50、75和100μg/ml浓度的溶血-DGTS在25℃(3A)或37℃(3B)下温育2小时的rePON1(50μg/ml；1.16μM)的色氨酸荧光光谱。在290nm的激发和320-450nm的发射处测定荧光。每个实验分别重复至少三次。
图4A-4D示出了在37℃(4A)和25℃(4B)下溶血-DGTS对rePON1的荧光猝灭的Stern-Volmer图；以及在37℃(4C)和25℃(4D)下溶血-DGTS对rePON1的荧光猝灭的双对数图。每个实验分别重复三次。结果表示为平均值±SD。对于所有线性图，R2>0.99且P<0.0001。
图5A-5B示出了溶血-DGTS定向于潜在rePON1结合位点中。rePON1的分子表面示出了与溶血-DGTS对接的亲水性区和疏水性区(5A)；溶血-DGTS在rePON1结合位点中的位置示出了与结合凹槽中的氨基酸相互作用(红色，氧气；蓝色，氮气；灰色，碳)(5B)。
图6A-6B示出了溶血-DGTS对rePON1流入巨噬细胞中的影响。用FITC标记rePON1，并与不同浓度的溶血-DGTS(10、20、50和100μg/ml)温育2小时；然后将每种溶液添加到J774A.1细胞中，在37℃下温育16小时，并通过FACS分析进行分析。图6A示出了直方图，其示出了在没有FITC的rePON1温育的细胞(阴性对照)，FITC-rePON1温育的细胞；用10、20、50和100μg/ml的溶血-DGTS温育的FITC-rePON1温育的细胞中代表性实验的平均荧光强度(MFI)的偏移。MFI的平均值示于图6B中。***p<0.0001与对照(仅用FITC-rePON1温育的细胞；n＝3)有关。使用单向方差分析和Graphpad prism 5软件分析统计数据(FL1通道中FL1-H相对FITC荧光强度(高度))。
图7A-7B示出了溶血-DGTS-rePON1相互作用对J774A.1巨噬细胞中低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞形成的影响。将RePON1(50μg/ml)、具有溶血-DGTS(50或100μg/ml)的rePON1和溶血-DGTS(50μg/ml)温育2h，添加到细胞中并温育24h，然后将细胞用低密度脂蛋白(ox-LDL)(25μg/ml)再处理24小时。进行油红O染色以分析泡沫细胞的形成，代表性图像示于图7A中。通过乙醇提取定量脂质积累到细胞中的强度，并在514nm处测定吸光度，如图7B所示。#p<0.05与对照(未处理的细胞)有关，*p<0.05和**p<0.01与仅用低密度脂蛋白(ox-LDL)处理的细胞有关。使用单向方差分析和Graphpad prism5软件分析统计数据。数据是来自3个实验的平均值±SD。
图8示出了溶血-DGTS对HDL介导的胆固醇从巨噬细胞中流出的影响。将J774A.1细胞与50μl荧光标记的胆固醇和50μl平衡缓冲液温育16小时。洗涤细胞，并用RPMI缓冲液(培养基)、用2μlDMSO温育的HDL(25μg蛋白)或用溶于DMSO中的终浓度为10、20、50和100μg/ml的2μl溶血-DGTS温育4小时的HDL(25μg蛋白)进一步温育4小时。在激发/发射482/515nm处测定培养基和细胞中的荧光。胆固醇流出表示为细胞引起流出百分比。每个实验分别重复至少三次。*p<0.05，***p<0.0001与对照(与DMSO温育的HDL)有关。n＝3。使用单向方差分析和Graphpad prism 5软件分析统计数据。
图9示出了溶血-DGTS对APOA1介导的胆固醇从巨噬细胞中流出的影响。将J774A.1细胞与用RPMI缓冲液(培养基)、用DMSO或用溶血-DGTS(终浓度为10、20、50和100μg/ml)预温育2小时的APOA1(10μg)温育4小时。在激发/发射482/515nm处测定培养基和细胞中的荧光。胆固醇流出表示为细胞引起流出百分比。每个实验分别重复至少三次。*p＜0.05，***p＜0.0001与对照(用DMSO温育的APOA1；n＝3)有关。单向方差分析和Graphpad prism 5软件进行统计分析。
图10A-10B示出了在黑色96孔板中用/不用各种浓度(1、5、10、25、50、75和100μg/ml)的溶血-DGTS在37℃(10A)或25℃(10B)下温育4小时的HDL(0.03mg/ml)的色氨酸荧光光谱。在激发/发射290/320-340nm下测定荧光。溶血-DGTS提高HDL活性的能力与其对HDL的结合亲和性相关。每个实验分别重复至少三次。
图11A-11D示出了在37℃(11A)和25℃(11B)下溶血-DGTS对HDL的荧光猝灭的Stern-Volmer图；以及在37℃(11C)和25℃(11D)下溶血-DGTS对HDL的荧光猝灭的双对数图。每个实验分别重复至少三次。结果表示为平均值±SD。对于所有线性图，R2>0.99且P<0.0001。
图12示出了与各种浓度(0、10、20、50和100μg/ml)的溶血-DGTS温育的掺入HDL(100μg/ml)的Laurdan的一般极化(Gp)值。使用激发/发射340/400-520nm获得Laurdan的荧光发射光谱。使用以下公式计算Laurdan的Gp值：Gp＝(I435-I490)/(I435+I490)。每个实验分别重复至少三次。*p＜0.05，***p＜0.0001与对照(不含溶血-DGTS的HDL)有关。使用T-test Graphpad Prism5软件分析统计数据。
图13示出了用硝酸还原酶还原培养基后通过DAN测定法检测到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)一氧化氮(NO)的产生。用与DMSO、溶血-DGTS和S1P预温育3小时的HDL(50μg/ml)至终浓度分别为10、20和50μg/ml而刺激HUVEC2小时。然后收集培养基并用硝酸还原酶处理，然后使用DAN测定法进行分析。数据表示为细胞释放的NO浓度(μM)。每个实验分别重复至少三次。*p<0.05，***p<0.0001与对照(不含溶血-DGTS或S1P的HDL)有关。使用单向方差分析和Graphpad prism 5软件分析统计数据。
图14示出了溶血-DGTS对Balb/c小鼠血清PON1内酯酶活性的影响。用正常啮齿动物饮食(“非”组；n＝11)或高脂肪饮食(HFD)喂养Balb/c小鼠，并通过皮下植入的渗透微型泵给予所接受的治疗：1)用DDW+2％Tween 80注射的运载体组(n＝9)；2)用溶血-DGTS注射的溶血-DGTS组(在DDW+2％Tween80中1.43mg/ml；n＝11)。方案结束时，产生血清并用PBS稀释20倍，使用二氢香豆素测定法测定PON1内酯酶活性。使用单向方差分析和Graphpadprism 5软件分析统计数据。#p<0.05与“非”组有关，而p<0.05与运载体组有关。
图15示出了溶血-DGTS对从Balb/c小鼠分离出的HDL的促炎/抗炎性质的影响。用正常啮齿动物饮食(“非”组；n＝11)或HFD喂养Balb/c小鼠，并通过皮下植入的渗透微型泵给予所接受的治疗：1)用DDW+2％Tween 80注射的运载体组(n＝9)；2)用溶血-DGTS注射的溶血-DGTS组(在DDW+2％Tween 80中1.43mg/ml；n＝11)。方案结束时，获得了血清，分离了HDL，并使用无细胞测定法(CFA)确定了其促炎/抗炎性质。在不存在HDL的情况下，将荧光标准化为1.0。添加测试的HDL后，值>1.0表示促炎活性；值<1.0表示抗炎活性。(*p<0.05)。
具体实施方式
根据本发明发现，微藻微拟球藻(Nannochloropsis salina)和拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的提取物含有保护PON1免受氧化并增加其内酯酶和芳基酯酶活性以及抑制LDL和巨噬细胞氧化的活性物质。如特别发现的，微藻微拟球藻(Nannochloropsis salina)和拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的乙醇水(70:30％)提取物以剂量依赖的方式增加了重组PON1(rePON1)的活性，使rePON1的活性稳定并保持至少48小时。
使用LC-MS和NMR方法对所述乙醇水提取物的分析已揭示，包含在所述提取物中的活性物质是溶血-二酰基甘油基三甲基高丝氨酸(溶血-DGTS，当n为2时，本文鉴定为化合物Ia-12，R5为甲基)、甜菜碱脂质衍生物，其在许多藻类、低等植物和真菌的膜中丰富，并且由连接到甘油基-三甲基-高丝氨酸的EPA(C20:5)脂肪酸(C20:5溶血-DGTS脂质)组成。该化合物类似于S1P结构，因为它们都含有疏水性元素(鞘氨醇中的C:15:1(Δ2)和溶血-DGTS中的EPA)和在分子另一侧的极性元素(磷酸与三甲基高丝氨酸)。
Figure BDA0002431486560000071
如上所述，HDL的有益效果部分归因于其由PON1介导的抗氧化性质。根据文献，PON1的水解内酯酶、芳基酯酶和对氧磷酶活性在氧化应激下均失活，流行病学证据证明了低血清PON1内酯酶活性与冠心病和糖尿病的风险增加相关(Mackness等人，2003和2015；Fuhrman等人，2006)。此外，较低的血清芳基酯酶可为处于心血管事件风险的稳定受试者提供增量预后值和临床再分类(Tang等人，2012)。
基于以上所述，PON1活性和/或基因表达的药理和营养调节可以构成改善HDL功能和预防心血管疾病的有用方法(Hernaez等人，2017；Lou-Bonafonte等人，2017)。如前所示，各种内源性和外源性分子(例如营养物质)可以与PON1非共价相互作用并影响其性质(提高或降低其活性/稳定性、防止其游离硫醇氧化、影响其流入细胞并影响胞质甘油三酸酯积累)。脂质(例如磷脂酰胆碱)与PON1相互作用并增加其活性(Atrahimovich等人，2012；Cohen等人，2014)。
如本文所示，溶血-DGTS以剂量和时间依赖的方式增加了rePON1内酯酶和芳基酯酶的活性，使rePON1内酯酶活性稳定并保持至少48小时。此外，在将溶血-DGTS与整个人血清温育后，还观察到PON1内酯酶活性以剂量依赖的方式增加。
蛋白活性可受到影响，并且可通过其与其环境中的小分子的相互作用而改变。为了了解溶血-DGTS影响PON1活性的机制，进行了色氨酸(Trp)荧光猝灭测定以表明溶血-DGTS与rePON1之间可能的相互作用。PON1含有四个色氨酸氨基酸残基，并且色氨酸荧光猝灭测定测量蛋白与溶血-DGTS之间相互作用的亲和性，该亲和性导致PON1 3D结构的改变，并因此导致蛋白色氨酸荧光的改变。如本文所示，溶血-DGTS浓度的增加在25℃和37℃下均以剂量依赖的方式降低了rePON1荧光的强度。
