CN111184032B - 一种景洪哥纳香杀线虫提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种景洪哥纳香杀线虫提取物及其制备方法和应用，本发明发现景洪哥纳香提取物具有很好的杀线虫活性，可应用于制备杀线虫的药物，用于植物线虫的防控，尤其是对于根结线虫，杀虫效果显著。所述提取物经甲醇或乙醇提取得到，进一步地，通过乙酸乙酯萃取纯化后，活性更好。本发明活性提取物来源于植物，具有环保、高效、低毒等优点。

Description

一种景洪哥纳香杀线虫提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于农药技术领域，涉及一种植物源农药，特别涉及一种景洪哥纳香杀线虫提取物及其制备方法和应用。

背景技术

线虫是世界性的病原生物，每年会给农作物造成上千亿美元的损失。在常见的植物病原线虫中，根结线虫对植物的危害位列首位，被害植株地上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。线虫寄主范围广泛，对西瓜、黄瓜、甜瓜等各种瓜类危害巨大。瓜类水果由于生长周期较长，日常管理难度更高。而市场上，瓜类水果的价格远远高于蔬菜，一旦被根结线虫侵害，造成的经济损失更为巨大。目前根结线虫病的传统防治主要依赖化学农药，然而杀线剂的种类较少，全世界杀线剂品种(单剂)仅有30余种，且大部分属于高毒农药，如有机磷类以及氨基甲酸酯类等药剂多为高毒或存在环境污染问题，严重影响人畜以及环境安全。另一方面，由于防治药剂单一，线虫很容易对常用药剂产生抗性。因此，寻求更多新的、对环境友好型的控制根结线虫病的方法是国内外学者的共识，研究、开发新型生物防治药剂是防治根结线虫病的发展趋势。

从20世纪80年代开始，利用植物提取液防治线虫的研究逐渐引起人们的重视，至今已报道的杀线虫植物约有102科226属316种，其中研究较多的有菊科、楝科、豆科、十字花科、茄科、禾本科、大戟科、罂粟科、夹竹桃科、含羞草科、百合科等，但自然界植物资源极为丰富，许多具有杀线虫作用的植物还未被发现，《中国有毒植物》一书列入有毒植物1300多种，其中，许多种类都具有杀虫活性。其中很多植物都可以就地取材，应用方便，效果明显，因此目前国内对杀线虫植物资源的筛选及毒杀活性测定等方面有较多研究，充分调查和挖掘出更多更有效的新杀线虫植物种类将成为未来发展的方向。

景洪哥纳香(Goniothalamus cheliensis Hu)是番荔枝科哥纳香属的植物。分布于缅甸、泰国、印度以及中国大陆的云南等地，民间常用来做镇痛药，目前尚未由人工引种栽培。迄今为止该植物的研究主要集中在苯乙烯内酯类成分的抗肿瘤作用方面，对线虫病害的毒杀活性未见报道。

