CN111187775A

CN111187775A - 一种水稻湿敏不育基因及其应用与不育系培育方法

Info

Publication number: CN111187775A
Application number: CN201911017446.4A
Authority: CN
Inventors: 周海; 张志国; 陈慧琼; 林健雯; 庄楚雄
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-10-24
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2039-10-24
Also published as: CN111187775B

Abstract

本发明公开了一种水稻湿敏不育基因，其编码的蛋白为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白或其衍生蛋白，该水稻湿敏不育基因调控水稻湿敏不育性状，可用于制备湿敏不育水稻品种，可用于两系杂交水稻育种。本发明还提供了一种水稻不育系培育方法，可以作为两系杂交水稻育种的重要补充。

Description

一种水稻湿敏不育基因及其应用与不育系培育方法

技术领域

本发明涉及基因工程和分子育种领域，具体涉及一种水稻湿敏不育基因及其应用与不育系培育方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要粮食作物之一，大约有一半人口以稻米为主粮。

杂交水稻可以在常规水稻的基础上增产10-20％，大约占中国水稻种植面积一半(Cheng et al.,2007；Su et al.,2012)。杂交技术可以分为传统的三系杂交技术和新一代的两系杂交水稻技术(Chen et al.,2014)。两系杂交水稻还可以比三系杂交水稻增产5-10％(Kim and Zhang,2018)。这是因为两系杂交水稻使用环境敏感型不育系作为不育系和保持系，不需要特异的恢复系，几乎所有正常水稻都可以作为恢复系，配组自由，杂种优势利用效率高；而三系杂交水稻具有特定的细胞质雄性不育系、保持系和恢复系关系，限制了杂种优势的利用(Zhang et al.,1994；Zhang et al.,2013)。正因为此，两系杂交水稻近年来发展迅速，根据中国农业部的统计，当前两系杂交水稻的种植面积大约占杂交水稻种植面积的一半。因此发展两系杂交水稻具有重要意义。

植物是固着生长的生物，需要比动物更能适应环境的变化。环境敏感型不育突变体的育性受环境影响，其本质是相关基因突变后导致植物对环境更加敏感。环境敏感型雄性不育包括光敏不育，温敏不育和湿度敏感型不育等，当前在两系杂交水稻中使用的主要是温敏不育系。在中国，农垦58S是第一个被发现的光敏不育系，开启了两系杂交水稻的育种。培矮64S是由农垦58S转育而来的，早期两系杂交水稻育种中的最重要温敏不育系。

PMS3(LDMAR)是一个长链非编码RNA，控制农垦58S光敏不育(Ding et al.,2012)。培矮64S是由农垦58S转育而来的，早期两系杂交水稻育种中的最重要温敏不育系。我们发现p/tms12-1位点存在一个非编码RNA，并且可以产生一系列phasiRNA，其中osa-smR5864上存在一个点突变，分别在农垦58S中控制光敏不育和在培矮64S中控制温敏不育(Zhou etal.,2012)。PMS1是一个长链非编码RNA，可以产生一系列phasiRNA，控制农垦58S光敏不育(Fan et al.,2016)。CSA编码一个MYB转录因子，可以指导单糖转运子OsMST8的转录，调控水稻反光敏不育(Zhang et al.,2013)。在中国，安农S-1是第一个发现的籼型温敏不育系，其不育性受tms5控制，当前中国95％以上的两系杂交水稻都使用tms5(Zhou et al.,2014；张华丽等,2015)。我们发现TMS5编码一个核酸内切酶RNase ZS1，参与受温度诱导表达的泛素-核糖体融合基因UbL40 mRNA的降解，控制水稻温敏不育(Zhou et al.,2014)。TMS10编码一个受体类激酶，突变后导致温敏不育，并且TMS10和其同源基因TMS10L在低温下功能不冗余(Yu et al.,2017)。OsOSC12/OsPTS1是triterpene synthase，突变后影响脂肪酸合成和导致水稻湿度敏感不育(Xue et al.,2018)。

但是两系杂交水稻使用环境敏感型不育作为不育系和保持系，其育性容易受环境异常变化而发生漂变，导致自交结实而降低杂交种子纯度。因此挖掘新的环境敏感型基因资源，补充到水稻不育系的培育中，有利于提高两系杂交水稻制种的安全性。

