TWI832129B - 多重分析物的檢測方法 - Google Patents

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Abstract

一種多重分析物的檢測方法包括以下步驟：提供微米粒子。微米粒子耦合有至少一種第一配體，且包括本體以及形成於本體的表面的多個第一突起物。接著，將微米粒子與多種待分析物混合，以形成第一複合物。爾後，將第一複合物與帶有多種標記的多種第二配體混合，以使多種第二配體結合至第一複合物中的多種待分析物並形成第二複合物。最後，對第二複合物中的多種第二配體的多種標記進行檢測。

Description

多重分析物的檢測方法
本揭露是關於一種分析物的檢測方法，且特別是關於一種多重分析物的檢測方法。
配體結合分析法(Ligand binding assay)是一種依賴配體分子與分析物的親和結合的檢測方法，其中酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是最廣為使用的檢測方法。傳統的ELISA是利用抗體與抗原專一性結合的特性，配合酵素反應來進行檢測，技術發展已相當成熟。然而，ELISA的缺點是檢測時間冗長且一個反應僅能檢測一種分析物。
目前，市場上應用於多重蛋白免疫檢測的產品是以傳統的三明治法為基礎，先利用帶有不同顏色的圓球狀微米粒子與抗體耦合，接著使耦合有抗體的圓球狀微米粒子結合至標的抗原，再利用帶有特定螢光標記的偵測抗體結合至待分析抗原，並以流式細胞儀來進行分析，進而達到多重蛋白檢測的目的。然而，上述多重蛋白免疫檢測仍具有以下缺點：需使用多種螢光顏色的微 米粒子、檢測前需針對不同螢光顏色的微米粒子設定螢光圖譜、且操作時需區分不同標記的粒子再進行訊號分析，整體而言檢測時間冗長且操作繁複，容易造成誤差。
因此，亟待開發一可同時針對多重分析物進行分析且操作方便、檢測靈敏度高的檢測方法。
本揭露提供一種多重分析物的檢測方法，可具有提高檢測靈敏度的效果。
本揭露的多重分析物的檢測方法包括以下步驟。提供微米粒子。微米粒子耦合有至少一種第一配體，且包括本體以及形成於本體的表面的多個第一突起物。接著，將微米粒子與包括有多種待分析物的樣品混合，以形成第一複合物。爾後，將第一複合物與帶有多種第一標記的多種第二配體混合，以使多種第二配體結合至第一複合物中的多種待分析物並形成第二複合物。最後，對第二複合物中的多種第一標記進行檢測。
在本揭露的一實施例中，上述的微米粒子為多突狀微粒。多突狀微粒的本體由內而外包括共聚物核心、高分子層以及矽基層。共聚物核心的表面形成有多個第二突起物。多個第二突起物的平均高度為100奈米至5000奈米。
在本揭露的一實施例中，上述的微米粒子為多突狀磁性微粒。多突狀磁性微粒的本體由內而外包括共聚物核心、高分子 層、磁性物質層以及矽基層。共聚物核心的表面形成有多個第二突起物。多個第二突起物的平均高度為100奈米至5000奈米。
在本揭露的一實施例中，上述的多個第一突起物的平均高度與本體的平均粒徑的比值為0.005至0.25。
在本揭露的一實施例中，上述的多個第一突起物的平均體積與本體的平均體積的比值為1x10-7至2x10-2。
在本揭露的一實施例中，上述的多個第一突起物的總體積占所述微米粒子整體體積的10-1至6x10-1。
在本揭露的一實施例中，上述的多個第一突起物的平均數量為5至500。
在本揭露的一實施例中，上述的微米粒子的平均粒徑為1微米至20微米。
在本揭露的一實施例中，上述的微米粒子為非圓球形。
在本揭露的一實施例中，上述的至少一種第一配體耦合至微米粒子的方式包括非共價鍵結、共價鍵結、親和素-生物素作用、靜電吸附作用、疏水性吸附作用或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的多種待分析物位於樣品的表面。上述形成第一複合物的方式包括：使至少一種第一配體辨識並直接結合至位於樣品的表面的標的物。
在本揭露的一實施例中，上述的至少一種第一配體包括第一特異性抗體。第一特異性抗體包括抗人類外泌體表面抗原抗體、抗人類血液細胞表面抗原抗體、抗人類免疫細胞表面抗原抗 體、抗人類腫瘤細胞表面抗原抗體或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的樣品包括人類外泌體、人類血液細胞、人類免疫細胞、人類腫瘤細胞或前述之組合。多種待分析物包括人類外泌體的表面抗原、人類血液細胞的表面抗原、人類免疫細胞的表面抗原、人類腫瘤細胞的表面抗原或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的多種第二配體包括多種第二特異性抗體。所述多種第二特異性抗體包括抗人類外泌體表面抗原抗體、抗人類血液細胞表面抗原抗體、抗人類免疫細胞表面抗原抗體、抗人類腫瘤細胞表面抗原抗體或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的至少一種第一配體包括多種第一配體。上述形成所述第一複合物的方式包括：使多種第一配體辨識並直接結合多種待分析物。
在本揭露的一實施例中，上述的多種第一配體包括多種核酸探針。多種核酸探針包括多種引子(primer)或適體(aptamer)。
在本揭露的一實施例中，上述的多種待分析物包括帶有多種第二標記的多種核酸序列。
在本揭露的一實施例中，上述的多種第二標記包括生物素(biotin)、多種抗原區域或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的多種第二配體包括特異性蛋白。特異性蛋白包括抗生物素抗體、親和素、鏈黴親和素、中和親和素、第三特異性抗體或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的多種第一標記包括多種螢光標記或多種冷光標記。
在本揭露的一實施例中，上述的多種螢光標記包括FITC、Alexa、PE、BV、PerCP、APC、Pacific Blue或前述之組合。上述的多種冷光標記包括螢光素酶(Luciferase)。
本揭露的多重分析物的檢測方法包括以下步驟。提供微米粒子。微米粒子耦合有至少多種配體，且包括本體以及形成於本體的表面的多個突起物。接著，將微米粒子與包括有多種待分析物的樣品混合，以形成複合物，其中多種待分析物帶有多種標記。最後，對複合物中的多種標記進行檢測。
在本揭露的一實施例中，上述的多種配體包括多種核酸探針。上述的多種標記包括多種螢光標記或多種冷光標記或前述之組合。上述的多種待分析物包括多種核酸序列。
