CN111187313A - 乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷和硫酸乙酯的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷和硫酸乙酯的制备方法，属于化合物制备领域。本发明采用葡萄糖醛酸内酯为基本的反应原料，经过三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯中间体，在超声、水浴加热等条件下反应即可得到乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷，使该制备方法具有环境因素要求低，操作简单、易于实现的优点；另外本发明以无水乙醇和硫酸为原料，经过加热、过滤、沉淀、水浴挥干等操作得到乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯，具有原料来源广泛、环境因素要求低，操作简单、易于实现的优点。
Description
技术领域
本发明属于化合物制备领域领域，具体涉及乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷和硫酸乙酯的制备方法。
背景技术
乙醇，俗称酒精，是世界性的一大滥用物质。司法鉴定实践中，在交通事故、怀疑中毒的自杀、他杀案件，尤其是涉及死亡的案件中，需要对血液中的酒精的浓度(BloodAlcohol Concentration,BAC)进行分析和阐述，其检测结果往往是判定当事人责任的关键性证据。研究显示，乙醇入体后，会生成4类非氧化代谢物，包括乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、脂肪酸乙酯(FAEE)和磷脂酰乙醇(PEth)，它们具有极高的专属性和特异性，被认为是乙醇摄入的重要生物标志物。而通过检测全血中乙醇的这些非氧化代谢物将有望解决上述两个难题(酒后逃逸案件BAC的检测和尸体血液中乙醇的来源问题)。
由于乙醇的4类非氧化代谢物的理化性质差别大，目前已有报道的分析方法，仅仅针对于一类或两类代谢物的检测。事实上，乙醇的4类非氧化代谢物具有不同的检测时限，且在尸体检材中的稳定性也有所差异，如EtG和EtS是目前受到关注最多的两类代谢物，它们在血液中的检测时限大于18h，其作为酒精标志物具有很高的灵敏度和专属性；FAEE具有细胞毒性，检测时限长达24h，研究认为酒精中毒及酒精引起的相关疾病均与其含量及毒性密切相关；PEth为乙醇存在情况下细胞膜合成时产生的特异性物质，饮酒后一周仍可检测到PEth，且对于长期饮酒者其检测时限更长，并且，根据其含量可对单次饮酒与长期饮酒进行区分。
本发明采用化学合成的方法对乙醇的两种非氧化代谢物——乙基葡萄糖醛酸苷和硫酸乙酯进行合成。通过该方法合成的两种物质产率与纯度较低，通过方法优化提高了硫酸乙酯的纯度和产率，但缺乏两种物质的提纯方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法；本发明的目的之二在于提供乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)合成BGAME原料：按照15～18:150～250:0.2～0.5，g:ml:g的质量体积比将葡萄糖醛酸内酯、甲醇和甲醇钠混合，超声至完全溶解后静置，40℃下水浴加热至溶剂完全挥发，加入乙酸酐使其溶解，再加入含高氯酸的乙酸酐溶液，室温下过夜，加入0.1ml高氯酸，混合均匀后在-20℃冰箱中过夜，析出晶体，过滤后用乙醚洗涤后即可得到BGAME原料；
(2)合成BGAME：将步骤(1)中制备得到的BGAME原料和溴化氢乙酸混合，-20℃冰箱中过夜，40℃下水浴加热至溶剂完全挥发，加入氯仿，用体积比为1:1的冷饱和碳酸氢钠溶液和纯水混合溶剂进行萃取，静置后收集下层溶液，加入无水硫酸钠干燥后过滤，在40℃下水浴加热挥干溶剂得到残余物，加入乙醇溶解后过滤，滤去不溶物后再去除乙醇即可得到BGAME；
(3)合成乙基葡萄糖醛酸苷：将步骤(2)中制备得到的BGAME与苯、无水乙醇混合，加热至沸腾后再加入碳酸银，搅拌，室温过夜；离心后收集溴化物沉淀，40℃挥干，再加入无水甲醇和甲醇钠，搅拌，室温过夜，水浴挥干；再加入氢氧化钡溶液，超声并缓慢滴加质量分数为7～10％的草酸溶液至PH＝6，离心后40℃挥干，再滴加甲醇至完全溶解，滴加乙醚，形成白色沉淀即为乙基葡萄糖醛酸苷。
优选的，步骤(1)中所述葡萄糖醛酸内酯与所述乙酸酐溶液的质量体积比为5～6:4，g:ml；所述乙酸酐溶液中高氯酸的体积百分数为3％。