发明内容

为了克服现有两系杂交水稻制种不安全性问题，本发明的目的之一在于提供一种水稻湿敏不育基因。该水稻湿敏不育基因所产生的突变体，在水田中种植时不育，但是移栽到人工气候室中育性恢复正常。我们设置了白天湿度分别45％、60％、75％，夜晚湿度统一为75％的条件对开花期的突变体进行处理，其结实率分别是0.0％,7.3％,21.9％,和72.2％。这个结果表明该突变体是一个湿度敏感的不育突变体，于是我们将该突变体暂时命名为湿度敏感的不育1(humidity-sensitive genic sterility 1，hgs1)突变体。

本发明的目的之二在于提供该水稻湿敏不育基因的应用。

本发明的目的之三在于提供水稻湿敏不育系培育方法。

本发明的目的之一通过以下

一种水稻湿敏不育基因，其编码的蛋白为：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的衍生蛋白。

进一步地，该基因的核苷酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种上述的水稻湿敏不育基因在调控水稻湿敏不育性状中的应用。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种水稻不育系培育方法，包括使用基因工程手段操作SEQ ID No.2所示的序列的步骤。

即可以理解为，使用任何手段包括基因编辑如CRISPR/Cas9、人工诱变和RNAi等但不排除其它方法等手段基因工程手段使水稻操作SEQ ID No.2所示的序列培育不育系都被本专利覆盖。

进一步地，所述基因工程手段包括基因编辑、人工诱变和RNAi。

其中，更具体地，利用CRISPR/Cas9培育水稻湿敏不育系的培育方法，包括以下步骤：

1)合成hms1CAS F/R引物对序列；

2)将hms1CAS F/R退火，克隆到sgRNA表达盒；

3)将具有靶序列的sgRNA表达盒扩增并克隆到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体质粒中；

4)使用农杆菌介导的转化方法将步骤3)得到的载体质粒分别转化到水稻中；

5)使用潮霉素磷酸转移酶的扩增鉴定了转基因品系，得到了转基因植株。

其中，hms1CAS F/R引物对可采用如hms1CAS1 F/R和/或hms1CAS2 F/R的引物对，其序列分别如下所示：

hms1CAS1 F：GTTGAAGCTGGGGTACCAGTATC，如SEQ ID No.5所示；

hms1CAS1 R：AAACGATACTGGTACCCCAGCTT，如SEQ ID No.6所示；

hms1CAS2 F：GGCACCGCTCGAGGATCCTGGTC，如SEQ ID No.7所示；

hms1CAS2 R：AAACGACCAGGATCCTCGAGCGG，如SEQ ID No.8所示；

利用RNAi培育水稻湿敏不育系的培育方法，包括以下步骤：

1)合成hms1Ri F/R引物对；

2)使用hms1Ri F/R引物对水稻cDNA进行扩增，得到目的DNA片段，并将其克隆到pYLRNAi载体质粒中；

3)使用农杆菌介导的转化方法将步骤2)得到的载体质粒分别转化到水稻中；

4)使用潮霉素磷酸转移酶的扩增鉴定了转基因品系，得到转基因植株HMS1RI。

进一步地，利用LOC_Os03g12030突变序列特征发展的分子标记辅助育种。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种水稻湿敏不育基因，该基因所编辑表达的蛋白参与脂肪酸的合成和花粉壁的形成，其突变体表现为花粉迅速失水和湿敏不育；相比于当前用于两系杂交水稻育种的温敏不育系，该材料在新疆等干旱地区育性稳定，可以获得高纯度的杂交F₁种子，确保两系杂交水稻生产安全；

本发明提供的水稻湿敏不育基因可以应用于调控水稻湿敏不育性状，可作为两系杂交水稻中的环境敏感型不育系和保持系，有利于提高两系杂交水稻制种的安全性。

LOC_Os03g12030基因是该稻湿敏不育基因的环境敏感型基础，可采用包括基因编辑、RNAi和分子标记辅助等手段进行辅助育种，以得到湿敏不育系培育方法。

附图说明

图1为hms1突变体的表型；

图2为hms1基因定位和克隆图；

图3为田间种植的hms1突变体及功能互补的hms1(hms1FC)突变体的整株形态、结实率和花粉粒；

图4为田间种植的ZH11及RNAi培育的hms1突变体的整株形态、结实率和花粉粒；

图5为利用CRISPR/Cas9培育两系湿敏不育系的整株形态、结实率和花粉粒。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

