CN111175489B - 磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学检测领域，具体涉及磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法。本发明利用固相有抗标签分子抗体的磁珠与表达标签分子(标签一)的免疫检查点分子蛋白固相到磁珠表面，该磁珠可与带有另外一标签分子(标签二)的免疫检查点分子的配体发生特异性结合，再利用生光物质(荧光或可见光)标记的标签二特异结合抗体对磁珠表面免疫检查点分子蛋白/配体分子蛋白复合物进行定量检测。当免疫检查点分子的阻断性抗体与固相有免疫检查点分子蛋白的磁珠及配体蛋白共存时，抗体的阻断活性与最终磁珠发光强度成反比，从而通过光强度检测实现对抗体阻断活性的定量分析。本磁珠方法操作简单，反应迅速，经济节约，节省时间。

Description

磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，具体涉及磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法。
背景技术
免疫检查点分子是存在于免疫系统中的一类分子，该类分子通过与其配体相互作用向免疫细胞内部传导共刺激或共抑制作用信号从而对免疫反应起到增强或抑制作用。免疫检查点分子与其配体的结合具有饱和性、高亲和性、专一性和可逆性等特征。在生理条件下，免疫检查点分子与其配体之间的结合不通过共价键介导，主要靠离子键、氢键、范德华力和疏水作用而相互结合。免疫检查点分子介导的免疫反应调控作用对于维持免疫稳态，抑制自身免疫反应发生起到重要的作用。同时也是癌症细胞发生免疫逃逸的重要机制。免疫检查点分子阻断性抗体是指对免疫检查点分子与其配体交联产生抑制作用的一类抗体。目前癌症临床实验或治疗中通过使用抑制性免疫检查点分子的阻断性抗体提高癌症病人体内癌症特异性免疫反应水平，从而产生癌症治疗作用。
从对免疫检查点分子蛋白与其配体分子蛋白结合效率和活性的影响上来讲：传统的功能性ELISA方法通过高蛋白结合活性的板孔表面与免疫检查点分子重组蛋白多个表位通过疏水基团间的物理吸附作用发生随机结合，这种结合会对免疫检查点分子和其配体分子间的结合产生以下两种不良影响：第一种由于随机结合的方向不可控制性一部分免疫检查点分子蛋白表面可与其配体结合的部位由于与孔板表面结合而无法与其配体分子蛋白结合而降低了免疫检查点分子与其配体分子间的结合效率；第二种为孔板表面与免疫检查点分子重组蛋白的强烈疏水作用结合会在一定程度上改变其空间构象从而使免疫检查点分子重组蛋白和其配体分子蛋白之间的结合活性会受到一定的影响。目前亟需一种快速、经济、有效地评价影响免疫检查点分子与其配体结合的阻断性抗体阻断活性的方法。
发明内容
针对上述问题本发明提供了磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，包括以下步骤：
步骤1，复苏磁珠：将磁珠容器中的磁珠与液相混合均匀振荡器涡旋剧烈震荡30秒，构成磁珠悬液；
步骤2，取1uL磁珠悬液放置于1.5mL微量离心管管底，然后加入1mL pH 值为7.4含有1mg/mL牛血清白蛋白BSA的0.01M磷酸缓冲盐溶液PBS混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；
步骤3，向步骤(2)保留磁珠的微量离心管中加入50uL pH值为7.4含有 1mg/mLBSA的0.01M PBS缓冲液BSA-PBS和0.25ug免疫检查点分子重组蛋白溶液，混匀后冰浴30min，每隔10min吹匀一次，冰浴完成后，再加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；
步骤4，向步骤(3)保留磁珠的微量离心管中加入1mL BSA-PBS缓冲液混和均匀，然后取1uL放置于新的1.5mL微量离心管管底，此时加入不同浓度的阻断性抗体或阻断性抗体的同型对照抗体至终体积为30uL的混合物，室温下放置10min；
步骤5，将步骤(4)中的混合物平均分为两份，15uL/份，一份加入5uL 与步骤3中所述免疫检查点分子重组蛋白相对应的免疫检查点分子配体蛋白，胞外部分与人IgG Fc部分融合表达的重组蛋白“免疫检查点分子配体-Fc重组蛋白”称为配体-Fc融合蛋白，即为配体-Fc融合蛋白组；另一份加入5ul的人IgG，最终反应体系体积为20uL，配体-Fc融合蛋白和人IgG终浓度均为1ug/mL，阻断性抗体及阻断性抗体的同型对照抗体终浓度为1ug/mL、0.5ug/mL、0.25 ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0312ug/mL、0.0156ug/mL及0ug/mL，室温下放置20min，即为人IgG组；
步骤6，向步骤(5)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1 mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；再在微量离心管内加入1mL BSA-PBS缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