基於上述，本揭露的微米粒子可藉由將形狀不規則的多個第一突起物配置於本體的表面，因而增加了微米粒子的表面積(即本體的表面積與第一突起物的表面積的總和)。藉此，可使微米粒子耦合較多的第一配體，以辨識並結合較多的標的物，進而能增強偵測訊號以提高檢測的靈敏度。
為讓本揭露的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
110:微米粒子
110a:多突狀微粒
110b:多突狀磁性微粒
113:共聚物核心
114:高分子層
115:矽基層
111:本體
111a、113a、S1:表面
112:第一突起物
113b:第二突起物
120:第一配體
13a:表面抗原
130a、130b、130c:待分析物
131a、131b、131c:序列部分
132a、132b、132c:第二標記
140:第一複合物
150a、150b、150c:第二配體
151a、151b、151c:第一標記
160:第二複合物
H1、H2:平均高度
S:樣品
T:標的物
S10、S20、S30、S40:步驟
D、D1:平均粒徑
D2:最短粒徑
D3:最長粒徑
V1、V2:平均體積
圖1為本揭露一實施例的多重分析物的檢測方法的流程圖。
圖2為本揭露一實施例的多重分析物的檢測方法的流程示意圖。
圖3A為本揭露一實施例的多突狀微粒的剖面示意圖。
圖3B為本揭露一實施例的多突狀磁性微粒的剖面示意圖。
圖4為本揭露另一實施例的多重分析物的檢測方法的流程示意圖。
圖5A至圖5F為分別利用掃描式電子顯微鏡以及粒徑分析儀分析圓球狀微米粒子或多突狀微粒的規格。
圖6A至圖6F為分別使用耦合有Anti-Human CD63的比較例1~3與實例1、3~4來檢測SKBr3的外泌體的CD9的表現量。
圖6G至圖6L為分別使用耦合有Anti-Human CD9的比較例1~3與實例1、3~4來檢測SKBr3的外泌體的CD9的表現量。
圖7A至圖7C為分別使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在不同溶液中的SKBr3的外泌體的CD9的表現量。
圖8A至圖8C為分別使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在不同溶液中的SKBr3的外泌體的CD81的表現量。
圖9A至圖9D為使用耦合有Anti-Human CD9的實例2來同時檢測SKBr3的外泌體的CD9、CD29、CD63以及CD81中的任三者的表現量。
圖10A至圖10D為使用耦合有Anti-Human Her2的實例2來同時檢測SKBr3的外泌體的CD9、CD29、CD63以及CD81中的任三者的表現量。
圖11A至圖11D為分別使用耦合有不同的第一特異性抗體的實例2來同時檢測臨床檢體中的外泌體的CD9與CD63的表現量。
圖12A至圖12B為分別使用耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒來檢測標記有生物素的AB待分析核酸或標記有生物素的AIV待分析核酸。
圖1為本揭露一實施例的多重分析物的檢測方法的流程圖。圖2為本揭露一實施例的多重分析物的檢測方法的流程示意圖。圖3A為本揭露一實施例的多突狀微粒的剖面示意圖。圖3B為本揭露一實施例的多突狀磁性微粒的剖面示意圖。
請同時參照圖1、圖2、圖3A以及圖3B，首先，進行步驟S10，提供微米粒子110。在本實施例中，微米粒子110包括本體111以及形成於本體111的表面111a的多個第一突起物112，因此微米粒子110為非圓球形。以外型觀之，多個第一突起物112呈不規則狀，且可以是均勻或不均勻地散布於本體111的表面111a。實質上，多個第一突起物112與本體111為一體成形，且多個第一突起物112與本體111之間為無縫連接。在本實施例中，多個第一突起物112具有平均高度H1(即多個第一突起物112的 頂端至本體111的表面111a的平均垂直距離)。
具體來說，請同時參照圖2、圖3A與圖3B，在本實施例中，微米粒子110可以為多突狀微粒110a或多突狀磁性微粒110b，其中，多突狀微粒110a不具有磁性，而多突狀磁性微粒110b具有磁性。如圖3A所示，多突狀微粒110a的本體111由內而外包括共聚物核心113、高分子層114以及矽基層115。共聚物核心113的表面113a形成有多個第二突起物113b。多個第二突起物113b呈不規則狀，且可以是均勻地或不均勻地散布在共聚物核心113的表面113a上。實質上，多個第二突起物113b與共聚物核心113為一體成形，且多個第二突起物113b與共聚物核心113之間為無縫連接。在本實施例中，多個第二突起物113b的平均高度H2(即多個第二突起物113b的頂端至共聚物核心113的表面113a的平均垂直距離)可為100奈米(nm)至5000奈米，例如約200奈米至4500奈米、約500奈米至4000奈米、約800奈米至3500奈米、約300奈米至1000奈米、約600奈米至1800奈米、約750奈米至2500奈米、約900奈米至3000奈米、約1000奈米至3600奈米、約1500奈米至4800奈米等，但不以此為限。在本實施例中，高分子層114與矽基層115大致上以共形的方式依序形成於共聚物核心113上。因此，多突狀微粒110a的多個第一突起物112可基本上對應於共聚物核心113的多個第二突起物113b設置，但不以此為限。
如圖3B所示，多突狀磁性微粒110b的本體111由內而 外包括共聚物核心113、高分子層114、磁性物質層116以及矽基層115。其中，共聚物核心113的表面113a形成有多個第二突起物113b。多個第二突起物113b呈不規則狀，且可以是均勻地或不均勻地散布在共聚物核心113的表面113a上。實質上，多個第二突起物113b與共聚物核心113為一體成形，且多個第二突起物113b與共聚物核心113之間為無縫連接。在本實施例中，多個第二突起物的平均高度H2可為100奈米至5000奈米，例如約200奈米至4500奈米、約500奈米至4000奈米、約800奈米至3500奈米、約300奈米至1000奈米、約600奈米至1800奈米、約750奈米至2500奈米、約900奈米至3000奈米、約1000奈米至3600奈米、約1500奈米至4800奈米等，但不以此為限。在本實施例中，高分子層114、磁性物質層116以及矽基層115大致上以共形的方式依序形成於共聚物核心113上。多突狀磁性微粒110b的多個第一突起物112可基本上對應於共聚物核心113的多個第二突起物113b設置，但不以此為限。