本申请公开一种水稻湿敏不育基因，该基团编码的蛋白：

为1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

该水稻湿敏不育基因控制水稻在低湿下的不育症状，表现为花粉壁功能的缺失。

将该水稻湿敏不育基因所对应的突变体命名为hms1突变体。

该水稻湿敏不育基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该水稻湿敏不育基因所对应的hms1突变体野生型编码区如SEQ ID No.3所示，所对应的野生型蛋白如SEQID No.4所示。

以下具体实施，所有的水稻均重种植于华南农业大学田间或人工气候室。田间种植的条件为温度24-35℃,相对湿度50-90％。人工气候室的光照时长为11h或13h，平均温度24-35℃，白天相对湿度分别为45％、55％、60％和75％；夜间相对温度为75％。

本发明还提供水稻湿敏不育系的培育方法，包括使用基因工程手段操作SEQ IDNo.2所示的序列的步骤。即通过使用基因工程手段，使正常水稻中的水稻湿敏不育基因功能丧失，从而培育湿敏雄性不育系。

实施例1：hms1突变体的分离和表型分析

我们在组织培养的粳稻品种中花11(ZH11)(Oryza sativa L.ssp.japonica)水稻再生系中，分离到一个雄性不育突变体，暂命名为hms1突变体。

该hms1突变体在自然条件下(24-35℃,相对湿度50-90％)种植时的自交结实率极低，且不同穗子的结实率相差较大，该突变体的结实率与ZH11相比显着降低(hms1突变体仅10％)，如图1所示，图1a为在中国广州(50-90％RH)的稻田中生长的中花11号(ZH11)和hms1突变体的全株形态，图1b为在稻田中生长的ZH11和hms1植物的结实。

该hms1突变体和ZH11在人工气候室中，不同温度和不同湿度下的表型生长对比图如图1c和1d所示，图1c为在人工气候箱(相对湿度为75％)中生长的ZH11和hms1植物的全株形态。图1d为在人工气候箱中生长的ZH11和hms1植物的结实。图1e为ZH11的结实。图1f-1i分别为45％(1f)，55％(1g)，60％(1h)和75％(1i)相对湿度下的结实。图1j在不同湿度下ZH11和hms1植物的结实率。注：比例尺为20厘米(图1a，图1c)和5厘米(图1b，图1d–i)。误差线表示SD(n＝5)。

以上表型观察表明，该hms1突变体的结实率受种植环境的影响。

实施例2：基因定位和基因克隆

ZH11与hms1突变体杂交产生的F₂群体的遗传分析表明，野生型和hms1表型的分离比为3：1(161：635，X2＝0.17；0.70>P>0.50；n＝1)，表明hms1由单个隐性基因控制。

为了克隆hms1基因，从hms1突变体与水稻品种02428或安农N的杂交中产生了两个F₂群体。根据连锁分析和基于图的克隆，结果如图2所示。

其中，图2a为hms1在3号染色体上的精细定位。记录了分子标记处的重组体数量。hms1区位于BAC克隆OSJNBa0024O21分子标记306291和306336之间45kb的间隔内。使用水稻基因组注释项目数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，在该区域预测了七个开放阅读框，并且LOC_Os03g12030被鉴定为该区域中的候选基因；

序列分析显示，在hms1突变体的LOC_Os03g12030的编码区域中插入了8bp(TGCTGGAG)，这导致移码和翻译的过早终止，如SEQ ID No.2所示。LOC_Os03g12030编码一个β-酮酰基-CoA合酶(KCS)，该酶催化两个碳原子缩合成一个酰基辅酶A，这是VLCFA延长的第一步(Haslam&Kunst，2013)。

基因定位中使用的分子标记以及利用LOC_Os03g12030突变序列特征发展的分子标记可以用于分子标记辅助育种。

实施例3：功能互补验证

为验证LOC_Os03g12030的破坏导致hms1中的湿敏不育(HGMS)表型，通过将野生型LOC_Os03g12030的4176bp基因组片段引入hms1突变体进行了功能互补实验。