步骤7，在步骤(6)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入 90uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，再加入“生光物质”标记的抗人IgG-Fc抗体，冰浴30min；
步骤8，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算。
进一步，所述步骤(1)中的磁珠上固相有一号标签，步骤(3)免疫检查点重组蛋白溶液中的免疫检查点重组蛋白上带有二号标签，一号标签与二号标签可以发生特异性结合，应匹配使用；
所述一号标签为抗多聚组氨酸标签His-tag的抗体，相匹配的二号标签为6 个连续组氨酸组成的多聚组氨酸标签His-tag；
所述一号标签为亲和素Avidin或是链霉亲和素Streptavidin或者是抗生物素蛋白，相匹配的二号标签为生物素化的、由15个氨基酸GLNDIFEAQKIEWHE 组成的AviTag标签；
所述一号标签为抗Flag标签的抗体，相匹配的二号标签为由8个氨基酸 DYKDDDDK组成的Flag标签蛋白；
所述一号标签为抗c-Myc标签的抗体，相匹配的二号标签为由11个氨基酸EQKLISEEDL组成的c-Myc标签；
所述一号标签为抗HA标签的抗体，相匹配的二号标签为由9个氨基酸 YPYDVPDYA组成的HA标签。
进一步，所述步骤(3)中免疫检查点分子重组蛋白溶液包括但不局限于表 1中所列免疫检查点分子中任意一种；所述步骤(5)中配体蛋白包括但不局限于表1中所列配体分子中任意一种；免疫检查点分子及与其进行配对使用的配体分子列于表1，
表1
Figure BDA0002355239070000041
Figure BDA0002355239070000051
。
进一步，所述步骤7中生光物质分为三种：
第一种为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点；
第二种为萤火虫荧光素酶；
第三种为底物是TMB的辣根过氧化物酶HRP或底物为pNNP的碱性磷酸酶ALP。
再进一步，所述生光物质为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点，具体见表2，
表2
Figure BDA0002355239070000052
Figure BDA0002355239070000061
。
进一步，所述步骤8生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算的具体方法为：生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法根据生光物质的不同分为三种：
第一种，生光物质为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点时，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法为：
对权利要求1中步骤(7)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mLBSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠中分别加入200uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，并转移到流式管中，用流式细胞仪检测；
流式细胞仪检测方法：对于流式细胞术分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品做为荧光阴性染色磁珠对照，在流式数据分析时以以荧光阴性染色磁珠群为参考画出分析荧光阳性染色磁珠群的门以定量分析荧光阳性染色磁珠群；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc 重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平最为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；
待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率/抗体同型对照抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率)x 100％；
第二种，生光物质为萤火虫荧光素酶，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法为：
对权利要求1中步骤(7)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mLBSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠加入50uL pH为7.4含有1mg/mL BSA、1mM CaCl2及0.5mM MgCl2的杜氏磷酸盐缓冲液D-PBS重悬磁珠，并把磁珠悬液转移到白色96孔板孔中，后向磁珠悬液中加入50uL Britelite plus荧光素底物液(BritelitePlus Reporter Gene Assay System，Perkin Elmer,Waltham,Massachusetts)并混匀，室温下放置5min后，用荧光素读板机进行读板检测；