优选的，步骤(2)中所述BGAME原料、溴化氢乙酸和氯仿的质量体积比为5:15～25:50～150，g:ml:ml。
优选的，步骤(3)中所述BGAME、苯、无水乙醇、碳酸银的体积质量比为20:80～120:20～30:1～3，g:ml:ml:g；所述无水甲醇、甲醇钠、BGAME的体积质量比为25:1:1，ml:ml:g；所述BGAME与氢氧化钡溶液的质量体积比为1:1～1.5，g:ml，所述氢氧化钡溶液中氢氧化钡的质量分数为3％。
优选的，所述离心为在3500r/min的转速下离心20min。
2、乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，所述硫酸乙酯的制备方法包括如下步骤：
(1)将无水乙醇、浓硫酸和无水硫酸钠混合，100℃加热2小时，再加入4倍以上体积的水，再缓慢加入碳酸钙，搅拌至中性，40～80℃加热20～50min，过滤，将滤液于70℃下挥干得到固体；
(2)先向步骤(1)中得到的固体中加入水溶解，加入饱和碳酸氢钠溶液至溶液呈中性，过滤得滤液，将滤液与70℃下加热挥干，然后加入甲醇，超声溶解后过滤，用氮气吹至白色乳状液，加入乙腈溶解，加热至沸腾后再加入乙腈与乙醚的混合溶剂至出现白色沉淀，冷却至室温，-20℃下冷冻3h；
(3)将步骤(2)中冷冻后的溶液进行低温离心，取上清液，加入与步骤(2)中等体积的乙腈与乙醚的混合溶剂，70～80℃下水浴挥干，得到白色沉淀即为硫酸乙酯。
优选的，步骤(1)中所述无水乙醇、浓硫酸和无水硫酸钠的体积质量比为10～15:12～16:1.5～2.0，ml:ml:g。
优选的，步骤(1)中所述无水乙醇与碳酸钙的体积质量比为10～15:1，ml:g。
优选的，步骤(2)中所述乙腈与乙醚的混合溶剂中乙腈与乙醚的体积比为3:1。
优选的，步骤(3)中所述低温离心为在4℃下以12000r/min的转速离心10min。
本发明的有益效果在于：
1、本发明公开了乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，以葡萄糖醛酸内酯为基本的反应原料，反应的中间体为三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯，在超声、水浴加热等条件下反应即可得到乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷，该制备方法具有环境因素要求低，操作简单、易于实现的优点；
2、本发明公开了乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，以无水乙醇为原料，经过加热、过滤、沉淀、水浴挥干等操作得到乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯，该制备方法具有原料来源广泛、环境因素要求低，操作简单、易于实现的优点。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为标准乙基葡萄糖醛酸苷与实施例1中制备的产品的TIC图；
图2为1ug/ml标准乙基葡萄糖醛酸苷的MRM图；
图3为5ug/ml实施例1中制备的产品MRM图；
图4为图1中1ug/ml标准乙基葡萄糖醛酸苷稀释20倍后的MRM图；
图5为标准乙基葡萄糖醛酸苷与实施例1中制备的产品的质谱对比图，其中a为1ug/ml标液，b为5ug/ml合成品，c为稀释20倍的1ug/ml标液；
图6为1ug/ml标准硫酸乙酯的MRM图；
图7为实施例4中制备的产品稀释20倍后的MRM图；
图8为标准硫酸乙酯与实施例4中制备的产品的质谱对比图，其中a为1ug/ml标液，b为实施例4中稀释20倍合成品。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
合成乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷，其制备方法如下：
(1)合成三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)的原料：将16.7g葡萄糖醛酸内酯与200ml甲醇(含0.3g甲醇钠)混合后，超声至完全溶解，静置30min，40℃水浴挥干；再加入68ml乙酸酐完全溶解后逐滴滴加10ml乙酸酐(含0.3ml高氯酸)，控制滴加时的温度不超过40℃，室温下过夜；加入0.1ml高氯酸，混合均匀后在-20℃的冰箱中过夜析出晶体，过滤后取固体部分，用乙醚冲至奶白色、晾干后置于烧杯中，用热乙醇以重结晶即可得到三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)的原料。