发明内容

针对现有技术问题，本发明提供了一种景洪哥纳香杀线虫提取物及其制备方法和应用

本发明是通过如下技术方案实现的：

景洪哥纳香提取物在制备杀线虫药物中的应用，所述提取物为景洪哥纳香的醇提物。

所述景洪哥纳香杀线虫提取物制备方法，包含以下步骤：取景洪哥纳香药材粉碎，用醇溶剂提取，过滤得提取液、提取液浓缩、干燥，获得醇提物。

优选地，所述景洪哥纳香药材为景洪哥纳香叶或景洪哥纳香茎。

优选地，所述纳香景洪哥纳香药材粉碎至10～60目，例如10目、20目、30目、40目、50目或60目等。

优选地，所述醇溶剂为甲醇或乙醇。

优选地，所述醇溶剂提取按每千克药材加入3～10L醇溶剂提取，优选4～7L，更优选5～6L。

优选地，所述提取方式可选浸提、热回流提取、超声提取或其任意两种组合，如浸提与超声组合、浸提与热回流提取组合等，其他任意的组合方式便不在此一一赘述。

优选地，所述浸提时间为10～20h，浸提1～4次，优选地，浸提时间为10～15h，浸提2～3次。

优选地，所述热回流提取时间为1～5h,提取次数为1～4次，优先地，热回流提取时间为2～3h，提取次数为2～3次。

优选地，所述超声提取，超声的功率为300～500W，工作频率为28KHz～100KHz，时间为15min～30min，次数为1～4次。

进一步地，本发明还提供了所述杀线虫提取物的纯化方法，其包含以下步骤：

加水溶解醇提物，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液浓缩，干燥，制得乙酸乙酯萃取物。

优选地，所述溶解醇提物水的用量为药材质量的0.2～0.5倍，萃取用乙酸乙酯体积为溶解用水体积的1～4倍，萃取2～5次；

优选地，所述溶解用水的用量为药材质量的0.3～0.4倍，萃取用乙酸乙酯用体积为溶解用水体积的2～3倍，萃取3～4次；

优选地，所述线虫为根据线虫；

更优选地，所述根结线虫为南方根结线虫、北方根结线虫、瓜哇根结线虫或花生根结线虫。

本发明实验发现，用浓度为50mg/mL的景洪哥纳香茎提取物处理南方根结线虫,72h后,线虫校正死亡率到达60％以上，用乙酸乙酯萃取纯化后，活性更强，浓度为25mg/mL时，48h后,线虫校正死亡率到达60％以上，72h后校正死亡率到达80％以上。说明景洪哥纳香提取物具有很强的杀线虫活性，可以直接作为单方制剂或是与其他组分复配用于植物线虫的防治。

本发明另一方面还提供一种杀线虫制剂，由所述洪哥纳香提取物和农业或林业上可接受药用辅料组成。

优选地，所述药用辅料包括分散剂、润湿剂、增稠剂、稳定剂、防冻剂、消泡剂、稀释剂、乳化剂、或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如增溶剂和稀释剂的组合、分散剂和稳定剂的组合等，其他任意的组合方式便不在此一一赘述。

本发明对所述杀线虫制剂的剂型并没有特殊限定，优选为液体剂、水乳剂、微乳剂、分散剂、悬浮剂、可湿性粉剂和颗粒剂。以景洪哥纳香提取物为活性成分的杀线虫药物可以根据实际需要被制备成任一种药物剂型，各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法进行制备。

本发明对所述药物的应用方法并没有特殊限定，如可进行灌根、撒施、沟施、穴施等，也可过施用至作物生长的区域如土壤或种子处理等。

本发明所述药物可以施用于任何遭受线虫侵害的作物中，这些作物包括但不限于粮食作物，蔬菜和林木等，具体地，粮食作物如花生、玉米、水稻、大豆，高粱、小麦，蔬菜如黄瓜，番茄，芹菜，菠菜，白菜，甜菜，辣椒等，林木如香蕉树、杨树、松树、柏树、椰树、橡胶树等。还可以是烟草、马铃薯、柑橘等。

对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明以景洪哥纳香为研究对象，意外地发现其醇提物具有杀线虫活性，尤其是对南方根结线虫，效果显著。本发明还提供了所述醇提物的制备方法，其制备工艺简单，并且发现经乙酸乙酯萃取纯化后，其活性更好。可用以制备杀线虫药物，广泛用于植物线虫防治，其来源于天然植物，毒性低，安全环保，在农作物中的残留少，对人、畜的危害性小，很好解决了现有的杀线虫剂毒性较大，在作物中的残留较多的问题，提高了农业生产的安全性，具有重要经济和社会意义。

具体实施例

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

景洪哥纳香为于2018年采集自云南西双版纳南部地区。

提取南方根结线虫虫卵的番茄由云南农业大学烟草学院提供。

实施例1

取景洪哥纳香茎5kg粉碎至60目，用15L甲醇浸泡10h，过滤得提取液，反复提取5次，合并提取液、提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，干燥，获得甲醇提取物。

实施例2

取景洪哥纳香叶5kg粉碎至10目，用50L甲醇浸泡20h次，过滤得提取液、提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，干燥，获得甲醇提取物。