在本實施例中，共聚物核心113例如是苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物，但不以此為限。高分子層114可為經官能基團修飾(modification)的共聚物核心113的表面，且包括至少一官能基團(例如羧基、胺基或其組合，但不以此為限)。 矽基層115的材料可包括矽酸四甲酯(tetramethoxysilane,TMOS)、四乙氧基矽烷(tetraethoxysilane,TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基矽烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)、3-環氧丙氧丙基三甲氧基矽(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane,GOPTS)，但不以此為限。磁性物質層116的材料可包括順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、鐵氧體磁性材料或其組合，但不以此為限。
請再參照圖2、圖3A以及圖3B，在本實施例中，第一突起物112的平均高度H1可為0.1微米(μm)至5微米，例如約0.2微米至4.5微米、約0.3微米至4微米、約0.4微米至3.5微米、約0.5微米至3微米、約0.6微米至2.5微米等，但不以此為限。第一突起物112的平均體積V1可為0.00052立方微米(μm3)至65立方微米，例如約0.001立方微米至60立方微米、約0.01立方微米至50立方微米、約0.1立方微米至40立方微米等，但不以此為限。本體111的平均粒徑D1可為1微米(μm)至20微米，例如約2微米至15微米、約3微米至18微米、約4微米至10微米、約5微米至12微米等，但不以此為限。本體111的平均體積V2可為0.52立方微米(μm3)至4200立方微米，例如約1立方微米至4000立方微米、約10立方微米至3800立方微米、約20立方微米至3600立方微米、約30立方微米至3300立方微米、約40立方微米至2900立方微米、約50立方微米至2500立方微米、約60立方微米至2300立方微米、約80立方微米至2000立方微米、約100立方微米至1000立方微米等，但不以此為限。其中，第一 突起物112的平均高度H1與本體111的平均粒徑D1的比值可為0.005至0.25，例如約0.005至0.23、約0.05至0.20、約0.01至0.18、約0.05至0.15等，但不以此為限。第一突起物112的平均體積V1與本體111的平均體積V2的比值可為1x10-7至2x10-2，例如是1x10-6至1.5x10-2、1x10-5至1.2x10-2、1x10-5至1x10-2等，但不以此為限。微米粒子110的平均粒徑D(即微米粒子110的最短粒徑與最長粒徑的平均，例如，多突狀微粒110a或多突狀磁性微粒110b的最短粒徑D2與最長粒徑D3的平均)可為1微米至20微米，例如約2微米至18微米、約3微米至15微米、約5微米至10微米等，但不以此為限。
請再參照圖2，在本實施例中，微米粒子110耦合有至少一種第一配體120(圖1繪是示以一種第一配體為例，但不以此為限)。其中，第一配體120耦合至微米粒子110的本體111的表面111a以及第一突起物112上。第一配體120耦合至微米粒子110的方式包括非共價鍵結、共價鍵結、親和素-生物素作用、靜電吸附作用、疏水性吸附作用或前述之組合。在本實施例中，第一配體120例如是包括特異性抗體，但不以此為限。
接著，請再參照圖1與圖2，進行步驟S20，將微米粒子110與多種待分析物130a、130b、130c混合，以形成第一複合物140。在本實施例中，多種待分析物130a、130b、130c位於樣品S的表面S1。其中，形成第一複合物140的方式包括：使至少一種第一配體120辨識並直接結合至位於樣品S的表面S1的標的物T。
在本實施例中，第一配體120包括第一特異性抗體，具有辨識並直接結合至標的物T能力。第一特異性抗體包括抗人類外泌體表面抗原抗體(例如是Anti-Human CD9、Anti-Human CD63、Anti-Human CD29、Anti-Human CD81、Anti-Human Her2 Anti-Human EGFR、Anti-Human EpCAM等)、抗人類血液細胞表面抗原抗體(例如是Anti-Human CD45、Anti-Human CD235a等)、抗人類免疫細胞表面抗原抗體(例如是Anti-Human CD3、Anti-Human CD19等)、抗人類腫瘤細胞表面抗原抗體(例如是Anti-Human CEA、Anti-Human PD-L1、Anti-Human Her2等)或前述之組合，但不以此為限。
在本實施例中，樣品S包括人類外泌體(exosome)、人類血液細胞、人類免疫細胞、人類腫瘤細胞或前述之組合，但不以此為限。待分析物130a、130b、130c包括人類外泌體的表面抗原(例如是CD9、CD63、CD81、Her2、EGFR、EpCAM等)、人類血液細胞的表面抗原(例如是CD45、CD235a等)、人類免疫細胞的表面抗原(例如是CD3、CD19等)、人類腫瘤細胞的表面抗原(例如是CEA、PD-L1、Her2等)或前述之組合，但不以此為限。
在本實施例中，標的物T可以是人類外泌體表面抗原中的至少一種表面抗原、人類血液細胞的表面抗原中的至少一種表面抗原、人類免疫細胞的表面抗原中的至少一種表面抗原、人類腫瘤細胞的表面抗原中的至少一種表面抗原或前述之組合，但不 以此為限。標的物T可以是相同或不同於多種待分析物130a、130b、130c中的任一種。舉例來說，在一實施例中，標的物T例如是人類外泌體的表面抗原CD9，待分析物例如是人類外泌體的表面抗原CD9、CD63及CD81。在另一實施例中，標的物T例如是人類外泌體的表面抗原Her2，待分析物例如是人類外泌體的表面抗原CD9、CD63及CD81，但不以此為限。值得說明的是，即使標的物T與待分析物為同一種表面抗原，但標的物T與待分析物130a並不會是同一個表面抗原。舉例來說，如圖2所示，標的物T與待分析物130a為同一種表面抗原13a，其中被第一配體120辨認並結合的一部分即為標的物T，而未被第一配體120結合的另一部分，則可作為後續檢測之用的待分析物130a。
接著，進行步驟S30，將第一複合物140與帶有多種第一標記151a、151b、151c的多種第二配體150a、150b、150c混合，以使多種第二配體150a、150b、150c結合至第一複合物140中的多種待分析物130a、130b、130c並形成第二複合物160。為了清楚起見，圖2僅繪示出一個樣品S與一個第二配體(150a或150b或150c)結合。實際上，只要樣品S表面具有多種(或多個)待分析物130a、130b、130c，則樣品S可同時結合多種(或多個)第二配體150a、150b、150c。