荧光素读板机进行读板检测方法：对于荧光素读板机分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品为荧光背景阴性对照；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平最为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；
待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–(抗体处理样品荧光读数-IgG处理样品荧光背景)/(抗体同型对照抗体处理样品荧光读数-IgG处理样品荧光背景))x 100％；
第三种，生光物质为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法为：
在权利要求1中步骤(7)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mLBSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠加入100uL对于HRP 为生光物质的TMB底物液或对于ALP为生光物质的PNPP底物液，重悬磁珠，并把磁珠液转入普通96孔酶标板孔中，室温下放置15min，向反应孔中加入100 uL 2M H2SO4或100uL 0.75M NaOH对反应进行终止；把酶标板放入酶标仪中进行读板检测；
酶标仪读板检测方法：对于酶标仪分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品为可见光背景阴性对照；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平最为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；
待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–(抗体处理样品光读数-IgG处理样品光读数)/(抗体同型对照抗体处理样品光读数-IgG处理样品光读数))x100％。
本发明利用固相有抗标签分子的抗体或是链霉亲和素的磁珠与表达标签分子(标签一)的免疫检查点分子蛋白特异结合的原理把待测的免疫检查点分子蛋白固相到磁珠表面，该磁珠可与带有另外一标签分子(标签二)的免疫检查点分子的配体分子发生特异性结合，再利用生光物质(荧光或可见光)标记的标签二特异结合抗体对磁珠表面免疫检查点分子蛋白/配体分子蛋白复合物进行标记，最后利用荧光或可见光检测系统对免疫检查点分子/配体分子蛋白复合物的数量进行分析。当评价待测抗体是否有阻断免疫检查点分子蛋白与其配体分子蛋白结合活性的时候，把固相有免疫检查点分子的磁珠与带有标签二的免疫检查点分子配体及待测抗体或待测抗体的同型对照抗体共同孵育，因为待测抗体的同型对照抗体没有阻断免疫检查点分子与其配体分子结合的活性，所以这种条件下免疫检查点分子与其配体分子在磁珠上会很好的结合；如果待测抗体有阻断该免疫检查点分子与其配体结合的活性，那么配体分子将会减少与固相在磁珠表面免疫检查点分子的结合。当用生光物质标记的抗标签二的抗体去检测磁珠表面免疫检查点分子/配体复合物数量的时候，如果待测抗体样品有阻断作用，那么该抗体处理样品与同型对照抗体处理样品相比其发光的强度将显著降低；如果待测抗体样品无阻断作用，那么该抗体处理样品与同型对照抗体处理样品相比其发光强度将无显著不同。利用本检测原理可对具有阻断作用的抗体进行阻断活性滴定，从而确定该抗体的阻断活性效价。
本磁珠检测方法在于将免疫检查点分子蛋白固相到磁珠上是非共价结合，基本既不改变蛋白的天然构象也不遮蔽免疫检查点分子和其配体分子结合的位点达到模拟免疫检查点分子蛋白在细胞表面自然表达的状态；本磁珠方法操作简单，反应迅速，仅需3-4小时即可完成一次实验，较短时间内就可达到实验目的；很大程度上节约免疫检查点分子蛋白和其配体分子蛋白的用量；磁珠具备丰富的结合位点，加强了免疫检查点分子蛋白与其配体蛋白的特异性结合；更重要的是本方法可以达到经济节约，节省时间的目的。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明磁珠方法免疫检查点分子重组蛋白只通过N端或C端融合表达的小分子量标签与磁珠表面的该标签特异性抗体或受体相互结合而固相到磁珠表面，免疫检查点分子重组蛋白与磁珠表面理论上不发生吸附，因此免疫检查点分子重组蛋白可以在天然构象状态下与其配体分子蛋白发生高效结合，从而可以更准确地评价阻断性抗体的活性。
本发明磁珠法响应速度快，方法简单，可显著减少操作时间；磁珠具有良好的分散性和重悬性，提高操作的便捷性；磁珠具备丰富的结合位点，加强了与免疫检查点分子的特异性结合；磁珠通过表面固相的抗标签抗体与免疫检查点蛋白分子融合表达的标签分子特异结合使免疫检查点分子蛋白较好的保持其生理构象，从而提高了实验结果的准确性。更重要的是本方法每次可使用很少数量的磁珠进行检测，从而可显著减少价格昂贵的免疫检查点分子和其配体分子重组蛋白的使用数量，检测成本显著减少，检测变得经济、可负担。
附图说明
图1为本发明磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法的原理图；
图2为本发明磁珠法所需包被免疫检查点蛋白量与ELISA方法所需包被免疫检查点蛋白量对比示意图；
图3为本发明磁珠方法评价TIGIT阻断性抗体的阻断活性对比图；
图4为以TIGIT稳定表达CHO细胞为评价方法对TIGIT阻断性抗体的阻断活性对比图。