实施例3

取景洪哥纳香茎5kg粉碎至40目，用30L甲醇浸泡15h，过滤得提取液，反复提取2次，合并提取液,提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，干燥，获得甲醇提取物。

实施例4

取景洪哥纳香茎5kg粉碎至40目，用20L甲醇热回流提取2h，过滤得提取液，反复提取3次，合并提取液,提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，干燥，获得甲醇提取物。

实施例5

取实施例3制备醇提物加1.5L水溶解，用6L乙酸乙酯萃取，萃取2次，收集乙酸乙酯萃取液减压浓缩，干燥，制得乙酸乙酯萃取物。

实施例6

取实施例2制备醇提物加1L水溶解，用1L乙酸乙酯萃取，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液减压浓缩，干燥，制得乙酸乙酯萃取物。

效果实验例1

(1)从成功侵染南方根结线虫的番茄根结挑取新鲜卵囊，进行线虫的鉴定和培养。清洗带大量线虫卵囊的病根，在解剖镜下挑取大小一致的卵囊用1％的次氯酸钠表面消毒2min，用无菌水漂洗4-5次。将收集到的根结线虫卵放入有清水的培养皿中，使水略漫过卵块。培养箱中25℃孵化，每24h收集一次培养皿中的根结线虫，4℃冰箱中保存备用。

(2)分别取实施例1-6制备样品用纯甲醇溶液溶解，配制1g/mL浓度的样品溶液，分别取395、390、380μL根结线虫悬浮液放入24孔细胞培养板中，使线虫数量均保持在30～50条之间，再分别加入5、10、20μL样品溶液，使样品终浓度分别为12.5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL，置于25℃培养箱中培养，处理后24、48和72小时，通过体态观察法和针刺法检查各处理组的线虫活动情况，每组设一个相同浓度甲醇-蒸馏水溶液做对照，三次重复。

用线虫校正死亡率来表示化合物杀线虫活性，统计和计算方法如下：

杀线活性分为五级：

“－”：表示校正死亡率≤10％，无杀线活性；

“+”：表示校正死亡率为10％～30％，杀线活性弱；

“++”：表示校正死亡率为30％～50％，杀线活性中等；

“+++”：表示校正死亡率为50％～80％，杀线活性较强；

“++++”：表示校正死亡率＞80％，杀线活性强。

表1景洪哥纳香提取物杀线虫活性

表1中实施例1-实施例4结果表明，哥纳香醇叶或茎醇提物均具有杀线虫性，浓度为50mg/mL时，72h后既表现出较强杀线虫活性，哥纳香醇叶醇提物校正死亡率到达到50％以上，茎醇提物校正死亡率到达到60％以上，实施例5、与实施例6结果说明经乙酸乙酯萃取纯化后，杀线活性显著提高，说明乙酸乙酯萃取可以富集杀线虫活性物质，去除大部分非活性物质。

申请人声明，以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (7)

1.景洪哥纳香提取物在制备杀线虫药物中的应用，其特征在于，所述提取物为景洪哥纳香的醇提物，所述醇提物提取用药材为景洪哥纳香叶或景洪哥纳香茎，所述提取物制备方法为取景洪哥纳香药材粉碎，用醇溶剂提取，过滤得提取液、提取液浓缩、干燥，获得醇提物，所述醇溶剂为甲醇或乙醇，所述线虫为根结线虫。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述醇溶剂提取按每千克药材加入3-10L醇溶剂提取。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述提取方法可选浸提、热回流提取、超声提取或其任意两种组合。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述制备方法还包括下述纯化步骤：加水溶解醇提物，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，获得乙酸乙酯萃取物。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述溶解醇提物水的用量为药材质量的0.2～0.5倍，萃取用乙酸乙酯的体积为溶解用水体积的1-4倍。

6.根据权利要求1至5任一项所述应用，其特征在于，所述杀线虫药物还包含农业或林业上可接受的药用辅料，制备成杀线虫制剂。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述制剂为液体剂、水乳剂、微乳剂、分散剂、悬浮剂、可湿性粉剂和颗粒剂。