在本實施例中，多種第二配體150a、150b、150c例如是多種第二特異性抗體。在本實施例中，多種第二特異性抗體包括抗人類外泌體表面抗原抗體、抗人類血液細胞表面抗原抗體、抗 人類免疫細胞表面抗原抗體、抗人類腫瘤細胞表面抗原抗體或前述之組合。其中，多種第二特異性抗體可相同或不同於第一特異性抗體。多種第一標記151a、151b、151c包括多種不同的螢光標記或冷光標記，但不以此為限。螢光標記可包括FITC、Alexa(例如是AF-488、AF-594、AF-647、AF-700等)、PE(例如是PE、PE-Cyanine5、PE-Cyanine7、PE-Dazzle594等)、PerCP(例如是PerCP、PerCP-Cyanine5.5等)、BV(Brilliant Violet，例如是BV421、BV450、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785等)、APC(例如是APC、APC-Cyanine7等)、Pacific Blue或前述之組合，但不以此為限。冷光標記包括螢光素酶(Luciferase)，但不以此為限。所屬技術領域具有通常知識者，可依實際需求(例如樣品來源或待分析物的數量)，對第一配體、第一標記以及第二配體進行選擇，本揭露對此並不加以限制。
最後，進行步驟S40，對第二複合物160中的多種第二配體150a、150b、150c的多種第一標記151a、151b、151c進行檢測。檢測結果可代表待分析物130a、130b、130c於樣品S的表面S1上的相對含量(或表現量)。在本實施例中，例如是使用流式細胞儀(flow cytometry)來進行檢測，但不以此為限。至此，已大致上執行完成本實施例的多重分析物的檢測方法。
在本實施例中，相較於一般的圓球狀微米粒子，本實施例的微米粒子110可藉由將形狀不規則的多個第一突起物設置於本體的表面，因而增加了微米粒子110的表面積(即本體的表面 積與第一突起物的表面積的總和)。藉此，可使本實施例的微米粒子110可耦合較多的第一配體120，以辨識並結合較多的標的物T，進而能增強偵測訊號以提高檢測的靈敏度。
此外，由於本實施例的多突狀磁性微粒110b的磁性物質層116的表面為粗糙表面(或具有小突起)，因而使得多突狀磁性微粒110b的表面(即本體111的表面111a與第一突起物112的表面)也為粗糙表面。接著，相較於多突狀微粒110a，由於多突狀磁性微粒110b的表面為粗糙表面，因而使得多突狀磁性微粒110b可具有更多的表面積，進而使得多突狀磁性微粒110b可耦合更多的第一配體120，辨識與結合更多的標的物T，並偵測更多的待分析物130a、130b、130c，進而能增強偵測訊號並提高檢測的靈敏度。另外，由於多突狀磁性微粒110b具有磁性，因而能縮短檢測的時間，並提升檢測的效率及便利性。
以下將列舉其他實施例以作為說明。在此必須說明的是，下述實施例沿用前述實施例的元件標號與部分內容，其中採用相同的標號來表示相同或近似的元件，並且省略了相同技術內容的說明。關於省略部分的說明可參考前述實施例，下述實施例不再重複贅述。
圖4為本揭露另一實施例的多重分析物的檢測方法的流程示意圖。請同時參照圖2與圖4，本實施例的方法與圖2中的方法相似，惟二者主要差異之處在於：至少一種第一配體120包括多種第一配體120a、120b、120c，且多種第一配體120a、120b、 120c例如是多種核酸探針(例如是多種引子或適體)。多種待分析物130a、130b、130c包括帶有多種第二標記132a、132b、132c(例如是生物素(biotin)、抗原區域或前述之組合，但不以此為限)的多種核酸序列。多種第二配體150a、150b、150c包括特異性蛋白(例如是抗生物素抗體(anti-biotin antibody)、親和素(avidin)、鏈黴親和素(strepavidin)、中和親和素(neutravidin)、第三特異性抗體或前述之組合，但不以此為限)。
具體來說，請參照圖4，先將耦合有多種第一配體120a、120b、120c的微米粒子110與多種待分析物130a、130b、130c混合，以使多種第一配體120a、120b、120c辨識並直接結合至對應的(或序列互補的)多種待分析物130a、130b、130c的序列部分131a、131b、131c，並形成第一複合物140。接著，將第一複合物140與帶有多種第一標記151a、151b、151c的多種第二配體150a、150b、150c混合，以使多種第二配體150a、150b、150c結合至第一複合物140中的多種待分析物130a、130b、130c的第二標記132a、132b、132c，並形成第二複合物160。最後，對第二複合物160中的多種第二配體150a、150b、150c的多種第一標記151a、151b、151c進行檢測。
此外，在另一些實施例中，第二標記132a、132b、132c也可以是第一標記151a、151b、151c。如此一來，當第一配體120a、120b、120c與待分析物130a、130b、130c的序列部分131a、131b、131c結合後，所形成的第一複合物140即帶有多種螢光標記或多 種冷光標記，因此可直接進行檢測，而不需再加入第二配體以形成第二複合物。至此，已大致上執行完成本實施例的多重分析物的檢測方法。
以下將配合圖式及實施例，說明本發明為達成目的所採取的技術手段。然而，下列的實施例及配合的圖式僅是輔助說明，而並非用以限定本發明。
[實施例]
實施例1：多突狀微粒的規格分析
在本實施例中，利用掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)以及粒徑分析儀(Multisizer)分析一般的圓球狀微米粒子或多突狀微粒的規格，結果如圖5A至圖5F所示，其中，圖5A、圖5C與圖5F為分析圓球狀微米粒子的結果，圖5B、圖5D與圖5E則為分析多突狀微粒的結果。
由圖5A至圖5F可知，圖5A的圓球狀微米粒子的平均粒徑為約2.421微米、圖5B的多突狀微粒的平均粒徑為約3.280微米、圖5C的圓球狀微米粒子的平均粒徑為約4.541微米、圖5D的多突狀微粒的平均粒徑為約4.153微米、圖5E的圓球狀微米粒子的平均粒徑為約7.568微米以及圖5F的多突狀微粒的平均粒徑為約7.189微米。