(2)合成三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)：将步骤(1)制得的BGAME原料50g和20ml溴化氢乙酸混合后，4℃-20℃下冰箱中过夜，40℃水浴挥干，加入100ml氯仿，将溶液转移入分液漏斗，加50ml冷饱和碳酸氢钠溶液、50ml纯水进行萃取，静置1h，收集下层液体；加入无水硫酸钠干燥后过滤，40℃水浴挥干；加入150ml乙醇溶解后过滤，滤去不溶物后旋蒸除去乙醇，即可得到三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)。
(3)合成乙基葡萄糖醛酸苷：将步骤(2)中制备得到的20ml BGAME加入到100ml苯、25ml无水乙醇中加热至沸腾3小时，加入2g碳酸银，搅拌，室温过夜；3500r/min的转速离心20min后收集溴化物沉淀，40℃水浴条件下挥干溶剂；加入500ml甲醇和25ml甲醇钠，搅拌，室温过夜，40℃水浴挥干；再加入25ml质量分数为3％的氢氧化钡溶液，超声下缓慢滴加质量分数为9％的草酸溶液至PH＝6，3500r/min离心20min，40℃挥干，滴加甲醇溶解后继续滴加乙醚，形成白色沉淀即为乙基葡萄糖醛酸苷，结构式如下：
对合成的乙基葡萄糖醛酸苷产物进行HPLC-MS-MS检测，并与标准的乙基葡萄糖醛酸苷样品进行对比，其结果如图1～5所示，可以看出：1ug/ml标液的峰面积是5ug/ml合成品的20倍，将标液稀释20倍后再与合成品对比，两者的离子比接近约为34％，标液的保留时间tR＝2.18min，合成品的保留时间tR＝2.21min，即说明实施例1中乙基葡萄糖醛酸苷制备方法的产率为4.1％，其合成的乙基葡萄糖醛酸苷的纯度为1％；
实施例2
合成乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷，其制备方法如下：
(1)合成三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)的原料：将15.0g葡萄糖醛酸内酯与250ml甲醇(含0.2g甲醇钠)混合后，超声至完全溶解，静置，40℃水浴挥干；再加入乙酸酐使其溶解，逐滴滴加12ml的乙酸酐溶液(其中乙酸酐溶液中含有体积百分数为3％的高氯酸)，室温下过夜；然后加入0.1ml高氯酸混合均匀后在-20℃下的冰箱过夜，待析出晶体；过滤后取固体部分，用乙醚冲至奶白色、晾干后即可得到三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)的原料。
(2)合成三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)：将步骤(1)制得的BGAME原料5g和15ml溴化氢乙酸混合后，在-20℃下的冰箱中过夜，40℃下水浴挥干；加入50ml氯仿后转移到分液漏斗，加50ml冷饱和碳酸氢钠溶液、50ml纯水进行萃取，静置后收集下层液体；加入无水硫酸钠干燥后过滤得到固体，40℃下水浴挥干得到固体残余物，加入乙醇溶解后过滤，除去不溶物的溶液经过旋转蒸发除去乙醇溶解即可得到三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)。
(3)合成乙基葡萄糖醛酸苷：将步骤(2)中制备得到的20ml BGAME加入到80ml苯和20ml无水乙醇中加热至沸腾，再加入3g碳酸银，搅拌室温过夜后离心收集溴化物沉淀、40℃水浴挥干；然后加入500ml甲醇和20ml甲醇钠，搅拌后室温下过夜，50℃下水浴挥干；再加入20ml质量分数为3％的氢氧化钡溶液，超声并缓慢滴加质量分数为7％的草酸溶液至PH＝6后，再以3500r/min的转速离心20min，45℃下挥干后滴加甲醇至全部溶解，继续滴加乙醚形成白色沉淀，即为乙基葡萄糖醛酸苷。
实施例3
合成乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷，其制备方法如下：