使用hms1FC F/R引物对从ZH11基因组DNA扩增了具有4176bp野生型基因组DNA，其序列如SEQ ID No.9所示；并通过HindⅢ和BglⅡ酶切载入pCAMBIA1380载体质粒；

hms1FC F：AAAAAAGCTTTGCAGCCAAAGGACCACACT；

hms1FC R：AAAAAGATCTGAGTACGCAGTTGTAATCAGG；

使用农杆菌介导的转化方法将上述载体质粒分别转化到水稻中，使用潮霉素磷酸转移酶的扩增鉴定了转基因植物，获得了hms1FC1植株和hms1FC2植株。

田间种植的ZH11的hms1突变体及hms1的功能互补植株(hms1FC)的整株形态、结实率和花粉粒如图3所示，hms1FC1植株和hms1FC2植株都表现出与ZH11相当的被恢复的结实率，如图3b和图3d所示。图3b-d为低湿度下hms1和功能互补hms1(hms1FC)植物的全株形态(3b)、结实率(3c)和花粉粒(3d)。

实施例4：利用RNAi培育水稻湿敏不育系的培育方法，包括以下步骤：

1)合成hms1Ri F/R引物对；

hms1Ri F：AAAAAAAGCTTGCGGATTCAAGTGCAACAGC

hms1Ri R：AAAAAGGATCCTCTCCTGTGAATGATCATTCC

2)使用hms1Ri F/R引物对ZH11花粉母细胞时期的幼穗cDNA进行扩增，得到401bp的DNA片段，其序列如SEQ ID No.10所示；并将其克隆到pYLRNAi载体质粒中；

如图4示，转基因植物(hms1Ri)的表型与hms1突变体相似，图4e-g为低湿度下ZH11和hms1RNAi(hms1Ri)植物的整株形态(4e)，结实率(4f)和花粉粒(4g)。

实施例3和实施例4的结果表明，LOC_Os03g12030中的突变导致hms1中的湿敏不育(HGMS)。

实施例5：利用CRISPR/Cas9培育水稻湿敏不育系的培育方法，包括以下步骤：

ZH11是粳稻系，而杂交水稻系主要在籼稻(indica)上繁殖。我们使用CRISPR/Cas9敲除了在中国种植超过450万公顷的优质籼稻品种黄华占(HHZ)的hms1。

利用CRISPR/Cas9培育水稻湿敏不育系的培育方法，包括以下步骤：

1)合成hms1CAS F/R引物对序列；

hms1CAS F/R引物对包括hms1CAS1 F/R和/或hms1CAS2 F/R，其序列分别如下所示：

hms1CAS1 F：GTTGAAGCTGGGGTACCAGTATC，如SEQ ID No.5所示；

hms1CAS1 R：AAACGATACTGGTACCCCAGCTT，如SEQ ID No.6所示；

hms1CAS2 F：GGCACCGCTCGAGGATCCTGGTC，如SEQ ID No.7所示；

hms1CAS2 R：AAACGACCAGGATCCTCGAGCGG，如SEQ ID No.8所示；

2)将hms1CAS F/R引物退火克隆到pYLgRNA-OsU6a载体中，以产生具有靶序列的sgRNA表达盒；

5)使用潮霉素磷酸转移酶的扩增鉴定了转基因品系，得到了转基因植株HHZ-hms1Cas突变体。

将HHZ和HHZ-hms1Cas突变体进行杂交，得到HHC×HHZ杂交种子(或简称为H×HHZ杂交种子)，将93-11与HHZ-hms1Cas突变体进行杂交，得到HHC×93-11杂交种子。说明HHZ-hms1Cas突变体可用于两系杂交育种。

HHZ-hms1Cas突变体等植株，在广州田间培育(相对湿度为50-90％RH)或在人工气候室培育(相对湿度为75％)，结果如图5所示。

图5a的为在田间培育的HHZ、HHZ-hms1Cas突变体和H×HHZ杂交种子的植株的整株形态；图5b为在人工气候室培育的HHZ、HHZ-hms1Cas突变体和H×HHZ杂交种子的植株的花粉形态和结实率；图5c为在田间和人工气候室培育的HHZ和两组HHZ-hms1Cas突变体的植株的结实率统计；图5d为HHC×93-11杂交种子和HHC×HHZ杂交种子的结实率。

由图5a-5c可知，在田间培育的HHZ-hms1Cas突变体表现出较低的结实率，在高湿条件下的人工气候室培育的HHZ-hms1Cas，其结实率与HHZ的结实率相当。