接著，對圖5B、圖5D與圖5F的多突狀微粒的規格作進一步分析。詳細來說，在圖5B中，多突狀微粒的平均體積為約13.86立方微米，本體的平均粒徑為約2.5微米，本體的平均體積 為約6.14立方微米，第一突起物的平均高度為約1.2微米，第一突起物的平均體積為約0.679立方微米，第一突起物的總體積為7.72立方微米。也就是說，在圖5B的多突狀微粒中，第一突起物的平均高度與本體的平均粒徑的比值為約0.48，第一突起物的平均體積與本體的平均體積的比值為約0.111，每個多突狀微粒具有約11個第一突起物，且第一突起物的總體積為多突狀微粒的體積的55.7%。
在圖5D中，多突狀微粒的平均體積為約49.09立方微米，本體的平均粒徑為約4.5微米，本體的平均體積為約35.78立方微米，第一突起物的平均高度為約0.8微米，第一突起物的平均體積為約0.268立方微米，第一突起物的總體積為13.31立方微米，也就是說，在圖5D的多突狀微粒中，第一突起物的平均高度與本體的平均粒徑的比值為約0.18，第一突起物的平均體積與本體的平均體積的比值為約0.007，每個多突狀微粒具有約49個第一突起物，且第一突起物的總體積為多突狀微粒的體積的27.1%。
而在圖5F中，多突狀微粒的平均體積為約201立方微米，本體的平均粒徑為約7.5微米，本體的平均體積為約166立方微米，第一突起物的平均高度為約1微米，第一突起物的平均體積為約0.392立方微米，第一突起物的總體積為35立方微米，也就是說，在圖5F的多突狀微粒中，第一突起物的平均高度與本體的平均粒徑的比值為約0.133，第一突起物的平均體積與本體的平均體積的比值為約0.0024，每個多突狀微粒具有約89個第一突起 物，且第一突起物的總體積為多突狀微粒的體積的17.4%。
特別說明的是，多突狀微粒的第一突起物的平均高度(或平均體積)與本體的平均粒徑(或平均體積)的比值可相關於該多突狀微粒的表面型態(即整體外觀)。舉例來說，在圖5B的多突狀微粒中，第一突起物的平均高度與本體的平均粒徑比值大於0.25，第一突起物的平均體積與本體的平均體積的比值大於2x10-2，因此，圖5B的多突狀微粒的表面型態不規則，亦即，不易清楚辨識本體與第一突起物的位置。在圖5D的多突狀微粒與圖5F的多突狀微粒中，第一突起物的平均高度與本體的平均粒徑比值皆介於0.005至0.25之間，第一突起物的平均體積與本體的平均體積的比值皆介於1x10-7至2x10-2之間，因此，圖5D的多突狀微粒與圖5F的多突狀微粒皆可辨識出本體與第一突起物的位置。
實施例2：特異性抗體的接枝量測試
在本實施例中，先將第一特異性抗體(Anti-Human CD9、Anti-Human CD63或Anti-Human Her2)分別耦合至一般的圓球狀微米粒子以及本實施例的微米粒子(多突狀微粒或多突狀磁性微粒)。接著，對耦合有第一特異性抗體的圓球狀微米粒子、耦合有第一特異性抗體的多突狀微粒以及耦合有第一特異性抗體的多突狀磁性微粒進行特異性抗體的接枝量測試及比較。本實施例中所使用的微米粒子的類型與粒徑如表1所示。
表1：微米粒子的類型與粒徑
Figure 110148376-A0305-02-0022-1
在本實施例中，將Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)分別耦合至圓球狀微米粒子、多突狀微粒以及多突狀磁性微粒的步驟大致如下：(1)將1×106顆表面修飾有胺基的粒子(即比較例1~3的圓球狀微米粒子；實例1與實例3~4的多突狀微粒；實例2的多突狀磁性微粒)以200μL的MES緩衝溶液清洗三次。接著，將20mg的EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)、20mg的NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)及4mg的PAA(15kDa poly acrylic acid)溶解於400μL的MES緩衝溶液中，並與清洗後的粒子混合。接著，於室溫下，以轉速1000rpm的試管振盪器(vortex)進行混合並反應30分鐘。接著，收集粒子，其中圓球狀微米粒子與多突狀微粒以離心方式收集，轉速10000rpm，3分鐘；多突狀磁性微粒以磁鐵收集，並至少停留磁鐵1分鐘。在移除反應溶液後，以200μL的MES緩 衝溶液清洗粒子三次，加入20μL的Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)在pH3的Citric Acid-PBS溶液(0.625M Citric Acid溶於PBS溶液，pH3.0)中，於4℃下隔夜反應，以將Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)耦合至粒子的表面。接著，再加入200μL的牛血清白蛋白溶液(10mg/mL BSA溶於MES溶液)，在4℃下進行隔夜反應，以覆蓋粒子的表面上未被Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)耦合的其餘表面。(2)收集反應完成後的粒子，其中，圓球狀微米粒子與多突狀微粒以離心方式收集：轉速10000rpm，3分鐘；多突狀磁性微粒以磁鐵收集，每次至少停留1分鐘。移去反應溶液，以PBS溶液(0.1% BSA及0.01% Sodium azide溶於PBS)清洗粒子三次，最後將耦合有Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)的粒子分散於100μL的PBS溶液中。(3)使用細胞自動計數器計算粒子的濃度，得到濃度約為3~8×106/mL表面耦合有Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)的粒子。
接著，對表面耦合有Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)的粒子進行特異性抗體的接枝量測試，步驟大致如下：(1)將50μL(1250顆)表面耦合有Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)的粒子加入5uL Anti-mouse IgG-FITC，再加入PBS溶液至反應總體積為200μL。於室溫下，以轉速1500rpm的試管振盪器來混合並反應30分鐘。 反應完成後收集上述粒子，其中，圓球狀微米粒子與多突狀微粒以離心方式收集，轉速10000rpm，3分鐘；多突狀磁性微粒以磁鐵收集，並停留磁鐵至少1分鐘。(2)移去反應溶液，並以200μLPBS溶液清洗兩次。(3)清洗完成後加入100μL PBS溶液，並以流式細胞儀對所得粒子進行螢光訊號分析，以測得Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63、或Anti-Human Her2)的接枝量(以平均螢光強度表示，即平均螢光強度愈強，接枝量愈多)；(4)進行統計分析，試驗結果以螢光強度倍數表示，其中，表2為具有相同粒徑(8.5微米)的圓球狀微米粒子(比較例1)、多突狀微粒(實例1)與多突狀磁性微粒(實例2)的接枝量比較。表3為具有不同粒徑(2.5、4.5、8.5微米)的圓球狀微米粒子(比較例1~3)與多突狀微粒(實例1、3~4)的接枝量比較。表4為具有相同粒徑(2.5、4.5、8.5微米)的圓球狀微米粒子(比較例1~3)與多突狀微粒(實例1、3~4)的接枝量比較。