Stern-Volmer图在所报告的溶血-DGTS浓度下未显示出从线性到y轴的任何偏离，并且所获得的Ksv值表明由溶血-DGTS启动的静态淬灭过程，表明rePON1与溶血-DGTS之间的特异性相互作用。结合常数(Ka)和热力学参数计算揭示了结合常数随温度升高而降低(最佳关联似乎在298°K)。所获得的每个rePON1的结合位点数量(n)的值不受温度影响，发现约为1，表明rePON1中存在溶血-DGTS的单个结合位点。计算热力学参数以阐明溶血-DGTS-PON1的相互作用。观察到负ΔG，表明相互作用是自发的，而ΔH和ΔS均为负值，则表明主导力是范德华力(van der Waals)或/和氢键(Sun等人，2010)。
根据荧光分析，对接分析已经表明了溶血酶-DGTS以负结合能与PON1结合，表明以范德华力和氢键力为主的自发相互作用。
磷脂酰胆碱(PC)与PON1的相互作用位点(获自分子对接分析)在α-螺旋H2附近，其与α-螺旋H1一起形成将蛋白结合到HDL表面的疏水性斑块。这种相互作用以其与PC结合为代价中断了PON1与HDL颗粒结合的能力。PC 16:018:2证明了相对于所检查的其它PC与PON1的亲和性最高，并且HDL-PON1与游离PON1之间的比率降低了50％。发现rePON1与溶血-DGTS的相互作用亲和性比与PC 16:0 18:2的亲和性高一倍(Cohen等人，2014)。溶血-DGTS在25℃和37℃的Ka分别为1.052×104(M-1)和2.377×103(M-1)。而PC 16:0 18:2在25℃的Ka为1.68×103(M-1)。如本文所示，溶血-DGTS在与PC 16:0 18:2不同的位点与PON1相互作用，远离H1和H2，因此与PC相反，不影响PON1与HDL的结合。HDL结合-PON1与游离PON1之间的比率没有变化(数据未示出)。
如前所示，PON1通过内吞作用特异性内化到巨噬细胞的细胞质中，因此可以保护这些细胞免受氧化并防止泡沫细胞形成。如进一步所示，磷脂酰胆碱脂质(特别是PC 16:018:2)增强巨噬细胞对PON1的摄取。如本文所示，考虑到PON1保护巨噬细胞免受氧化应激(Rozanberg等人，2003)和斑块甘油三酯损伤(Tavori等人，2011b；2009)并降低巨噬细胞胆固醇生物合成(Rozanberg等人，2003)，溶血-DGTS脂质以剂量依赖的方式显著增加rePON1内化到巨噬细胞中，这可能是巨噬细胞防御的有用机制。
巨噬细胞摄取形成低密度脂蛋白(ox-LDL)的泡沫细胞是动脉粥样硬化的标志。巨噬细胞通过其清除剂受体吸收低密度脂蛋白(ox-LDL)和其它脂质，经历活化，产生细胞因子和活性氧物质(ROS)，并分化为泡沫细胞以形成早期病变阶段。巨噬细胞与低密度脂蛋白(ox-LDL)温育导致细胞中的脂质沉积和泡沫细胞形成。油红染色强度的定量分析表明，单独用溶血-DGTS预温育细胞显著降低了油红染色强度。将细胞与rePON1预温育或将溶血-DGTS与rePON1温育也显着降低了油红染色强度，证实单独的溶血-DGTS和与rePON1温育的溶血-DGTS可以抑制低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞形成。
HDL从包括巨噬细胞在内的细胞中除去胆固醇，这被认为代表了HDL颗粒的主要动脉粥样硬化保护功能。最近通过研究已经确定了胆固醇从巨噬细胞中体外排出与动脉粥样硬化之间的联系，该研究证明了胆固醇从J774小鼠细胞中流出与冠状动脉疾病之间呈负相关。HDL通过清除剂受体B1(SR-BI)和ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)从动脉细胞(包括巨噬细胞性泡沫细胞)中除去多余的胆固醇(Jian等人，1998；Oram等人，2003)。先前的研究已经表明，PON1通过与增加HDL与细胞的结合相关的ABCA1转运蛋白增强了HDL介导的巨噬细胞胆固醇流出(Rosenblat等人，2005)。如本文所证明的，溶血-DGTS增强了HDL介导的巨噬细胞胆固醇流出，并且以剂量依赖的方式显著提高HDL从巨噬细胞中提取胆固醇的能力。
使用体内实验检查溶血-DGTS对PON1活性和临床参数的影响。用高脂肪饮食(HFD)喂养Balb/c小鼠12周，在最后4周期间补充溶血-DGTS。通过皮下植入的渗透微型泵进行溶血-DGT向循环的施用。该技术可确保以所需的浓度和时间连续暴露测试化合物。在治疗期结束时，处死小鼠并分析临床参数。血清内酯酶PON1活性在高脂肪饮食喂养小鼠中显著降低，而溶血-DGTS的施用显著增加血清内酯酶活性至对照(正常饮食喂养小鼠)的水平。不同种族的研究表明，较低PON1活性与2型和1型糖尿病相关(Hatzihidiroglou等人，2016；Jamuna Rani等人，2014；Noack等人，2013；Gupta等人，2011；Juretic等人，2006；Cracium等人，2016)。与未治疗组相比，在用HFD治疗的小鼠组中观察到血清葡萄糖浓度的非显著增加，而其内酯酶PON1活性则显著降低。有趣的是，用溶血-DGTS治疗的组显示血清葡萄糖浓度降低与血清内酯酶活性的增加平行(两者均在统计学上显著)，证明了其值与未治疗组(饲喂正常饮食的小鼠)所示的值相似。这些发现证明了PON1内酯酶活性与血清葡萄糖水平之间的相关性。
总而言之，本文所述的研究证明了溶血-DGTS与rePON1相互作用并以剂量依赖的方式增加其内酯酶和芳基酯酶活性；以剂量依赖的方式增加人血清PON1内酯酶活性；以剂量依赖的方式增强rePON1流入巨噬细胞中；减少由低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脂质沉积；并增加HDL介导的胆固醇流出，因此可以保护巨噬细胞免受氧化并防止泡沫形成。另外，从HFD喂养小鼠和溶血-DGTS治疗小鼠中获得的血清显示内酯酶PON1活性的增加和葡萄糖浓度的降低，事实上，这与常规饮食喂养小鼠的血清相似。这些发现表明了溶血-DGTS具有通过增强PON1活性、改善HDL质量、保护巨噬细胞和防止泡沫细胞形成来降低动脉粥样硬化风险的潜力，并因此可以降低CVD。
因此，在一方面，本发明提供了一种用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的载体和如上所定义的式I化合物(在本文中称为“活性剂”)。
式I化合物可以具有四个亚结构之一，在本文中称为式Ia、Ib、Ic和Id，并如表1所示。式Ia化合物由饱和或不饱和脂肪酸残基组成，该残基通过酯键与甘油基(-O-CH2-CHR4-CH2O-)的一个末端碳原子连接，其中，甘油基的另一个末端碳原子通过醚键与具有季铵的α氨基酸侧链的末端碳原子连接。式Ib化合物具有与Ia化合物相似的结构，其中，甘油基核被末端碳原子中的一个(-NH-CH2-CHR4-CH2O-)上具有氨基的神经酰胺样核代替。因此，这种化合物由饱和或不饱和脂肪酸残基组成，该残基通过酰胺键与神经酰胺样核的末端碳原子连接，其中，神经酰胺样核的另一个末端碳原子通过醚键与具有季铵的α氨基酸侧链的末端碳原子连接。式Ic化合物既不具有甘油基也不具有神经酰胺样核，并且它由饱和或不饱和脂肪酸残基组成，该残基通过酯键与具有季铵的α氨基酸侧链的末端碳原子直接连接。式Id化合物具有与Ic化合物相似的结构，其中，酯键被酰胺键代替，因此，它由饱和或不饱和脂肪酸残基组成，该残基通过酰胺键与具有季铵的α氨基酸侧链的末端碳原子直接连接。本文所述的式Ia、Ib、Ic和Id的特定化合物是本文鉴定为化合物Ia-1至Ia-14、Ib-1至Ib-14、Ic-1至Ic-14以及Id-1至Id-14，并如表2-3中所示。
表1：式Ia、Ib、Ic和Id的一般结构
Figure BDA0002431486560000111
*R1、R3和R4各自如上所定义。
本文所用的术语“烷基”通常是指直链或支链的饱和烃基。术语(C1-C8)烷基表示具有1-8个碳原子的这样的基团，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、2-甲基丙基、正戊基、异戊基、新戊基、2-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、正己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、1,1-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,1,2-三甲基丁基、正辛基、2-甲基庚基、1,1-二甲基己基、1,2-二甲基己基、1,1,2-三甲基戊基等，其中，优选的是(C1-C6)烷基或(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基。术语“(C15-C21)烷基”表示具有15-21个碳原子的这样的基团，即(C15)烷基、(C16)烷基、(C17)烷基、(C18)烷基、(C19)烷基、(C20)烷基或(C21)烷基，其中，优选的是(C15)烷基、(C17)烷基、(C19)烷基和(C21)烷基，更特别地是直链(C15)烷基、直链(C17)烷基、直链(C19)烷基和直链(C21)烷基。
术语“烯基”和“炔基”通常是指分别具有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)键，双键或三键的直链或支链烃基。术语“(C15-C21)烯基”和“(C15-C21)炔基”表示具有15-21个碳原子这样的烃基。这样的烯基的例子包括但不限于具有至少一个双键的(C15)烯基、(C16)烯基、(C17)烯基、(C18)烯基、(C19)烯基、(C20)烯基或(C21)烯基，其中，优选的是(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。这样的炔基的例子包括但不限于具有至少一个三键的(C15)炔基、(C16)炔基、(C17)炔基、(C18)炔基、(C19)炔基、(C20)炔基或(C21)炔基。
术语“亚烷基”通常是指二价的直链或支链烃基。术语“(C1-C8)亚烷基”表示具有1-8个碳原子的这样的二价烃基，并且包括例如亚甲基、乙烯、丙烯、丁烯、2-甲基丙烯、戊烯、2-甲基丁烯、己烯、2-甲基戊烯、3-甲基戊烯、2,3-二甲基丁烯、庚烯、辛烯等。优选的是(C1-C6)亚烷基或(C1-C4)亚烷基，例如亚甲基、乙烯、丙烯或丁烯。