具体实施方式
实施例1
以本发明方法对两个不同公司生产的免疫检查点分子TIGIT阻断性抗体的阻断活性进行比较：
本实施方案中所用重要材料如下：
表面固相有抗His-tag抗体的磁珠购自Thermofisher公司(货号：10103D)；
人TIGIT-his tag(简写：TIGIT-his)真核表达重组蛋白和人CD155-Fc真核表达重组蛋白均购自R&D systems公司(货号分别为：9525-TG050和9174-CD-050)；
小鼠抗人TIGIT单克隆抗体分别产自B和I公司，抗体克隆号分别为 A15153G和MBSA43；
AF647标记的山羊抗人IgG Fc抗体购自Jackson ImmunoResearch公司(货号：109-606-170)。
本实施方案操作步骤及结果：
步骤1，复苏抗多聚组氨酸标签的磁珠：将磁珠容器中的磁珠与液相混合均匀形成磁珠悬液；复苏的具体方法为：震荡器涡旋震荡>30s；
步骤2，取1uL磁珠悬液放置于1.5mL微量离心管中，然后加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；
步骤3，向步骤(2)保留磁珠的微量离心管中加入50uL BSA-PBS缓冲液和0.25ug带组氨酸标签的TIGIT蛋白溶液，混匀后冰浴30min，每隔10min 吹匀一次，冰浴完成后，再加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；
(4)向步骤(3)保留磁珠的微量离心管中加入1000uL BSA-PBS缓冲液混和均匀，分装1uL磁珠悬液于多个新的1.5mL微量离心管中，分别加入 BSA-PBS或加入以BSA-PBS稀释的不同浓度的B和I三家公司生产的TIGIT 阻断性抗体至各管终体积均为30uL的混合物，室温下放置10min；
(5)将步骤(4)中的混合物平均分为两份(15uL/份)，一份加入以BSA-PBS 稀释的5uL CD155-Fc(总剂量为20ng)至终浓度为1ug/mL作为样品组，另一份加入以BSA-PBS稀释的5uL人IgG至终浓度为1ug/mL作为同型对照组。在抗体处理各管中，TIGIT阻断性抗体及其同型对照抗体终浓度分别为1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0312ug/mL、0.0156ug/mL 及0ug/mL；室温下放置20min；
(6)向步骤(5)中的同型对照组和样品组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；再在微量离心管内加入1mL BSA-PBS缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
(7)在步骤(6)中的同型对照组和样品组中分别加入90uL pH为7.4含有1mg/mLBSA-PBS缓冲液混合均匀，再加入0.1ug Alexa Fluor 647(AF647)标记的goat anti-HumanFc Fragment Ab,混匀后冰浴处理30min；
(8)在步骤(7)中的同型对照组和样品组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，取出清液，保留磁珠；
(9)再在微量离心管内加入1mL BSA-PBS缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
(10)将步骤(9)中同型对照组和样品组中的磁珠中分别加入200uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，并转移到流式管中，用流式细胞仪检测；
(11)流式细胞术检测结果为：
B公司的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体在0ug/mL、0.0156ug/mL、0.0312 ug/mL、0.0625ug/mL、0.125ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL及1ug/mL浓度情况下三次实验AF647阳性磁珠的百分率(平均值±标准差)分别为58.57± 2.75％、51.55％±6.01、35.87％±14.61、11.51％±5.91、3.22％±1.86、2.79％± 1.74、2.56％±0.98及2.52％±1.71；
I公司的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体在0ug/mL、0.0156ug/mL、0.0312 ug/mL、0.0625ug/mL、0.125ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL及1ug/mL浓度情况下三次实验AF647阳性磁珠的百分率(平均值±标准差)分别为58.57％± 2.75、55.15％±6.86、49.13％±8.33、36.57％±19.80、9.36％±2.31、2.4％±0.89、 2.4％±0.88及1.88％±0.23。
由于预实验结果表明TIGIT与CD155-Fc在抗体同型对照抗体处理后荧光阳性磁珠百分率与BSA-PBS处理条件下荧光阳性磁珠百分率相同，所以在本实验中当计算抗体的阻断效率时以BSA-PBS条件下荧光阳性磁珠百分率代替抗体同型对照抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率。