Figure 110148376-A0305-02-0024-2
Figure 110148376-A0305-02-0025-5
由表2的結果可知，當第一特異性抗體為Anti-Human CD9時，實例1的接枝量約為比較例1的接枝量的1.71倍。當第一特異性抗體為Anti-Human CD63時，實例1的接枝量約為比較例1的接枝量的4.55倍。也就是說，不論第一特異性抗體為Anti-Human CD9或Anti-Human CD63，實例1的接枝量皆大於比較例1的接枝量。因此，相較於一般的圓球狀微米粒子，本實施例的多突狀微粒可顯著地耦合較多的第一特異性抗體。
此外，當第一特異性抗體為Anti-Human CD9時，實例2的接枝量約為實例1的接枝量的2.24倍。當第一特異性抗體為Anti-Human Her2時，實例2的接枝量約為實例1的接枝量的3.81倍。也就是說，不論第一特異性抗體為Anti-Human CD9或Anti-Human Her2，實例2的接枝量皆大於實例1的接枝量。因此，相較於本實施例的多突狀微粒，本實施例的多突狀磁性微粒可顯著地耦合較多的第一特異性抗體。
Figure 110148376-A0305-02-0025-4
Figure 110148376-A0305-02-0026-7
Figure 110148376-A0305-02-0026-8
由表3的結果可知，無論是圓球狀微米粒子或多突狀微粒，當粒徑愈大時，可耦合第一特異性抗體的表面積隨之愈增加，因此可提升第一特異性抗體的接枝量。由表4的結果可知，相較於圓球狀微米粒子(比較例3或比較例1)，具有相似粒徑的多突狀微粒(實例4或實例1)可顯著地耦合更多的第一特異性抗體。而相較於粒徑為約2.5微米的圓球狀微米粒子(比較例2)，粒徑為約2.5微米的多突狀微粒(實例3)可能因表面型態不均勻(請參考圖5B)，導致偵測到的螢光訊號較低。
實施例3：乳癌細胞株SKBr3的外泌體的表面抗原的檢測
在本實施例中，利用耦合有第一特異性抗體(Anti-Human CD9或Anti-Human CD63)的圓球狀微米粒子(比較例1、比較例2、比較例3)、多突狀微粒(實例1、實例3、實例4)、多突狀磁 性微粒(實例2)以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD9-Alexa488或Anti-Human CD81-APC)來檢測位於外泌體的表面的外泌體表面抗原的表現量。以比較例1為例來做說明：具體來說，先使耦合有Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63)的比較例1與帶有多種外泌體表面抗原的外泌體混合，以使Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63)可辨識並直接結合至位於外泌體的表面的CD9(或CD63)，以形成第一複合物；接著，將第一複合物與Anti-Human CD9-Alexa488(或Anti-Human CD81-APC)混合，以使Anti-Human CD9-Alexa488(或Anti-Human CD81-APC)結合至第一複合物中的外泌體的表面的CD9(或CD81)並形成第二複合物；接著，以流式細胞儀來對第二複合物進行螢光訊號分析，以檢測外泌體表面抗原的表現量。其中，上述的外泌體是由乳癌細胞株(SKBr3)中純化出的外泌體。上述的圓球狀微米粒子包括粒徑為約2.5微米的圓球狀微米粒子(比較例2)、粒徑為約4.5微米的圓球狀微米粒子(比較例3)以及粒徑為約8.5微米的圓球狀微米粒子(比較例1)。上述的多突狀微粒包括粒徑為約2.5微米的多突狀微粒(實例3)、粒徑為約4.5微米的多突狀微粒(實例4)以及粒徑為約8.5微米的多突狀微粒(實例1)。上述的多突狀磁性微粒包括粒徑為約8.5微米的多突狀磁性微粒(實例2)。
在本實施例中，使耦合有Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63)的比較例1~3、實例1、3~4或實例2與SKBr3 的外泌體混合，以使Anti-Human CD9(或Anti-Human CD63)可辨識並直接結合至外泌體的表面的CD9(或CD63)，以形成第一複合物的步驟大致如下：50μL(1250顆)的比較例1~3、實例1、3~4或實例2與體積20~50μL的SKBr3的外泌體反應，再加入PBS溶液至反應總體積為200μL，混合並於室溫下反應90分鐘，反應完成後，將含有比較例1~3的第一複合物或實例1、3~4的第一複合物以離心方式收集，轉速10000rpm，3分鐘；將含有實例2的第一複合物以磁鐵收集，並停留磁鐵至少1分鐘。移去反應溶液並重複以200μL的PBS溶液清洗第一複合物兩次。
在本實施例中，將第一複合物與Anti-Human CD9-Alexa488(或Anti-Human CD81-APC)混合，以使Anti-Human CD9-Alexa488(或Anti-Human CD81-APC)結合至第一複合物中的外泌體的表面的CD9(或CD81)並形成第二複合物的步驟大致如下：加入100μL的Anti-Human CD9-Alexa488(或Anti-Human CD81-APC)至第一複合物，接著，於室溫下，以轉速1500rpm的試管振盪器進行混合並反應30分鐘，以形成第二複合物。反應完成後，將含有比較例1~3的第二複合物或含有實例1、3~4的第二複合物以離心方式收集，轉速10000rpm，3分鐘；將含有實例2的第二複合物以磁鐵收集，並停留磁鐵至少1分鐘。移去反應溶液，並重複以200μL的PBS溶液清洗第二複合物兩次。
在本實施例中，對第二複合物進行螢光訊號分析，以檢測外泌體表面抗原的表現量的步驟大致如下：100μL的PBS溶液 加入至清洗完成後的第二複合物(即含有比較例1的第二複合物、含有實例1的第二複合物或含有實例2的第二複合物)，並以流式細胞儀來進行螢光訊號分析，以檢測外泌體表面抗原的表現量(即平均螢光強度)，其結果如圖6A至圖6L、圖7A至圖7C以及圖8A至圖8C所示。