本文所用的术语“氨基酸”是指同时包含季铵官能团和羧酸官能团的有机化合物。本文所用的术语“α氨基酸”表示这样的化合物，其中，季铵直接键合至α碳，其进一步被由任选地被一个或多个羟基取代的烷基组成的侧链取代。特别的这样的α氨基酸是其中侧链是直链(C1-C8)烷基(例如甲基、乙基、正丙基和正丁基，其任选地被一个或多个-OH基团取代)的那些氨基酸。
在某些实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式I化合物，其中，R1是具有一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基。特别这样的实施方式是其中R1是直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基的那些。在更特别的这样的实施方式中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-，并且与其相连的羰基分别形成棕榈酸残基、油酸残基、亚油酸残基、亚麻酸残基、花生四烯酸残基、EPA残基或DHA残基。
在某些实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式I化合物，其中，R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-、-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-，其中，R4是-OH或-O-C(O)-R6。特别这样的实施方式是其中R4是-OH的那些式I化合物。
在某些实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式I化合物，其中，R3是优选在与羧基相连的碳原子上被式-N+(R5)3的基团(即-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-)取代的直链(C1-C8)亚烷基，其任选地被一个或多个-OH基团进一步取代。
在某些实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式I化合物，其中，R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在某些实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式I化合物，其中，R6是具有一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基。特别这样的实施方式是其中R6是直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基的那些式I化合物。在更特别的这样的实施方式中，R6是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-，并且与其相连的羰基分别形成棕榈酸残基、油酸残基、亚油酸残基、亚麻酸残基、花生四烯酸残基、EPA残基或DHA残基。
在某些实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式I化合物，其中，R1是具有一个或多个双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，优选直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基；R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-、-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-；R3是-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代；R4是-OH或-O-C(O)-R6；R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基；并且，R6是具有一个或多个双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，优选直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。在特别这样的实施方式中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-。更特别地，这样的实施方式是那些实施方式，其中(i)R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-，R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-O-和与其相连的羧基分别形成丝氨酸或高丝氨酸残基，其中，氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；(ii)R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-O-和与其相连的羧基分别形成丝氨酸或高丝氨酸残基，其中，氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；(iii)R2是-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-,或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-O-和与其相连的羧基分别形成丝氨酸或高丝氨酸残基，其中，氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；或者(iv)R2是-NH-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-NH-和与其相连的羧基分别形成2,3-二氨基丙酸或2,3-二氨基丁酸残基，其中，与位置2处的碳原子连接的氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在某些特定这样的实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式Ia化合物，其中，(i)R1是CH3-(CH2)14-；R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-1和Ia-2；(ii)R1是CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-；R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-3和Ia-4；(iii)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-；R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-5和Ia-6；(iv)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-；R2为-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-7和Ia-8；(v)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-；R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-9和Ia-10；(vi)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-；R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-11和Ia-12(溶血-DGTS，当n是2，R5是甲基时)；或者(vii)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-；R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ia-13和Ia-14。在所有这些化合物中，R5可以是甲基或乙基(表2)。
在其它具体这样的实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式Ib化合物，其中，(i)R1是CH3-(CH2)14-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-1和Ib-2；(ii)R1是CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-3和Ib-4；(iii)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-5和Ib-6；(iv)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-7和Ib-8；(v)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-9和Ib-10；(vi)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-11和Ib-12；或者(vii)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-；R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ib-13和Ib-14。在所有这些化合物中，R5可以是甲基或乙基(表2)。
表2：本文所述的式Ia和Ib的特定化合物*
Figure BDA0002431486560000161
*其中R5是甲基的化合物在本文中也称为Ia-1(甲基)至Ia-14(甲基)，或Ib-1(甲基)至Ib-14(甲基)；并且其中R5是乙基的化合物在本文中也称为Ia-1(乙基)至Ia-14(乙基)，或Ib-1(乙基)至Ib-14(乙基)。