(1)合成三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)的原料：将18.0g葡萄糖醛酸内酯与150ml甲醇(含0.5g甲醇钠)混合后，超声至完全溶解，静置，40℃水浴挥干；再加入乙酸酐使其溶解，逐滴滴加12ml含高氯酸的乙酸酐溶液(其中高氯酸的体积百分数为3％)，保证滴加过程中反应体系的温度不高于40℃，常温下过夜；然后加入0.1ml高氯酸，混合均匀后在-20℃下的冰箱中过夜至析出晶体；过滤后取固体部分，用乙醚冲至奶白色、晾干后即可得到三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)的原料。
(2)合成三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)：将步骤(1)制得的BGAME原料5g和25ml溴化氢乙酸混合后，-20℃的冰箱中过夜，40℃水浴挥干(即40℃下水浴加热至溶剂完全挥发)，加入150ml氯仿后将转移到分液漏斗，加50ml冷饱和碳酸氢钠溶液、50ml纯水进行萃取，静置后收集下层液体；加入无水硫酸钠干燥后过滤得到固体，40℃下水浴挥干的少残余物，加入乙醇溶剂后滤去不溶物，旋转蒸发除去溶剂即可得到三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯(BGAME)。
(3)合成乙基葡萄糖醛酸苷：将步骤(2)中制备得到的BGAME 20ml加入到120ml苯和30ml无水乙醇中加热至沸腾，加入1g碳酸银，搅拌，室温过夜；离心后收集溴化物沉淀，40℃挥干；再加入500ml甲醇、20ml甲醇钠，搅拌后静置过夜，40℃水浴挥干；再加入30ml质量分数为3％的氢氧化钡溶液，超声并缓慢滴加质量分数为10％的草酸溶液至PH＝6，再以3500r/min的转速离心20min，45℃下挥干，再滴加甲醇至完全溶解，继续滴加乙醚形成白色沉淀即为乙基葡萄糖醛酸苷。
本发明公开了乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，以葡萄糖醛酸内酯为基本的反应原料，反应的中间体为三乙酰基溴葡萄糖醛酸甲酯，在超声、水浴加热等条件下反应即可得到乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷，该制备方法具有环境因素要求低，操作简单、易于实现的优点。
实施例4
合成乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯，其制备方法包括如下步骤：
(1)将12ml无水乙醇、14.4ml浓硫酸和1.8g无水硫酸钠混合，100℃下加热2h，再加入105.6ml纯水、碳酸钙，搅拌至中性，60℃下加热30min，过滤，取滤液于70℃下挥干得到固体。
(2)将步骤(1)中得到的固体加纯水溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调节至中性，过滤得滤液，于70℃下加热挥干；加入50ml甲醇，超声溶解后过滤，用氮气吹至出现白色乳状液，加入3ml乙腈溶解，加热至沸腾后加入2ml乙腈与乙醚的混合溶剂(混合溶剂中和乙腈与乙醚的体积比为3:1)至出现白色沉淀，冷却至室温，再于-20℃下冷冻3h。
(3)将步骤(2)中冷冻后的产物进行低温离心(4℃下以12000r/min转速离心10min)，取上清液，加入等体积的乙腈与乙醚的混合溶剂(混合溶剂中和乙腈与乙醚的体积比为3:1)，75℃水浴挥干，得到白色沉淀即为硫酸乙酯，其结构式如下：
对合成的硫酸乙酯产物进行HPLC-MS-MS检测，并与标准的硫酸乙酯样品进行对比，其结果如图6～8所示，可以看出：1ug/ml标液的峰面积与稀释20倍的合成品的峰面积近似：两者的离子比接近约为19％；标液的保留时间tR＝1.86min,合成品的保留时间tR＝1.94min；合成品纯度为62.4％；制备方法经优化后(即反应物的量增大6倍、进行双重过滤)1ug/ml合成品的峰面积与1ug/ml标液的峰面积相近。两者的离子比都为16％；标液的保留时间tR＝1.72min,合成品的保留时间tR＝1.71min。纯化后的产率为10％，合成品纯度为84％。
实施例5
合成乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯，其制备方法包括如下步骤：
(1)将10ml无水乙醇、16ml浓硫酸和2.0g无水硫酸钠混合，100℃下加热2h，再加入130ml纯水、再缓慢加入1g碳酸钙，搅拌至中性，40℃下加热50min后过滤，取滤液于70℃下挥干得到固体。