圖6A至圖6F為分別使用耦合有Anti-Human CD63的比較例1~3與實例1、3~4來檢測SKBr3的外泌體的CD9的表現量。具體來說，圖6A、圖6C以及圖6E分別以粒徑約2.5微米、4.5微米以及8.5微米的圓球狀微米粒子(比較例2、比較例3以及比較例1)進行檢測，圖6B、圖6D以及圖6F則分別以粒徑約2.5微米、4.5微米以及8.5微米的多突狀微粒(實例3、實例4以及實例1)進行檢測。由圖6A與圖6B可知，相較於粒徑2.5微米的圓球狀微米粒子(比較例2)，粒徑2.5微米的多突狀微粒(實例3)可能因表面型態不均勻，導致偵測到的螢光訊號較低。由圖6C(或圖6E)的結果可知，當比較例3(或比較例1)中的外泌體的數量(0、1.05×107、1.05×108、1.05×109)增加時，可使比較例3(或比較例1)結合到較多的外泌體，以檢測到較多的CD9以及較高的平均螢光強度。由圖6D(或圖6F)的結果可知，當實例4(或實例1)中的外泌體的數量(0、1.05×107、1.05×108、1.05×109)增加時，可使實例4(或實例1)結合到較多的外泌體，以檢測到較多的CD9以及較高的平均螢光強度。然而，由圖6C至圖6F的結果可知，相較於含有圓球狀微米粒子的比較例3(或比較例1)， 含有多突狀微粒的實例4(或實例1)可結合到更多的外泌體，因而可檢測到更多的CD9以及更高的平均螢光強度。
圖6G至圖6L為分別使用耦合有Anti-Human CD9的比較例1~3與實例1、3~4來檢測SKBr3的外泌體的CD9的表現量。具體來說，圖6G、圖6I以及圖6K分別以粒徑約2.5微米、4.5微米以及8.5微米的圓球狀微米粒子(比較例2、比較例3以及比較例1)進行檢測，而圖6H、圖6J以及圖6L分別以粒徑約2.5微米、4.5微米以及8.5微米的多突狀微粒(實例3、實例4以及實例1)進行檢測。由圖6G與圖6H可知，相較於粒徑2.5微米的圓球狀微米粒子(比較例2)，粒徑2.5微米的多突狀微粒(實例3)可能因表面型態不均勻，導致偵測到的螢光訊號較低。由圖6I(或圖6K)的結果可知，當比較例3(或比較例1)中的外泌體的數量(0、1.05×107、1.05×108、1.05×109)增加時，可使比較例3(或比較例1)結合到較多的外泌體，以檢測到較多的CD9以及較高的平均螢光強度。由圖6J(或圖6L)的結果可知，當實例4(或實例1)中的外泌體的數量(0、1.05×107、1.05×108、1.05×109)增加時，可使實例4(或實例1)結合到較多的外泌體，以檢測到較多的CD9以及較高的平均螢光強度。然而，由圖6I至圖6L的結果可知，相較於含有圓球狀微米粒子的比較例3(或比較例1)，含有多突狀微粒的實例4(或實例1)可結合到更多的外泌體，因而可檢測到更多的CD9以及更高的平均螢光強度。
值得說明的是，由圖6A至圖6L整體來看，微粒越大顆 訊號越強，粒徑越大且多突狀有最好的分析訊號。使用流式細胞儀偵測適合粒徑較大顆且尺寸均勻的微粒進行分析有較好的分析訊號。
圖7A至圖7C為分別使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在不同溶液中的SKBr3的外泌體的CD9的表現量。具體來說，先將SKBr3的外泌體分別置於DMEM培養液(即收取SKBr3的培養液的上清液)、PBS溶液(即純化SKBr3的外泌體後置於PBS溶液)或含有EDTA的血漿(即純化SKBr3的外泌體後置於含有EDTA的血漿)中。接著，使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在DMEM培養液中的SKBr3的外泌體的CD9的表現量，其結果如圖7A所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在PBS溶液中的SKBr3的外泌體的CD9的表現量，其結果如圖7B所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在含有EDTA的血漿中的SKBr3的外泌體的CD9的表現量，其結果如圖7C所示。其中，上述的血漿來自於健康人。
由圖7A的結果可知，相較於含有多突狀微粒的實例1，含有多突狀磁性微粒的實例2可結合到更多位在DMEM培養液中的外泌體，因而可檢測到更多的CD9以及更高的平均螢光強度。由圖7B的結果可知，相較於含有多突狀微粒的實例1，含有多突狀磁性微粒的實例2可結合到更多位在PBS溶液中的外泌體，因而可檢測到更多的CD9以及更高的平均螢光強度。由圖7C的結 果可知，相較於含有多突狀微粒的實例1，含有多突狀磁性微粒的實例2可結合到更多位在含有EDTA的血漿中的外泌體，因而可檢測到更多的CD9以及更高的平均螢光強度。此外，由圖7A至圖7C的結果可知，含有多突狀微粒的實例1或含有多突狀磁性微粒的實例2除了可以檢測到位在PBS溶液中的外泌體，也可檢測到位在DMEM培養液或位在含有EDTA的血漿等較複雜環境中的外泌體。
圖8A至圖8C為分別使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在不同溶液中的SKBr3的外泌體的CD81的表現量。具體來說，先將SKBr3的外泌體分別置於DMEM培養液(即收取SKBr3的培養液的上清液)、PBS溶液(即純化SKBr3的外泌體後置於PBS溶液)或含有EDTA的血漿(即純化SKBr3的外泌體後置於含有EDTA的血漿)中。接著，使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在DMEM培養液中的SKBr3的外泌體的CD81的表現量，其結果如圖8A所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在PBS溶液中的SKBr3的外泌體的CD81的表現量，其結果如圖8B所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例1與實例2來檢測在含有EDTA的血漿中的SKBr3的外泌體的CD81的表現量，其結果如圖8C所示。其中，上述的血漿來自於健康人。