由图5d可知，在田间培育的HHZ-hms1Cas突变体与HHZ或与93-11的杂交植株均可获得较高的结实率，表明，HHZ-hms1Cas突变体可应用于两系杂交育种。

这些结果表明，hms1可用作籼稻和粳稻杂交育种的湿敏不育基因。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种水稻湿敏不育基因及其应用与不育系培育方法

<130> 华南农业大学

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Ser Gly Ser Val Lys Leu Lys Tyr Val

1 5 10 15

Lys Leu Gly Tyr Gln Tyr Leu Val Asn His Phe Leu Thr Leu Leu Leu

20 25 30

Val Pro Val Met Ala Ala Thr Ala Leu Glu Leu Ala Arg Met Gly Pro

35 40 45

Gly Glu Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ser Leu Gln Leu Asp Leu Val His

50 55 60

Ile Leu Cys Ser Val Phe Leu Val Val Phe Val Gly Thr Val Tyr Phe

65 70 75 80

Met Ser Arg Pro Arg Pro Val Tyr Leu Val Asp Tyr Ser Cys Tyr Lys

85 90 95

Pro Pro Pro Ser Cys Arg Val Pro Phe Ala Thr Phe Met Glu His Thr

100 105 110

Arg Leu Ala Gly Ala Ser Pro Thr Thr Arg Arg Ala Cys Gly Ser Arg

115 120 125

Pro Gly Ser Ser Ser Gly Arg Gly Ser Gly Arg Arg Pro Ala Ser Arg

130 135 140

Arg Pro Thr Thr Thr Ser Arg Leu Thr Arg Pro Trp Arg Arg Arg Ala

145 150 155 160

Pro Arg Pro Ser Ser

165

<210> 2

<211> 1493

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgccggggg cggcggggta ctccgggtcg gtgaagctga agtacgtgaa gctggggtac 60

cagtatctgg tgaaccactt cctgacgctg ctgctggtgc cggtgatggc ggcgacggcg 120

ctggagctgg cgcggatggg gcccggtgag ctgctgtcgc tgtggcggtc gctgcagctc 180

gacctcgtcc acatcctctg ctcggtgttc ctcgtcgtgt tcgtcggcac ggtgtacttc 240

atgtcgcggc caaggccggt gtacctcgtc gactactcct gctacaagcc gccgcccagc 300

tgccgggtgc cgttcgccac gttcatggag cacacgcgcc ttgctggagc atcaccgacg 360

acgagaagag cgtgcggttc cagaccagga tcctcgagcg gtcggggctc ggggaggaga 420

cctgcctccc gccggccaac cactacatcc cgcctaaccc gtccatggag gcgtcgcgcg 480

ccgaggccca gctcgtaatc ttctccgcca tcgacgacct cgtccgccgc accggactca 540

agcccaagga catcgacatc ctcgtcgtca actgcagtct cttctccccg acaccgtcgc 600

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ccggcatggg ctgcagcgcc ggcctcatct ccctcgacct cgcccgcgac atgctccagg 720

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tcaagtcgaa catcaccacc atcggcccgc tggtgctgcc catgtcggag cagctgctct 1080

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acttcaagct ggcgttcgag cacttctgca tccacgccgg gggacgcgcc gtgatcgacg 1200

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acgactgcat ccaccgctac cccgtcgaca tcccggaggt cgtcaagctg tga 1493

<210> 3

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Ser Gly Ser Val Lys Leu Lys Tyr Val

1 5 10 15

Lys Leu Gly Tyr Gln Tyr Leu Val Asn His Phe Leu Thr Leu Leu Leu

20 25 30

Val Pro Val Met Ala Ala Thr Ala Leu Glu Leu Ala Arg Met Gly Pro

35 40 45

Gly Glu Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ser Leu Gln Leu Asp Leu Val His