(2)将步骤(1)中得到的固体加纯水溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调节至中性，过滤得滤液，于70℃下加热挥干；加入50ml甲醇，超声溶解后过滤，用氮气吹至出现白色乳状液，加入3ml乙腈溶解，加热至沸腾后加入2ml乙腈与乙醚的混合溶剂(混合溶剂中和乙腈与乙醚的体积比为3:1)至出现白色沉淀，冷却至室温，再于-20℃下冷冻3h。
(3)将步骤(2)中冷冻后的产物进行低温离心(4℃下以12000r/min转速离心10min)，取上清液，加入与步骤(2)中等体积的乙腈与乙醚的混合溶剂(混合溶剂中和乙腈与乙醚的体积比为3:1)，70℃水浴挥干，得到白色沉淀即为硫酸乙酯。
实施例6
合成乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯，其制备方法包括如下步骤：
(1)将15ml无水乙醇、12ml浓硫酸和1.5g无水硫酸钠混合，100℃下加热2h，再加入200ml纯水、1.5g碳酸钙，搅拌至中性，80℃下加热20min，过滤，取滤液于70℃下挥干得到固体。
(2)将步骤(1)中得到的固体加纯水溶解，用饱和碳酸氢钠溶液调节至中性，过滤的滤液，于70℃下加热挥干；加入50ml甲醇，超声溶解后过滤，用氮气吹至出现白色乳状液，加入3ml乙腈溶解，加热至沸腾后加入2ml乙腈与乙醚的混合溶剂(混合溶剂中和乙腈与乙醚的体积比为3:1)至出现白色沉淀，冷却至室温，再于-20℃下冷冻3h。
(3)低温离心(4℃下以12000r/min转速离心10min)，取上清液，加入等体积的乙腈与乙醚的混合溶剂(混合溶剂中和乙腈与乙醚的体积比为3:1)，80℃水浴挥干，得到白色沉淀即为硫酸乙酯。
本发明公开了乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，以无水乙醇为原料，经过加热、过滤、沉淀、水浴挥干等操作得到乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯，该制备方法具有原料来源广泛、环境因素要求低，操作简单、易于实现的优点
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)合成BGAME原料：按照15～18:150～250:0.2～0.5，g:ml:g的质量体积比将葡萄糖醛酸内酯、甲醇和甲醇钠混合，超声至完全溶解后静置，40℃下水浴加热至溶剂完全挥发，加入乙酸酐使其溶解，再加入含高氯酸的乙酸酐溶液，室温下过夜，加入高氯酸，混合均匀后在-20℃冰箱中过夜，析出晶体，过滤后用乙醚洗涤后即可得到BGAME原料；
(2)合成BGAME：将步骤(1)中制备得到的BGAME原料和溴化氢乙酸混合，-20℃冰箱中过夜，40℃下水浴加热至溶剂完全挥发，加入氯仿，用体积比为1:1的冷饱和碳酸氢钠溶液和纯水混合溶剂进行萃取，静置后收集下层溶液，加入无水硫酸钠干燥后过滤，在40℃下水浴加热挥干溶剂得到残余物，加入乙醇溶解后过滤，滤去不溶物后再去除乙醇即可得到BGAME；
(3)合成乙基葡萄糖醛酸苷：将步骤(2)中制备得到的BGAME与苯、无水乙醇混合，加热至沸腾后再加入碳酸银，搅拌，室温过夜；离心后收集溴化物沉淀，40℃挥干，再加入无水甲醇和甲醇钠，搅拌，室温过夜，水浴挥干；再加入氢氧化钡溶液，超声并缓慢滴加质量分数为7～10％的草酸溶液至PH＝6，离心后40℃挥干，再滴加甲醇至完全溶解，滴加乙醚，形成白色沉淀即为乙基葡萄糖醛酸苷。
2.根据权利要求1所述乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述葡萄糖醛酸内酯与所述乙酸酐溶液的质量体积比为5～6:4，g:ml；所述乙酸酐溶液中高氯酸的体积百分数为3％。
3.根据权利要求1所述乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述BGAME原料、溴化氢乙酸和氯仿的质量体积比为5:15～25:50～150，g:ml:ml。
4.根据权利要求1所述乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述BGAME、苯、无水乙醇、碳酸银的体积质量比为20:80～120:20～30:1～3，g:ml:ml:g；所述无水甲醇、甲醇钠、BGAME的体积质量比为25:1:1，ml:ml:g；所述BGAME与氢氧化钡溶液的质量体积比为1:1～1.5，g:ml，所述氢氧化钡溶液中氢氧化钡的质量分数为3％。
5.根据权利要求1所述乙醇非氧化代谢物乙基葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于，所述离心为在3500r/min的转速下离心20min。