在其它具体这样的实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式Ic化合物，其中，(i)R1是CH3-(CH2)14-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；本文分别鉴定为化合物Ic-1和Ic-2；(ii)R1是CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ic-3和Ic-4；(iii)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ic-5和Ic-6；(iv)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ic-7和Ic-8；(v)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ic-9和Ic-10；(vi)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ic-11和Ic-12；或者(vii)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-；R2是-O-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Ic-13和Ic-14。在所有这些化合物中，R5可以是甲基或乙基(表3)。
在其它具体这样的实施方式中，包含在本发明的药物组合物中的活性剂是式Id化合物，其中，(i)R1是CH3-(CH2)14-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；本文分别鉴定为化合物Id-1和Id-2；(ii)R1是CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Id-3和Id-4；(iii)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Id-5和Id-6；(iv)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Id-7和Id-8；(v)R1是CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Id-9和Id-10；(vi)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Id-11和Id-12；或者(vii)R1是CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-；R2是-NH-；并且R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，本文分别鉴定为化合物Id-13和Id-14。在所有这些化合物中，R5可以是甲基或乙基(表3)。
表3：本文所述的式Ic和Id的特定化合物*
Figure BDA0002431486560000181
*其中R5是甲基的化合物在本文中也称为Ic-1(甲基)至Ic-14(甲基)，或Id-1(甲基)至Id-14(甲基)；并且其中R5是乙基的化合物在本文中也称为Ic-1(乙基)至Ic-14(乙基)，或Id-1(乙基)至Id-14(乙基)。
式I化合物可以根据本领域已知的任何技术或方法合成，例如，如实施例部分中所述和下文方案1-4中所述。
本发明的药物组合物可以以各种制剂提供，例如以药学上可接受的形式和/或以盐或溶剂化物的形式，以及以各种剂量提供。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包含式I化合物与无毒的药学上可接受的阴离子的盐。药学上可接受的阴离子包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、硫酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐(esylate)、甲苯磺酸盐、苯甲酸盐、乙酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐。如果需要，多种药学上可接受的阴离子可以用于单一制剂中。
式I化合物的药学上可接受的盐可以通过常规方法形成，例如通过使游离碱形式的活性剂与一个或多个当量的合适的酸在不溶于该盐的溶剂或介质，或在真空或冷冻干燥除去的溶剂(例如水)中反应，或通过将现有盐的阴离子交换为合适的离子交换树脂上的另一种阴离子。
本发明提供的药物组合物可以通过常规技术制备，例如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy,19th Ed.,1995中所述。可以例如通过均匀和紧密地使活性剂(即式I化合物)与液体载体、细分的固体载体或两者结合，然后如果需要，将产物成型为所需制剂来制备组合物。该组合物可以是液体、固体或半固体形式，并且可以进一步包括药学上可接受的填充剂、载体、稀释剂或佐剂以及其它惰性成分和赋形剂。在一个实施方式中，本发明的药物组合物被配制成纳米颗粒。
可以将组合物配制成用于任何合适的施用途径，包括口服、直肠、鼻、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、胸膜内、气管内、皮下、经皮、皮内、阴道和局部施用以及用于吸入。该组合物的确切剂量和施用方案将由医师认为合适的方法确定，并取决于要达到的治疗效果，并且可以随特别的配方、施用途径以及组合物所要施用的个体受试者的年龄和状况而变化。
对于肠胃外施用，本发明的药物组合物可以是无菌注射水性或油性悬浮液的形式，其可以根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂或悬浮剂被配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可以利用的可接受的运载体和溶剂包括但不限于水、林格溶液、聚乙二醇(PEG)、2-羟丙基-β-环糊精(HPCD)、Tween-80和等渗氯化钠溶液。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器(例如密封的小瓶和安瓿)中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前仅需要加入无菌液体载体(例如水)。
对于经皮施用，例如可以考虑凝胶、贴剂或喷雾剂。
当配制用于吸入时，根据本发明的药物组合物可以利用本领域已知的任何合适的装置施用，例如计量吸入器、液体雾化器、干粉吸入器、喷雾器、热蒸发器、电动流体雾化器等。
当配制用于非肠胃外施用以外的施用途径时，根据本发明的药物组合物可以是适合口服使用的形式，例如片剂、含片、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。
旨在用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且可以进一步包含选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂中的一种或多种试剂以提供药学上优雅且可口的制剂。片剂含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性剂，该赋形剂适合于片剂制造。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶；润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的或利用已知技术包衣的片剂以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供持续的作用。例如，可以利用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可以使用美国专利号4,256,108、4,166,452和4,265,874中所述的技术包衣这些片剂以形成用于控制释放的渗透治疗片剂。本发明的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。
可以配制本发明的药物组合物以控制释放活性剂。可以将这样的组合物配制成控释基质，例如配制成控释基质片剂，其中，通过在与溶解液(体外)或胃肠液(体内)接触的亲水性聚合物溶胀后所形成的凝胶的主动扩散来控制可溶性活性剂的释放。许多聚合物已被描述为能够形成这样的凝胶，例如纤维素的衍生物，特别是纤维素醚，例如羟丙基纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素或甲基羟丙基纤维素，在这些醚的不同商业等级中有显示出相当高粘度的那些醚。在其它构型中，该组合物包含配制成以微胶囊剂型控释的活性剂，其中，活性剂的小液滴被涂层或膜包围以形成在几微米至几毫米范围内的颗粒。
另一种预期的制剂是基于可生物降解的聚合物的贮库系统，其中，随着聚合物降解，活性剂被缓慢释放。最常见的可生物降解的聚合物类别是由乳酸、乙醇酸或这两种分子的组合制备的水解不稳定的聚酯。由这些单独的单体制备的聚合物包括聚(D，L-丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)共聚物。
另一方面，本发明涉及一种用于抑制/治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的如上实施方式中的任意一个所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。特别这样的化合物是本文具体所述的那些化合物，即本文鉴定为化合物Ia-1至Ia-14、Ib-1至Ib-14、Ic-1至Ic-14以及Id-1至Id-14(在每种情况下，R5可以是甲基或乙基)。
另一方面，本发明涉及如上实施方式中的任意一个所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物中的用途。特别这样的化合物是本文具体所述的那些化合物，即本文鉴定为化合物Ia-1至Ia-14、Ib-1至Ib-14、Ic-1至Ic-14以及Id-1至Id-14(在每种情况下，R5可以是甲基或乙基)。