50 55 60

Ile Leu Cys Ser Val Phe Leu Val Val Phe Val Gly Thr Val Tyr Phe

65 70 75 80

Met Ser Arg Pro Arg Pro Val Tyr Leu Val Asp Tyr Ser Cys Tyr Lys

85 90 95

Pro Pro Pro Ser Cys Arg Val Pro Phe Ala Thr Phe Met Glu His Thr

100 105 110

Arg Leu Ile Thr Asp Asp Glu Lys Ser Val Arg Phe Gln Thr Arg Ile

115 120 125

Leu Glu Arg Ser Gly Leu Gly Glu Glu Thr Cys Leu Pro Pro Ala Asn

130 135 140

His Tyr Ile Pro Pro Asn Pro Ser Met Glu Ala Ser Arg Ala Glu Ala

145 150 155 160

Gln Leu Val Ile Phe Ser Ala Ile Asp Asp Leu Val Arg Arg Thr Gly

165 170 175

Leu Lys Pro Lys Asp Ile Asp Ile Leu Val Val Asn Cys Ser Leu Phe

180 185 190

Ser Pro Thr Pro Ser Leu Ser Ala Met Ile Ile Asn Lys Tyr Lys Leu

195 200 205

Arg Ser Asn Ile Arg Ser Phe Asn Leu Ser Gly Met Gly Cys Ser Ala

210 215 220

Gly Leu Ile Ser Leu Asp Leu Ala Arg Asp Met Leu Gln Val His Pro

225 230 235 240

Asn Ser Asn Ala Leu Val Val Ser Thr Glu Ile Ile Thr Pro Asn Phe

245 250 255

Tyr Trp Gly Thr Arg Arg Asp Met Met Leu Pro Asn Cys Leu Phe Arg

260 265 270

Met Gly Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Arg Arg Arg Glu Ala Arg

275 280 285

Arg Ala Lys Tyr Arg Leu Met His Val Val Arg Thr His Lys Gly Ala

290 295 300

Asp Asp Arg Ala Tyr Arg Cys Val Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Gln Gly

305 310 315 320

His Ser Gly Ile Ser Leu Ser Lys Glu Leu Met Ala Ile Ala Gly Asp

325 330 335

Ala Leu Lys Ser Asn Ile Thr Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Pro Met

340 345 350

Ser Glu Gln Leu Leu Phe Phe Phe Arg Leu Val Gly Arg Lys Leu Ile

355 360 365

Asn Lys Lys Trp Lys Pro Tyr Ile Pro Asp Phe Lys Leu Ala Phe Glu

370 375 380

His Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Ala Val Ile Asp Glu Leu Gln

385 390 395 400

Lys Asn Leu Asp Leu Ser Ala Gln His Val Glu Ala Ser Arg Met Thr

405 410 415

Leu His Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Leu Trp Tyr Glu Leu

420 425 430

Ala Tyr Ile Glu Ala Lys Gly Arg Met Arg Arg Gly Asp Arg Val Trp

435 440 445

Gln Ile Gly Phe Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ala Val Trp Lys

450 455 460

Cys Leu Arg Thr Val Lys Thr Pro Ala Asp Gly Pro Trp Asp Asp Cys

465 470 475 480

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<210> 4

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgccggggg cggcggggta ctccgggtcg gtgaagctga agtacgtgaa gctggggtac 60