B公司TIGIT抗体在0、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5及1ug/mL浓度情况下阻断效率分别为0％±0、19.69％±2.49、47.65％±4.41、72.78％±16.77、 84.07％±8.55、91.66％±3.38及95.41％±1.12，如图3A所示；
I公司TIGIT抗体在0、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5及1ug/mL浓度情况下阻断效率分别为0％±0、5.55％±2.37、19.44％±7.48、42.28％±3.07、 81.28％±10.91、87.58％±5.98及91.49％±3.85，如图3B所示。
根据以上这些数据利用第24版IBM SPSS Statistics数据编辑器可以计算出 B和I公司TIGIT抗体半数阻断(50％阻断)1ug/mL CD155-Fc与磁珠表面TIGIT 结合时的抗体浓度分别为0.037ug/mL及0.071ug/mL。这一数据表明当以本发明的磁珠方法为评价方法时B公司TIGIT阻断性抗体的阻断活性约为I公司 TIGIT阻断性抗体活性的两倍，与经典的细胞评价法结果相一致(图4)。因此本专利所建立的磁珠评价免疫检查点抗体阻断活性方法具有很好的检测准确性。
对比例1
以TIGIT稳定表达CHO细胞对两个不同公司生产的免疫检查点分子TIGIT 阻断性抗体的阻断活性进行比较
本实施方案中所用重要材料如下：
人CD155-Fc真核表达重组蛋白均购自R&D systems公司(货号分别为： 9525-TG050和9174-CD-050)；
小鼠抗人TIGIT单克隆抗体分别产自B和I公司，抗体克隆号分别为 A15153G和MBSA43；
AF647标记的山羊抗人IgG Fc抗体购自Jackson ImmunoResearch公司(货号：109-606-170)；
本实施方案操作步骤及结果：
(1)对25cm2细胞培养瓶内的TIGIT稳定表达CHO细胞(TIGIT+CHO 细胞)以PBS缓冲液润洗一次，洗去残留细胞培养基，向瓶内加入3mL含有 0.5M EDTA的PBS缓冲液(Versense液)，将培养瓶置于摇床的冰盒上，慢摇 10min；
(2)用移液管轻吹瓶内细胞，把TIGIT+CHO细胞从培养瓶表面吹起并吹散成单细胞悬液。1200r/min离心5min，去上清后嗑散细胞沉淀；
(3)以2mL BSA-PBS缓冲液重悬细胞，细胞计数，以BSA-PBS缓冲液稀释细胞悬液密度至1x106细胞/mL，以100uL细胞悬液(含10万细胞)/管把细胞悬液分装到5mL流式上样管中；
(4)对流式管内细胞悬液加入BSA-PBS缓冲液或加入以BSA-PBS缓冲液稀释的与磁珠评价方法相同的B及I三家公司生产的不同浓度TIGIT阻断性抗体至终体积110uL，室温下放置10min；
(5)把处理后的细胞液平均分成两份(55uL/份)加入5mL流式上样管，一份加入5uLCD155-FC稀释液至终浓度为1ug/mL作为样品组另一份加入5 uL人IgG稀释液至终浓度为1ug/mL作为空白对照组。在抗体处理各管中，TIGIT 阻断性抗体及其同型对照抗体终浓度分别为1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、 0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0312ug/mL及0ug/mL；室温下放置20min；
(6)在步骤(5)中的同型对照组和样品组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀,1200r/min，离心5min；快速弃去上清，磕散细胞沉淀；
(7)重复步骤(6)；
(8)在步骤(7)中的同型对照组和样品组中分别加入90uL PH为7.4含有1mg/mLBSA磷酸盐缓冲液混合均匀，再加入0.1ug AF647标记的山羊抗人 IgG Fc抗体，冰浴30min；
(9)在步骤(8)中的同型对照组和样品组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，1200r/min，离心5min；快速弃去上清，磕散细胞沉淀；
(10)重复步骤(9)；
(11)将步骤(10)中同型对照组和样品组中的磁珠中分别加入200uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，并转移到流式管中，用流式细胞仪检测；
(12)流式细胞术检测结果为：
B公司的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体在0、0.0312、0.0625、0.125、0.25、 0.5及1ug/mL浓度情况下三次实验AF647阳性细胞的百分率(平均值±标准差) 分别为75.03％±5.00、60.3％±0.53、39.63％±10.10、21.57％±8.32、12.58％± 8.86、6.14％±2.13及3.39％±0.62；
I公司的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体在0、0.0312、0.0625、0.125、0.25、 0.5及1ug/mL浓度情况下AF647阳性细胞的百分率分别为75.77％±10.28、 71.4％±8.05、60.53％±3.35、30.3％±6.5、13.43％±5.70、9.04％±3.20及6.25％±2.36。