在另一方面，本发明涉及一种用于在有需要的受试者中治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，该方法包含向所述受试者施用治疗有效量的如上实施方式中的任意一个所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。特别这样的化合物是本文具体所述的那些化合物，即本文鉴定为化合物Ia-1至Ia-14、Ib-1至Ib-14、Ic-1至Ic-14以及Id-1至Id-14(在每种情况下，R5可以是甲基或乙基)。
本文所用的术语“治疗”是指施用治疗量的活性剂(即本文所定义的式I化合物)，其有效改善与所治疗的医学病症(即动脉粥样硬化性心血管疾病)相关的不期望的症状；在这些症状出现之前预防其表现；减缓所述医学病症的进展；减缓症状的恶化；增强缓解期的开始；减缓在所述医学病症的进行性慢性阶段中引起的不可逆损伤；延迟所述进行性阶段的发作；减轻所述医学病症的严重性或治愈所述医学病症；提高生存率或更快速恢复；和/或预防所述医学病症发生。
本文所用的术语“有效量”是指将引起所寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的活性剂的量。该量必须有效实现如上所述的所需治疗效果，这尤其取决于待治疗的医学病症的类型和严重程度以及治疗方案。有效量通常在适当设计的临床试验(剂量范围研究)中确定，并且本领域技术人员将知道如何适当地进行这样的试验以确定有效量。如通常所知，有效量取决于多种因素，包括活性剂在体内的分布谱，多种药理学参数(例如体内半衰期、不期望的副作用(如果有的话))，如年龄和性别等因素。
本文所用的术语“受试者”是指任何哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、马、雪貂、狗、猫、牛和山羊。在一个优选实施方式中，术语“受试者”表示人，即个体。
在另一方面，本发明提供一种如上实施方式中任一个所定义的式I化合物，但不包括其中R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-的化合物，即其中R2是-NH-CH2-CHR4-CH2-O-的式Ib化合物；其中R2是-O-的式Ic化合物；或者其中R2是-NH-的式Id化合物。
在某些实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，R1是具有一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基。特别这样的实施方式是其中R1是直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基的那些式I化合物。在更特别的这样的实施方式中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-，并且与其相连的羰基分别形成棕榈酸残基、油酸残基、亚油酸残基、亚麻酸残基、花生四烯酸残基、EPA残基或DHA残基。
在某些实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，R2是-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-，其中，R4是-OH。
在其它实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，R2是-NH-CH2-CHR4-CH2-O-，其中，R4是-O-C(O)-R6或-NH-C(O)-R6。在特别这样的实施方式中，R6是具有一个或多个双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，例如直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。在更特别的这样的实施方式中，R6是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-，并且与其相连的羰基分别形成棕榈酸残基、油酸残基、亚油酸残基、亚麻酸残基、花生四烯酸残基、EPA残基或DHA残基。
在某些实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，R3是优选在与羧基相连的碳原子上用式-N+(R5)3的基团(即-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-)取代的直链(C1-C8)亚烷基，其任选地被一个或多个-OH基团进一步取代。
在某些实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在某些实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，(i)R1是具有一个或多个双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，优选直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基；(ii)R2是-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-，其中，R4是-OH；(iii)R3是-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代；和(iv)R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在特别这样的实施方式中，本发明的化合物是式I化合物，其中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-。更特别的这样的实施方式是那些实施方式，其中(i)R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-，R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-O-和与其相连的羧基分别形成丝氨酸或高丝氨酸残基，其中，氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；(ii)R2是-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-O-和与其相连的羧基分别形成丝氨酸或高丝氨酸残基，其中，氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；或者(iii)R2是-NH-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-，与-NH-和与其相连的羧基分别形成2,3-二氨基丙酸或2,3-二氨基丁酸残基，其中，与位置2处的碳原子连接的氨基被铵阳离子替代；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在具体这样的实施方式中，本发明的化合物是式Ib、Ic或Id化合物，其选自本文鉴定为化合物Ib-1至Ib-14、Ic-1至Ic-14和Id-1至Id-14(在每种情况下，R5可以是甲基或乙基)。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上实施方式中的任意一个所定义的式I化合物(但不包括其中R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-的化合物)或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及药学上可接受的载体。特别这样的化合物是本文具体所述的那些化合物，即本文鉴定为化合物Ib-1至Ib-14、Ic-1至Ic-14以及Id-1至Id-14(在每种情况下，R5可以是甲基或乙基)。
现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例
材料和方法
材料
通过直接进化在大肠杆菌中产生的重组PON1(rePON1)购自以色列雷霍夫特魏兹曼科学研究所(Weizmann Institute of Science,Rehovot,Israel)。鼠巨噬细胞J774A.1细胞购自美国组织培养物保藏中心(ATCC，马里兰州洛克维尔(Rockville,MD))。青霉素、链霉素、谷氨酰胺、制霉菌素、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶和XTT细胞增殖测定试剂盒购自Biological Industries(以色列贝特海梅克(Bet-Haemek，Israel))。其它缓冲液、溶剂和试剂购自Sigma-Aldrich。人血清购自Industries bioologic(以色列贝特海梅克(Bet-Haemek，Israel))。
以色列Seambiotic公司提供了以微拟球藻属微藻为原料的冻干粉末形式。从微拟球藻属微藻中分离溶血-DGTS。
溶血-DGTS对rePON1活性的影响
用rePON1温育溶血-DGTS。向200μl Tris-HCl缓冲液(pH＝8.4)中的rePON1溶液(5μg/ml)中添加1μl溶解于二甲亚砜(DMSO)中的溶血-DGTS至终浓度为1、5、10、50和100μg/ml。将1μl DMSO添加到对照rePON1溶液中。将混合物在37℃下温育2、4、24或48小时。
内酯酶活性。取10μl的每种溶液到UV 96孔微板中，该微板含有90μl Tris-HCL缓冲液(pH＝8.4)，每孔中含有1mM CaCl2(活性缓冲液)。然后添加100μl 2mM二氢香豆素的活性缓冲液(由100mM二氢香豆素DMSO储备液制备)。使用SpectraMax M2读数器，在270nm处测定二氢香豆素水解速率，一次在25秒内，持续15分钟。从总水解速率中减去二氢香豆素的非酶水解。一个单位的内酯酶活性等于1μmol二氢香豆素/分钟的水解。
酯酶活性。取10μl的每种溶液到UV 96孔微板中，该微板含有90μl Tris-HCL缓冲液(pH＝8.4)，含有1mM CaCl2(活性缓冲液)。然后添加100μl 2mM乙酸苯酯的活性缓冲液(由100mM乙酸苯酯DMSO储备液制备)。使用SpectraMax M2读数器，在270nm处测定乙酸苯酯水解速率，一次在25秒内，持续15分钟。一个单位的酯酶活性等于1μmol乙酸苯酯/分钟的水解。内酯酶和酯酶单位活性通过以下方程式计算：