6.乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，其特征在于，所述硫酸乙酯的制备方法包括如下步骤：
(1)将无水乙醇、浓硫酸和无水硫酸钠混合，100℃加热2小时，再加入4倍以上体积的水，再缓慢加入碳酸钙，搅拌至中性，40～80℃加热20～50min，过滤，将滤液于70℃下挥干得到固体；
(2)先向步骤(1)中得到的固体中加入水溶解，加入饱和碳酸氢钠溶液至溶液呈中性，过滤得滤液，将滤液与70℃下加热挥干，然后加入甲醇，超声溶解后过滤，用氮气吹至白色乳状液，加入乙腈溶解，加热至沸腾后再加入乙腈与乙醚的混合溶剂至出现白色沉淀，冷却至室温，-20℃下冷冻3h；
(3)将步骤(2)中冷冻后的溶液进行低温离心，取上清液，加入与步骤(2)中等体积的乙腈与乙醚的混合溶剂，70～80℃下水浴挥干，得到白色沉淀即为硫酸乙酯。
7.根据权利要求6所述乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无水乙醇、浓硫酸和无水硫酸钠的体积质量比为10～15:12～16:1.5～2.0，ml:ml:g。
8.根据权利要求6所述乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无水乙醇与碳酸钙的体积质量比为10～15:1，ml:g。
9.根据权利要求6所述乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙腈与乙醚的混合溶剂中乙腈与乙醚的体积比为3:1。
10.根据权利要求6所述乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述低温离心为在4℃下以12000r/min的转速离心10min。
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| CN107664664A (zh) * | 2016-07-31 | 2018-02-06 | 复旦大学 | 一种同时检测人全血中4类乙醇非氧化代谢物的方法 |
| CN108129530A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-08 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物及其制备方法和试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170102349A1 (en) * | 2014-05-30 | 2017-04-13 | Georgia State University Research Foundation | Electrochemical methods and compounds for the detection of enzymes |
| CN107664664A (zh) * | 2016-07-31 | 2018-02-06 | 复旦大学 | 一种同时检测人全血中4类乙醇非氧化代谢物的方法 |
| CN108129530A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-08 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物及其制备方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DINDET STEVE-EVANES KOFFI TEKIAB ET AL: "Synthesis of multivalent: S-glycoside analogs of a heparan sulfate sequence", 《ORGANIC CHEMISTRY FRONTIERS》 * |
| HERCEG V ET AL: "Design, synthesis and in vitro evaluation of ß-glucuronidase-sensitive prodrug of 5-aminolevulinic acid for photodiagnosis of breast cancer cells", 《BIOORG CHEM》 * |
| 吴志广 等: "硫酸二乙酯合成方法的研究", 《化学试剂》 * |
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