由于预实验结果表明细胞表面稳定表达的TIGIT与CD155-Fc在抗体同型对照抗体处理后荧光阳性细胞百分率与BSA-PBS条件下荧光阳性细胞百分率相同，所以在本实验中当计算抗体的阻断效率时以BSA-PBS条件下荧光阳性细胞百分率代替抗体同型对照抗体处理样品所得荧光阳性细胞百分率。
那么B公司TIGIT抗体在0ug/mL、0.0312ug/mL、0.0625ug/mL、0.125 ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL及1ug/mL浓度情况下阻断效率分别为0％±0、 19.69％±2.49、47.65％±4.41、72.78％±16.77、84.07％±8.55、91.66％±3.38 及95.41％±1.12，如图4A所示；
I公司TIGIT抗体在0ug/mL、0.0312ug/mL、0.0625ug/mL、0.125ug/mL、 0.25ug/mL、0.5ug/mL及1ug/mL浓度情况下阻断效率分别为0％±0、5.55％± 2.37、19.44％±7.48、42.28％±3.07、81.28％±10.91、87.58％±5.98及91.49％±3.85，如图4B所示。
根据以上这些数据利用第24版IBM SPSS Statistics数据编辑器可以计算出 B和I公司TIGIT抗体半数阻断(50％阻断)1ug/mL CD155-Fc与TIGIT-CHO 细胞表面TIGIT结合时的抗体浓度分别为0.073ug/mL及0.147ug/mL。这一数据表明当以TIGIT稳定表达的CHO细胞为评价方法时B公司TIGIT阻断性抗体的阻断活性约为I公司TIGIT阻断性抗体活性的两倍。
对比例2
传统的功能性ELISA方法一次实验从免疫检查点分子重组蛋白过夜包被在 96孔板上，到板孔非特异性结合封闭、加入阻断性抗体阻断免疫检查点分子蛋白与其配体分子蛋白结合、结合二抗到最后进行显色需要耗时约18-20小时，一次试验周期长；对于构建稳定表达免疫检查点分子的细胞系，从构建免疫检查点分子表达质粒载体，到纯化、扩增出免疫检查点分子稳定表达的细胞系约需要1-2个月，实验周期太长。而本磁珠方法仅需3-4小时即可完成一次实验，在较短时间就可达到实验目的。
根据R&D公司以功能性ELISA方法评价免疫检查点分子TIGIT-his真核表达重组蛋白与其配体分子蛋白CD155-Fc结合活性 (https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-tigit-his-tag-protein-cf _9525-tg)，以0.25ug TIGIT-his重组蛋白对96孔酶标板的1个孔进行包被，一支TIGIT-his重组蛋白剂量为50ug,价格为3500元。
那么该重组蛋白理论上可以包被200个孔，进行200次检测反应。平均每个反应所用的TIGIT-his重组蛋白成本为17.5元；以100ng CD155-Fc重组蛋白 /孔与TIGIT-his进行结合反应，一支CD155-Fc重组蛋白剂量也为50ug,价格为 3500元。那么一支该重组蛋白可以进行500次，平均每个反应所用的CD155-Fc 重组蛋白成本为7元/反应。那么功能ELISA方法每个反应的TIGIT-his重组蛋白和CD155-Fc重组蛋白成本总计为24.5元。对阻断性抗体进行功能评价时，以8个不同浓度的抗体(包括无抗体的阴性对照孔)对每个反应孔进行共处理，每个浓度重复3次，那么总计需要24个反应完成一次抗体阻断活性评价，总计 TIGIT-his和CD155-Fc的成本为24.5元/反应x24个反应为588元。
如图2所示，对于本专利所建立的磁珠评价法，所用磁珠样品的密度为1x107磁珠/uL。由于所用磁珠直径为1um,每个磁珠的表面积非常小，所以0.25ug TIGIT-his重组蛋白可以有效对1x107个磁珠进行标记。当流式细胞分析术以磁珠为样品进行分析，10000个磁珠即可进行一次检测，那么每0.25ug TIGIT-his 重组蛋白所包被的磁珠可进行1000次反应，每个反应的成本为功能ELISA反应的1/1000，即1.75分钱；CD155-Fc重组蛋白与固相在磁珠上的TIGIT-his进行结合反应时，需要20ng的剂量即可对10000个磁珠实现饱和结合，那么磁珠法每个检测反应所需CD155-Fc重组蛋白的成本为1.4元。所以磁珠法进行每个检测反应所需TIGIT-his和CD155-Fc重组蛋白的成本总计为1.42元，完成一次抗体阻断活性评价实验24次反应所需两种重组蛋白的成本只需34.1元。为ELISA 方法成本的1/17,所以从经济性来讲比经典的ELISA方法也显著提高。
上述内容对实施例做了详细的说明，但本发明不受上述实施方式和实施例的限制，在不脱离本发明宗旨的前提下，在本领域技术人员所具备的知识范围内还可以对其进行各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明要保护的范围之内。

Claims (2)

1.磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，复苏磁珠：将磁珠容器中的磁珠与液相混合均匀振荡器涡旋剧烈震荡30秒，构成磁珠悬液；