单位＝斜率(mOD/分钟)×5(每毫升)×666.7(稀释)/700
人血清PON1内酯酶活性
200μl用磷酸盐缓冲盐水稀释20倍的人血清与各种浓度(0、1、5、10和50μg/ml)的溶血-DGTS在37℃下温育4小时。然后，使用二氢香豆素测定法取10μl测定内酯酶活性。
色氨酸荧光猝灭测定
向黑色96孔板中的200μl rePON1(50μg/ml＝1.16μM)溶液中添加各种浓度(0、1、5、10、25、50、75和100μg/ml)的溶血-DGTS。将溶液在25℃或37℃下温育2小时。用InfiniteM200 PRO荧光分光光度计(Tecan)进行荧光测定，在290nm的激发波长处记录320-450nm的发射光谱。
分子对接
从蛋白数据库(PDB)中检索PON1的晶体结构。通过AutoDock工具(ADT)程序(一种允许用户从图形用户界面与AutoDock4.2交互作用的辅助程序)制备用于对接的酶。从PDB文件蛋白中除去水分子。添加极性氢原子并分配科尔曼(Kollman)联合原子电荷。通过Addsol程序(ADT程序的一部分)添加溶剂化参数，并将网格点设置为90、90、90；间距值等于0.375；网格中心为X-10.4，Y-11.794，Z+30.00。用AutoDock 4.2遗传算法(GA)进行配体对接。
HDL和LDL分离
通过不连续密度梯度超速离心从人血浆样品中分离HDL和LDL，并对含有乙二胺四乙酸钠(EDTA；1mmol/L)的盐水透析以保护脂蛋白免受氧化。在产生实验之前，将LDL和HDL透析两次，每次1小时，并且在4℃下用PBS再次过夜以除去EDTA。
RePON1流入到J774A.1巨噬细胞中
使rePON1(2mg/ml)与异硫氰酸荧光素(FITC)(200μg/ml)在硼酸盐缓冲液(PH＝8.6)中在37℃下在黑暗中反应1小时。添加10mM的甘氨酸，并使用PBS缓冲液透析溶液以除去多余的FITC。将RePON1-FITC缀合物(50μg/ml)与不同浓度(10、20、50和100μg/ml)的溶血-DGTS温育到RPMI中2小时。将该溶液添加到J774A.1巨噬细胞中并温育16小时。用无菌PBS缓冲液(0.1％叠氮化钠、0.2％牛血清白蛋白(BSA))洗涤细胞三次，在PBS(缓冲液)中收获，并通过荧光激活细胞分选(FACS)(Facscalibur 4ca)分析。结果表示为平均荧光强度(MFI)。
低密度脂蛋白(OxLDL)诱导的泡沫细胞形成
J774A.1巨噬细胞在细胞培养瓶中含有10％FBS的RPMI1640培养基中生长至约90％汇合(含有5％CO2的37℃培养箱)。将细胞在无菌条件下于37℃温育过夜，在96孔板中大约1×105个J774.1细胞/孔。巨噬细胞与溶血-DGTS(50和100μg/ml)、rePON1(50μg/ml)或用不同浓度的溶血-DGTS(10、20、50和100μg/ml)预温育的rePON1再温育24小时。洗涤细胞，并再添加低密度脂蛋白(ox-LDL)(在RPMI培养基中25μg/ml)24小时以得到泡沫细胞。用PBS洗涤细胞3次，然后用4％甲醛固定10分钟，用油红O(0.35mg/100ml，60％异丙醇；Sigma-Aldrich)在37℃将细胞染色15分钟以评估巨噬细胞来源的泡沫细胞中脂质的特征性积累。在显微镜下观察到泡沫细胞的形成。
染色后通过乙醇萃取来评估脂质含量的密度。使用微板读数器(Infinite M200PRO荧光分光光度计(Tecan))测定514nm处的吸光度。
HDL胆固醇流出
使用Biovision的胆固醇流出荧光测定试剂盒(基于细胞)来测定溶血-DGTS对HDL胆固醇流出的影响。
J774.1巨噬细胞在细胞培养瓶中含有10％FBS的RPMI1640培养基中生长至约90％汇合(含有5％CO2的37℃培养箱)。使用基本细胞培养技术在无菌条件下将细胞分裂，并使用100μl培养基/孔在96孔板(底部透明的白色板)中将细胞平铺至大约1×105个细胞/孔。2小时后，将细胞附着在板上，用RPMI 1640培养基洗涤(不添加血清)，并用试剂盒提供的50μl标记试剂和50μl平衡缓冲液标记16小时。将100μl平衡缓冲液单独添加到背景对照中以测定背景荧光。用培养基洗涤细胞，并用100μl含有HDL(25μg蛋白)的RPMI 1640培养基再处理4-6小时，HDL已用各种浓度(0、10、20、50和100μg/ml)的溶血-DGTS预温育4小时。向阴性对照仅添加RPMI 1640培养基。
测定上清液的荧光(激发/发射＝482/515nm)。添加100μl细胞裂解缓冲液使细胞增溶，在室温下在平板振荡器上振荡30分钟，并还测定了其荧光。
通过将培养基的荧光强度除以相同处理和培养基的细胞裂解物的总荧光强度来计算处理的胆固醇流出。
使用Balb/小鼠的体内实验
八周龄Balb/c小鼠用正常啮齿动物饮食喂养12周(“非”组n＝11)或用高脂肪饮食(HFD)喂养8周。8周后，HFD组被分成两组，两组均通过皮下植入的渗透微型泵进行治疗：(1)运载体组(泵含有100μl DDW+2％Tween 80；n＝9)；(2)溶血-DGTS组(泵含有100μl 1.4mg/ml溶血-DGTS的DDW+2％Tween 80；n＝11)。然后，小鼠继续用相同的饮食另外4周。泵每天注入3.5μl溶液，持续28天，直到实验结束。抽血并以2000rpm离心5分钟，将血清保存在-70℃直至分析。测定了临床参数。使用二氢香豆素测定法测定用PBS稀释20倍的血清和PON1内酯酶活性。
实施例1.溶血-DGTS对rePON1内酯酶和酯酶活性的影响
检查了溶血-DGTS对rePON1的内酯酶和芳基酯酶活性的影响。将rePON1(5μg/ml的Tris缓冲液，pH＝8.4)与不同浓度的溶血-DGTS在37℃下温育2、4、24和48小时，并使用二氢香豆素和乙酸苯酯测定法分别测定其内酯酶和芳酯酶活性。
rePON1与溶血-DGTS的温育以剂量依赖的方式增加了酶内酯酶活性。温育2小时后，酶活性分别从无溶血-DGTS时的3.00单位显著改变为1、5、10、50和100μg/ml溶血-DGTS时的4.05、5.73、8.10、11.61和12.7单位(图1A)。
缓冲溶液中rePON1的内酯酶活性随时间降低，48小时后消失，而溶血-DGTS的存在稳定并保持了蛋白内酯酶活性至少48小时。1、5、10、50和100μg/ml的溶血-DGTS在温育48小时后分别将rePON1内酯酶活性保持9％、33％、49％、69％和66％(图1A)。
当监测芳基酯酶活性时，在用/不用溶血-DGTS与rePON1温育时观察到相似的效果。然而，与内酯酶活性相反，酶的芳基酯酶活性在4小时后(图1B)以及在24小时的温育后(数据未显示)保持稳定。
实施例2.溶血-DGTS对人血清PON1内酯酶活性的影响
检查了溶血-DGTS对人血清PON1内酯酶活性的影响。用PBS缓冲液将人血清稀释20倍，并用1、5、10和50μg/ml浓度的溶血-DGTS和不用1、5、10和50μg/ml浓度的溶血-DGTS在37℃下温育4小时。使用二氢香豆素测定法测定酶的内酯酶活性。如实施例1所示，溶血-DGTS以剂量依赖的方式将人血清内酯酶活性提高到10μg/ml，从无溶血-DGTS时的1.8单位分别提高到1、5、10和50μg/ml溶血-DGTS时的2.16、2.82、3.01和2.80单位。在1μg/ml溶血-DGTS时的变化在统计学上不显著(图2)。
实施例3.使用色氨酸荧光猝灭方法的rePON1-溶血-DGTS相互作用
溶血-DGTS对rePON1的影响可由脂质和酶之间的特异性相互作用产生，该特异性相互作用使用色氨酸荧光猝灭方法进行研究。图3示出了在各种浓度的溶血-DGTS存在下，rePON1在25℃(图3A)和37℃(图3B)下的发射光谱，在300-450nm范围内，激发波长为290nm。溶血-DGTS在两个温度下以剂量依赖的方式猝灭rePON1的荧光。
淬灭路径可以用Stern-Volmer方程式(方程式1)描述：
方程式1
Figure BDA0002431486560000281
其中，F0和F分别是在不存在和存在淬灭剂(溶血-DGTS)的情况下的荧光强度，Ksv是Stern-Volmer淬灭常数，[Q]是淬灭剂浓度(μM)。
Stern-Volmer曲线(F0/F相对于[Q])在两个温度下在溶血-DGTS的测试浓度下都是线性的(R2＞0.99，p＜0.0001)。25℃(图4B)和37℃(图4A)的Ksv值分别为(1.18±0.13)×10+4M-1和(0.93±0.03)×10+4M-1。该Ksv值表明淬灭是通过在淬灭剂和rePON1之间形成复合物而引发的(Atrahimovich等人，2012)。
使用(方程式2)计算结合常数和结合位点：
方程式2
Figure BDA0002431486560000291
其中，Ka是结合常数，反映了rePON1与溶血-DGTS之间的相互作用程度，n是结合位点的数量，其指定了与rePON1结合的溶血-DGTS分子的数量。在25℃下获得溶血-DGTS与rePON1结合的最高Ka值(1.052×104M-1；图4D)，在37℃下获得较低的Ka值(2.377×103M-1；图4C)。所获得的n值不受温度影响，并且等于约1(表4)。
计算热力学参数：焓(ΔH)、熵(ΔS)和自由能(ΔG)以表征rePON1-溶血-DGTS相互作用的类型。表4示出了ΔG以及ΔH和ΔS的负值。
表4：溶血-DGTS-rePON1相互作用的结合常数(Ka)、结合位点数量(n)和热力学参数
Figure BDA0002431486560000292
实施例4.rePON1-溶血-DGTS相互作用的分子模型计算
进行了溶血-DGTS在rePON1的潜在结合凹槽位点的对接分析以预测溶血-DGTS结合位点在完整rePON1晶体结构中的位置，并将建模预测与色氨酸猝灭荧光结果进行比较。计算的结合能为约-2kcal/mol，表明了溶血-DGTS和rePON1之间的自发相互作用。根据对接分析，发现结合位点的主导力是范德华力和氢键。这些结果与色氨酸荧光结果一致。
图5A示出了溶血-DGTS的脂肪酸亚结构定向于凹槽的疏水性部分(蓝色)，而甘油基-甲基化高丝氨酸亚结构定向于具有氢键相互作用的亲水性部分。
在具有ser193(距离
Figure BDA0002431486560000301
)和lys192(距离
Figure BDA0002431486560000304
)的溶血-DGTS的羧基氧、具有tyr294(距离