cagtatctgg tgaaccactt cctgacgctg ctgctggtgc cggtgatggc ggcgacggcg 120

ctggagctgg cgcggatggg gcccggtgag ctgctgtcgc tgtggcggtc gctgcagctc 180

gacctcgtcc acatcctctg ctcggtgttc ctcgtcgtgt tcgtcggcac ggtgtacttc 240

atgtcgcggc caaggccggt gtacctcgtc gactactcct gctacaagcc gccgcccagc 300

tgccgggtgc cgttcgccac gttcatggag cacacgcgcc tcatcaccga cgacgagaag 360

agcgtgcggt tccagaccag gatcctcgag cggtcggggc tcggggagga gacctgcctc 420

ccgccggcca accactacat cccgcctaac ccgtccatgg aggcgtcgcg cgccgaggcc 480

cagctcgtaa tcttctccgc catcgacgac ctcgtccgcc gcaccggact caagcccaag 540

gacatcgaca tcctcgtcgt caactgcagt ctcttctccc cgacaccgtc gctctccgcc 600

atgatcatca acaagtacaa gctccgcagc aacatccgca gcttcaacct gtccggcatg 660

ggctgcagcg ccggcctcat ctccctcgac ctcgcccgcg acatgctcca ggtgcatccc 720

aactcgaacg cgctggtggt gtcgacggag atcatcacac caaacttcta ctggggaacc 780

cggcgggaca tgatgctgcc caactgcctg ttccggatgg gcgcggcggc gatcctgctg 840

tcgaacagga ggagggaggc gaggagggcc aagtacaggc tgatgcacgt ggtccgcacg 900

cacaagggcg ccgacgaccg cgcgtaccgg tgcgtgtacg aggaggagga cgagcagggg 960

cactcgggga tctcgctgtc caaggagctg atggccatcg ccggcgacgc gctcaagtcg 1020

aacatcacca ccatcggccc gctggtgctg cccatgtcgg agcagctgct cttcttcttc 1080

cgcctcgtcg gccgcaagct catcaacaag aagtggaagc cgtacatccc ggacttcaag 1140

ctggcgttcg agcacttctg catccacgcc gggggacgcg ccgtgatcga cgagctgcag 1200

aagaacctgg acctgtccgc gcagcacgtg gaggcgtccc gcatgacgct gcaccggttc 1260

ggcaacacgt cgagcagctc gctctggtac gagctcgcct acatcgaggc caaggggcgc 1320

atgcgccgcg gcgaccgcgt ctggcagatc ggcttcggca gcggattcaa gtgcaacagc 1380

gccgtctgga agtgcctccg cacagtcaag acgcccgccg acgggccgtg ggacgactgc 1440

atccaccgct accccgtcga catcccggag gtcgtcaagc tgtga 1485

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttgaagctg gggtaccagt atc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacgatact ggtaccccag ctt 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcaccgctc gaggatcctg gtc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

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aaacgaccag gatcctcgag cgg 23

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgcagccaaa ggaccacact gtcattggct ccgggacaat aggaggccat atatttagcc 60

attttttagg gagattttca ccaattgtac agttgcacta ttgctacgca gatcactgca 120

tacgcaatta actctttctt acaagctcag aagctgtctg cacctatata gctactccct 180

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tggatataca tcatactaaa atatgttata tccggttcta gattcgtttt tatggaacgg 300

agggagtatt ctgtcatcag ctatcactgc tctgcctgaa cttgtctgag ctattactac 360

tgtagtatat gaatttatga agtggagtct cgtaacaaaa atacgagtat actccgtact 420

gtactaccct tatcaggatt caaggatact aggagtatag cattaccaga tcaggcactt 480

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ctttcaaaaa aaaaagtact agtatagaag tagtatccag ctagagctgc ttaacagggt 600

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agtcaacatt taaagagtac tatttcgaag taaaactgtt cagttcttac aagattacat 720

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ctgcaacaac agtgctttaa attgtacaag cagagggtac caacagagta atttgcacat 840

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agaggacctg atttggactc aaatcaggtg ttgacgaata gagtagcaag agttttttcg 1140

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ctcaaaaatc agatgcaaat ttagatggga cagacagcag ctactagcaa cataagagaa 1320

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agcagtacag tacctgtgca cattgcttgt gtattactcc acttaattac gaactctatt 1440

attttcctcc gataatgccc gcagaacaag gttgtcactg aaaaatggtc ctctccagag 1500

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gaccccccaa ccgggcaccg gacacaccat caccaacaca ccactgcaaa cccatccgcc 1860

tccgcaccgc atcgcaccta caaattgtgc acgctgcacc gctcaaaaaa aagaagaaac 1920

taaagtcgta cgtaggacgc ggcgtgcgag cgttggtgcg gtgcgcggcg gcgcgcgggg 1980

aagtagtgag agcatcgatc atgccggggg cggcggggta ctccgggtcg gtgaagctga 2040

agtacgtgaa gctggggtac cagtatctgg tgaaccactt cctgacgctg ctgctggtgc 2100

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tgtggcggtc gctgcagctc gacctcgtcc acatcctctg ctcggtgttc ctcgtcgtgt 2220

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ttgtctgatg tgtcacataa ggaatgatca ttcacaggag a 401

Claims

1.一种水稻湿敏不育基因，其特征在于，其编码的蛋白为：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

2.如权利要求1所述的水稻湿敏不育基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列包括SEQID No.2所示的序列。

3.一种如权利要求1所述的水稻湿敏不育基因在调控水稻湿敏不育性状中的应用。

4.一种水稻不育系培育方法，其特征在于，包括使用基因工程手段操作SEQ ID No.2所示的序列的步骤。

5.如权利要求4所述的水稻不育系培育方法，其特征在于，所述基因工程手段包括基因编辑和RNAi。

6.一种水稻不育系培育方法，其特征在于，利用LOC_Os03g12030突变序列特征发展的分子标记辅助育种。