步骤2，取1uL磁珠悬液放置于1.5mL微量离心管管底，然后加入1mL pH值为7.4含有1mg/mL BSA的0.01M PBS混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；
步骤3，向步骤2保留磁珠的微量离心管中加入50uL pH值为7.4含有1mg/mL BSA的0.01M PBS缓冲液BSA-PBS和0.25ug免疫检查点分子重组蛋白溶液，混匀后冰浴30min，每隔10min吹匀一次，冰浴完成后，再加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；
步骤4，向步骤3保留磁珠的微量离心管中加入1mL BSA-PBS缓冲液混和均匀，然后取1uL放置于新的1.5mL微量离心管管底，此时加入不同浓度的阻断性抗体或阻断性抗体的同型对照抗体至终体积为30uL的混合物，室温下放置10min；
步骤5，将步骤4中的混合物平均分为两份，15uL/份，一份加入5uL与步骤3中所述免疫检查点分子重组蛋白相对应的免疫检查点分子配体蛋白，胞外部分与人IgG Fc部分融合表达的重组蛋白“免疫检查点分子配体-Fc重组蛋白”称为配体-Fc融合蛋白，即为配体-Fc融合蛋白组；另一份加入5uL的人IgG，即为人IgG组，最终反应体系体积为20uL，配体-Fc融合蛋白和人IgG终浓度均为1ug/mL，阻断性抗体及阻断性抗体的同型对照抗体终浓度为1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0312ug/mL、0.0156ug/mL及0ug/mL，室温下放置20min；
步骤6，向步骤5处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；再在微量离心管内加入1mL BSA-PBS缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
步骤7，在步骤6处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入90uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，再加入“生光物质”标记的抗人IgG-Fc抗体，冰浴30min；
步骤8，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算；
所述步骤1中的磁珠上固相有一号标签，步骤3免疫检查点重组蛋白溶液中的免疫检查点重组蛋白上带有二号标签，一号标签与二号标签可以发生特异性结合，应匹配使用；
所述一号标签为抗多聚组氨酸标签His-tag的抗体，相匹配的二号标签为6个连续组氨酸组成的多聚组氨酸标签His-tag；或所述一号标签为亲和素Avidin或是链霉亲和素Streptavidin或者是抗生物素蛋白，相匹配的二号标签为生物素化的、由15个氨基酸GLNDIFEAQKIEWHE组成的AviTag标签；或所述一号标签为抗Flag标签的抗体，相匹配的二号标签为由8个氨基酸DYKDDDDK组成的Flag标签蛋白；或所述一号标签为抗c-Myc标签的抗体，相匹配的二号标签为由11个氨基酸EQKLISEEDL组成的c-Myc标签；或所述一号标签为抗HA标签的抗体，相匹配的二号标签为由9个氨基酸YPYDVPDYA组成的HA标签；
所述步骤1磁珠悬液中的磁珠直径为1um，密度为1x107磁珠/uL；
所述步骤3中免疫检查点分子重组蛋白溶液为免疫检查点分子TIGIT；所述步骤5中配体蛋白为配体分子CD155；
所述步骤8生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算的具体方法为：对步骤7处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；
对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠中分别加入200uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，并转移到流式管中，用流式细胞仪检测；
流式细胞仪检测方法：对于流式细胞术分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品做为荧光阴性染色磁珠对照，在流式数据分析时以荧光阴性染色磁珠群为参考画出分析荧光阳性染色磁珠群的门以定量分析荧光阳性染色磁珠群；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；
待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率/抗体同型对照抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率)x 100％。
2.根据权利要求1所述的磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：所述步骤7中生光物质为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点，生光物质选自表2所列物质的任意一种，
表2
Figure FDA0002892464430000031
Figure FDA0002892464430000041
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