Figure BDA0002431486560000302
)的胺基的溶血-DGTS的脂肪酸的羰基和具有Phe292(距离
Figure BDA0002431486560000303
)的溶血-DGTS的羟基之间可观察到氢键。
实施例5.溶血-DGTS对rePON1流入巨噬细胞中的影响
如前所示，PON1与巨噬细胞特异性相互作用并内化到细胞的细胞质中(Efrat等人，2008)，因此可以保护巨噬细胞免受氧化并防止泡沫细胞形成。溶血-DGTS对rePON1流入巨噬细胞中的影响如本文所示。
用FITC标记RePON1并与不同浓度(10、20、50和100μg/ml)的溶血-DGTS温育2小时。将每种溶液添加到J774A.1巨噬细胞中并在37℃下温育16小时，然后通过荧光激活细胞分选(FACS)分析。图6A示出了溶血DGTS以剂量依赖的方式显著增加了rePON1内化到巨噬细胞中。MFI从单独的rePON1-FITS的61.62增加到分别用10、20、50和100μg/ml的溶血-DGTS温育的rePON1的131.02、368.61、386.46和517.45(图6B)。
实施例6.溶血-DGTS-rePON1相互作用对J774A.1巨噬细胞中低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞形成的影响
巨噬细胞摄取形成低密度脂蛋白(ox-LDL)的泡沫细胞是动脉粥样硬化的标志。检查了溶血-DGTS或与用溶血-DGTS温育的rePON1减弱泡沫细胞形成的能力。将J774A.1巨噬细胞与rePON1(50μg/ml)、用溶血-DGTS(50和100μg/ml)预温育的rePON1或单独的溶血-DGTS(50μg/ml)温育，然后洗涤并与低密度脂蛋白(ox-LDL)(25μg/ml)温育24小时。
细胞与低密度脂蛋白(ox-LDL)温育导致巨噬细胞中的脂质沉积和泡沫细胞形成(图7A)。油红染色强度的定量分析表明，单独用溶血-DGTS预温育的巨噬细胞显著降低了32％的油红染色强度。而细胞与rePON1、用50和100μg/ml溶血-DGTS分别温育的rePON1的预温育分别降低了49％、45％和60％的油红强度。结果证实了溶血-DGTS抑制低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞形成的能力。而且，rePON1抑制低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞形成，而酶与100μg/ml溶血-DGTS温育使其抑制泡沫细胞形成的能力增强了约10％(不显著)。
实施例7.溶血-DGTS对HDL介导的胆固醇从巨噬细胞中流出的影响
HDL从细胞(包括巨噬细胞)中除去胆固醇。将HDL颗粒与不同浓度的溶血-DGTS温育。使用荧光测定法(基于细胞的胆固醇流出荧光测定试剂盒，由Biovision提供)测定HDL从J774A.1巨噬细胞中流出胆固醇的能力，并表示为胆固醇流出百分比。溶血-DGTS以剂量依赖的方式显著提高了HDL从巨噬细胞中提取胆固醇的能力。在分别与10、20、50和100μg/ml的溶血-DGTS温育后，胆固醇除去率从16.5％(无溶血-DGTS)提高到22.5％、31.5％、36.5％和46.5％(图8)。
实施例8.溶血-DGTS对APOA1介导的胆固醇从巨噬细胞中流出的影响
载脂蛋白A1(APOA1)是主要的结构和功能性HDL蛋白，其大约占总HDL蛋白的70％。已反复证明了APOA1是从细胞释放的胆固醇的特别有效的受体。检查了溶血-DGTS对APOA1介导的胆固醇从巨噬细胞中流出的影响。
将APOA1与不同浓度(0、10、20、50和100μg/ml)的溶血-DGTS温育，并通过荧光测定法(基于细胞的胆固醇流出荧光测定试剂盒)测定其从J774A.1巨噬细胞中除去胆固醇的能力，并表示为胆固醇流出的百分比。图9示出了溶血-DGTS以剂量依赖的方式显著增强了APOA1从巨噬细胞中流出胆固醇，从APOA1+50μg/ml溶血-DGTS(约25％；p<0.05)开始直至100μg/ml溶血-DGTS的最大APOA1流出(约35％；p<0.0001)。
实施例9.使用色氨酸荧光猝灭方法研究HDL-溶血-DGTS和APOA1-溶血-DGTS相互作用
为了测试溶血-DGTS对HDL的保护作用是否通过溶血-DGTS与脂蛋白之间的特异性相互作用而发生，通过色氨酸荧光猝灭方法研究了HDL-溶血-DGTS相互作用。图10示出了在各种浓度的溶血-DGTS存在下HDL在37℃(图10A)和25℃(图10B)下的发射光谱，在300-450nm范围内，激发波长为290nm。溶血-DGTS在两个温度下以剂量依赖的方式猝灭HDL的荧光。
淬灭路径可以用Stern-Volmer方程式(上述方程式1)描述：Stern-Volmer曲线在两个温度下在溶血-DGTS的测试浓度下都是线性的(R>0.99，p<0.0001)。Ksv值在37℃下为(5.59±0.42)×103M-1(图11A)和在25℃下为(4.83±0.59)×103M-1(图11A)，表明淬灭是通过淬灭剂和HDL之间形成复合物而引发的。
使用上述方程式2，如对rePON1所示，计算结合常数和结合位点。在37℃下溶血-DGTS与HDL结合的最高Ka值是2.165×104M-1(图11C)，在25℃下降低为3.78×103M-1(图11D)。所获得的n值不受温度影响，并且等于1(表5)。计算热力学参数：焓(ΔH)、熵(ΔS)和自由能(ΔG)以表征HDL-溶血-DGTS相互作用的类型。表5示出了ΔG的负值，以及ΔH和ΔS的正值，表明疏水性力支持的自发相互作用。
表5：溶血-DGTS-HDL的结合常数(Ka)、结合位点数量(n)和热力学参数
Figure BDA0002431486560000321
色氨酸荧光猝灭方法进一步用于检查溶血-DGTS和APOA1(HDL的主要蛋白成分)之间的相互作用。还计算了Ka和热力学参数(表6)。在37℃下溶血-DGTS与APOA1结合的最高Ka值是2.28×104M-1，在25℃下降低为2.37×103M-1。所获得的n值不受温度影响，并且等于＝1(表6)。
计算热力学参数：焓(ΔH)、熵(ΔS)和自由能(ΔG)以表征APOA1-溶血-DGTS相互作用的类型。表6示出了ΔG的负值，以及ΔH和ΔS的正值，表明疏水性力支持的自发相互作用。溶血-DGTS-APOA1相互作用所获得的参数与溶血-DGTS-HDL相互作用所获得的参数相似，表明溶血-DGTS主要与HDL颗粒中的APOA1相互作用。
表6：溶血-DGTS-APOA1的结合常数(Ka)、结合位点数量(n)和热力学参数
Figure BDA0002431486560000322
实施例10.溶血-DGTS对HDL表面极性的影响
HDL颗粒是主要由被载脂蛋白溶解的极性脂质组成的多分子、准球形或盘状、假胶束复合物。为了确定溶酶-DGTS和HDL脂质核心之间可能的相互作用，使用了拉德丹极化(Laurdan General Polarization，Gp)测定法。测定了与梯度剂量的溶血-DGTS温育的掺入HDL的Laurdan的Gp值，并且如所示，溶血-DGTS以剂量依赖的方式在20、50和100μg/ml时显著降低了HDL Gp值，表明当与溶血-DGTS温育时HDL脂质核心极性增加(图12)。这些结果表明，溶血-DGTS与HDL蛋白质组学和脂质组学相互作用。这种相互作用可能会导致其物理状态和脂质核心极性发生变化，从而影响其功能。
实施例11.溶血-DGTS对HDL诱导内皮型一氧化氮(NO)释放能力的影响
NO是一种可溶性气体，其在内皮细胞中通过组成型钙-钙调蛋白依赖性酶一氧化氮合酶(NOS)由氨基酸L-精氨酸连续合成。该物质具有维持血管稳态的广泛的生物学性质，包括调节血管扩张张力、调节局部细胞生长和保护血管免受血液中循环的血小板和细胞的有害后果，以这种方式在正常内皮功能中起关键作用。检查了溶血-DGTS对HDL诱导内皮NO释放能力的影响，并将结果与1-磷酸鞘氨醇(S1P)进行比较，其是在HDL中鉴定的重要脂质组分，其可以解释HDL的NO介导的血管舒张作用。
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与HDL温育2小时，将所述HDL与不同浓度的溶血-DGTS或S1P预温育3小时，并使用2,3-二氨基萘(DAN)测定法测定NO产生。类似于S1P，溶血-DGTS显著提高了HDL以剂量依赖的方式诱导内皮NO释放的能力(图13)。
实施例12.溶血-DGTS对高脂肪饮食(HFD)喂养的Balb/c小鼠的血清PON1内酯酶活性的影响
使用HFD喂养的Balb/c小鼠检查了溶血-DGTS对内酯酶PON1活性的影响。使用了三组Balb/c小鼠：1)“非”组n＝11只小鼠，其用正常啮齿动物饮食喂养12周；2)“运载体”组n＝9只小鼠，其用HFD喂养8周，然后用相同的饮食继续喂养另外4周，通过皮下植入的渗透微型泵注射DDW+2％Tween；和3)溶血-DGTS组n＝11只小鼠，其类似于运载体组喂养并注射1.43mg/ml溶血-DGTS的DDW+2％Tween 80(图14)。方案结束时，抽血并测定临床参数和内酯酶PON1活性。用HFD喂养小鼠的血液中的体重和胆固醇水平显著高于用正常饮食喂养小鼠的体重和胆固醇水平。HFD将血糖水平从“非”组的6.3±1.6μM增加到“运载体”组的7.15±0.74(统计学上不显著)，而用溶血-DGTS注射小鼠将血糖水平显著降低到5.99±1.4μM(表7)。使用脱氢香豆素测定法测定小鼠血清的内酯酶PON1活性。HFD显着降低小鼠血清内酯酶PON1活性(降低约2个单位)，而用溶血-DGTS注射小鼠将其血清内酯酶PON1活性显著提高(提高约2.3单位)。
表7：体内实验的临床参数
非 运载体 溶血-DGTS
n 12 12 12
BW(方案结束) 27.4±2.1 30.4±1.9<sup>a</sup> 29.8±2.4<sup>a</sup>
ΔBW<sup>*</sup> 4.1±2.0 6.5±2.2a1 5.7±2.18
葡萄糖(μM) 6.3±1.6 7.15±0.74 5.99±1.4<sup>b</sup>
甘油三酯(μM) 0.77±0.40 0.98±0.31 0.84±0.26
胆固醇(μM) 3.66±0.39 4.25±0.62<sup>a</sup> 4.03±0.40
高密度脂蛋白(μM) 3.57±0.52 4.39±1.05 4.37±0.42<sup>a1</sup>
*体重相对于基线的变化(在实验开始时，时间为0)；
ap<0.05与非组有关；
a1p<0.01与非组有关；
bp<0.05与运载体组有关。
实施例13.溶血-DGTS对高脂肪饮食Balb/c小鼠HDL抗炎性质的影响
为了检查溶血-DGTS对HDL体内抗炎作用的效果，每天通过皮下植入的渗透微型泵向HFD喂养小鼠施用3.5μl溶血-DGTS，共28天。如实施例12中所述，将小鼠分为三组：1)用常规饮食喂养12周的小鼠(“非”组；n＝11)；2)从第9周开始用HFD喂养12周并用溶血-DGTS(1.43mg/ml的DDW+2％Tween)注射的小鼠(溶血-DGTS组；n＝11)；和3)用HFD喂养12周并用DDW+2％Tween注射的小鼠(运载体组；n＝9)。如发现的，与从运载体组和非组分离出的HDL(其具有促炎性质)相比，从溶血-DGTS组分离出的HDL示出了显著较低的炎症值(炎症值>1；p<0.05)(图15)，表明溶血-DGTS增强了HFD喂养小鼠的HDL抗炎性质。
实施例14.溶血-DGTS衍生物的制备
在这项研究中，合成了溶血-DGTS衍生物并对其活性进行了测试。
在某些衍生物中，溶血-DGTS的EPA残基被不同脂肪酸的残基替代。由于EPA是一种容易被氧化的多不饱和脂肪酸，因此，所用的替代脂肪酸可以是饱和脂肪酸(例如棕榈酸)，也可以是仅具有一个、两个或三个双键的不饱和脂肪酸(例如分别为油酸、亚油酸和亚麻酸)。方案1示意性地描述了这种溶血-DGTS衍生物的合成。
在其它衍生物中，溶血-DGTS的脂肪酸残基通过酰胺键而不是酯键与甘油基连接。由于酰胺键比酯键更稳定，因此，预期这些化合物比溶血-DGTS更稳定，因此，可以口服施用。然而，应该注意的是，在这些衍生物中，如神经酰胺的情况那样，甘油基核心被神经酰胺样核心替代，该神经酰胺样核心具有替代末端羟基而不是位置2处羟基的氨基。方案2示意性地描述了这种溶血-DGTS衍生物的合成。
在其它衍生物中，脂肪酸残基通过酯键或酰胺键直接连接至具有季铵的α氨基酸侧链的末端碳原子上。方案3和4示意性地描述了这种溶血-DGTS衍生物的合成。
方案1.式Ⅰa化合物的合成
Figure BDA0002431486560000351
方案2.式Ⅰb化合物的合成
Figure BDA0002431486560000361
方案3.式Ic化合物的合成
Figure BDA0002431486560000362
方案4.式Id化合物的合成
Figure BDA0002431486560000363
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Claims (27)

1.一种用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的载体，以及式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
I R1-C(O)-R2-R3-COOH
其中，
R1为(C15-C21)烷基、(C15-C21)烯基或(C15-C21)炔基；
R2为-O-CH2-CHR4-CH2-O-、-NH-CH2-CHR4-CH2-O-、-O-或-NH-；
R3是被式-N+(R5)3的基团取代并且任选地进一步被一个或多个-OH基团取代的(C1-C8)亚烷基；
R4为-OH、-O-C(O)-R6或-NH-C(O)-R6；
R5各自独立地是(C1-C8)烷基；并且
R6是(C15-C21)烷基、(C15-C21)烯基或(C15-C21)炔基。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，R1是(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，R1是直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-、-NH-CH2-CHOH-CH2-O-、-O-或-NH-；并且R4是-OH或-O-C(O)-R6。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，R3是-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，R6是具有一个或多个双键的(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，R6是直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中：
R1是(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，优选直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基；
R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-、-NH-CH2-CHOH-CH2-O-、-O-或-NH-；
R3是-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代；
R4是-OH或-O-C(O)-R6；
R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基；并且
R6是(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，优选直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，
(i)R2是-O-CH2-CHOH-CH2-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；
(ii)R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-、-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；
(iii)R2是-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；或者
(iv)R2是-NH-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其配制用于口服、直肠、鼻、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、胸膜内、气管内、皮下、经皮、皮内、阴道和局部施用或用于吸入。
14.一种根据权利要求1所述的式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其用于抑制/治疗动脉粥样硬化性心血管疾病。
15.根据权利要求1所述的式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物中的用途。
16.一种用于在有需要的受试者中治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的式I化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
17.一种根据权利要求1所述的式I化合物，但其不包括其中R2是-O-CH2-CHR4-CH2-O-的化合物。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中，R1是(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中，R1是直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-。
21.根据权利要求17所述的化合物，其中，R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-、-O-或-NH-。
22.根据权利要求17所述的化合物，其中，R3是-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代。
23.根据权利要求17所述的化合物，其中，R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
24.根据权利要求17所述的化合物，其中：
R1是(C15-C21)烷基或(C15-C21)烯基，优选直链(C15)烷基、(C17)烯基、(C19)烯基或(C21)烯基；
R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-、-O-或-NH-；
R3是-(CH2)1-7-CH(N+(R5)3)-，其任选地进一步被一个或多个-OH基团取代；并且
R5各自独立地是(C1-C4)烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中，R1是CH3-(CH2)14-、CH3-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)2-(CH2)6-、CH3-(CH2-CH＝CH)3-(CH2)7-、CH3-(CH2)4-(CH＝CH-CH2)4-(CH2)2-、CH3-(CH2-CH＝CH)5-(CH2)3-或CH3-(CH2-CH＝CH)6-(CH2)2-。
26.根据权利要求25所述的化合物，其中，
(i)R2是-NH-CH2-CHOH-CH2-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-、-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；
(ii)R2是-O-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基；或者
(iii)R2是-NH-；R3是-CH2-CH(N+(R5)3)-或-(CH2)2-CH(N+(R5)3)-；并且R5各自是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
27.一种包含根据权利要求17-26中任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体。
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