由圖8A的結果可知，相較於含有多突狀微粒的實例1，含有多突狀磁性微粒的實例2可結合到更多位在DMEM培養液中 的外泌體，因而可檢測到更多的CD81以及更高的平均螢光強度。由圖8B的結果可知，相較於含有多突狀微粒的實例1，含有多突狀磁性微粒的實例2可結合到更多位在PBS溶液中的外泌體，因而可檢測到更多的CD81以及更高的平均螢光強度。由圖8C的結果可知，相較於含有多突狀微粒的實例1，含有多突狀磁性微粒的實例2可結合到更多位在含有EDTA的血漿中的外泌體，因而可檢測到更多的CD81以及更高的平均螢光強度。此外，由圖8A至圖8C的結果可知，含有多突狀微粒的實例1或含有多突狀磁性微粒的實例2除了可以檢測到位在PBS溶液中的外泌體，也可檢測到位在DMEM培養液或位在含有EDTA的血漿等較複雜環境中的外泌體。
實施例4：乳癌細胞株SKBr3的外泌體的表面抗原的檢測
圖9A至圖9D為使用耦合有Anti-Human CD9的實例2來同時檢測SKBr3的外泌體的CD9、CD29、CD63以及CD81中的任三者的表現量。具體來說，本實施例以類似實施例3的實驗步驟來同時檢測乳癌細胞株SKBr3的外泌體的多種表面抗原，故於此不再贅述。而本實施例與實施例3的差異在於：在本實施例中，先將SKBr3的外泌體放置在含有EDTA的血漿中。接著，使用耦合有Anti-Human CD9的實例2以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC)來同時檢測外泌 體的CD9、CD63以及CD81的表現量，其結果如圖9A所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例2以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD29-PE、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC)來同時檢測外泌體的CD29、CD63以及CD81的表現量，其結果如圖9B所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例2以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD9-A1exa488、Anti-Human CD29-PE以及Anti-Human CD63-PerCPCy5.5)來同時檢測外泌體的CD9、CD29以及CD63的表現量，其結果如圖9C所示；使用耦合有Anti-Human CD9的實例2以及帶有多種螢光標記的多種第二特異性抗體(Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD29-PE以及Anti-Human CD81-APC)來同時檢測外泌體的CD9、CD29以及CD81的表現量，其結果如圖9D所示。其中，上述的血漿來自於健康人。此外，在圖9A至圖9D中，外泌體的CD9的表現量以符號□表示，外泌體的CD29的表現量以符號╳表示，外泌體的CD63的表現量以符號○表示，外泌體的CD81的表現量以符號△表示。
由圖9A至圖9D的結果可知，即使外泌體位在含有EDTA的血漿之較複雜的環境中，本實施例的檢測方法仍可利用實例2(即耦合有Anti-Human CD9的多突狀磁性微粒)以及任三種帶有螢光標記的第二特異性抗體(即Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD29-PE、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC中的任三種)來同時檢測外泌體上任三種 的外泌體表面抗原(即CD9、CD29、CD63以及CD81中的任三種)的表現量，以達到同時檢測多重分析物的目的。此外，雖然本實施例是以同時檢測三種待分析物為例，但本發明並不對可同時檢測的待分析物的數量加以限制。也就是說，在一些實施例中，也可同時檢測二種或三種以上的待分析物。
圖10A至圖10D為使用耦合有Anti-Human Her2的實例2來同時檢測SKBr3的外泌體的CD9、CD29、CD63以及CD81中的任三者的表現量。具體來說，先將SKBr3的外泌體放置在含有EDTA的血漿中。接著，使用耦合有Anti-Human Her2的實例2以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC)來同時檢測外泌體的CD9、CD63以及CD81的表現量，其結果如圖10A所示；使用耦合有Anti-Human Her2的實例2以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD29-PE、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC)來同時檢測外泌體的CD29、CD63以及CD81的表現量，其結果如圖10B所示；使用耦合有Anti-Human Her2的實例2以及帶有螢光標記的第二特異性抗體(Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD29-PE以及Anti-Human CD63-PerCPCy5.5)來同時檢測外泌體的CD9、CD29以及CD63的表現量，其結果如圖10C所示；使用耦合有Anti-Human Her2的實例2以及帶有多種螢光標記的多種第二特異性抗體(Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD29-PE 以及Anti-Human CD81-APC)來同時檢測外泌體的CD9、CD29以及CD81的表現量，其結果如圖10D所示。其中，上述的血漿來自於健康人。此外，在圖10A至圖10D中，外泌體的CD9的表現量以符號□表示，外泌體的CD29的表現量以符號╳表示，外泌體的CD63的表現量以符號○表示，外泌體的CD81的表現量以符號△表示。
由圖10A至圖10D的結果可知，即使外泌體位在含有EDTA的血漿之較複雜的環境中，本實施例的檢測方法仍可利用實例2(即耦合有Anti-Human Her2的多突狀磁性微粒)以及任三種帶有螢光標記的第二特異性抗體(即Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD29-PE、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC中的任三種)來同時檢測外泌體上任三種的外泌體表面抗原(即CD9、CD29、CD63以及CD81中的任三種)的表現量，以達到同時檢測多重分析物的目的。
此外，比較圖9A與圖10A、圖9B與圖10B、圖9C與圖10C以及圖9D與圖10D的結果可知，無論是利用耦合有Anti-Human CD9或Anti-Human Her2的多突狀磁性微粒，來分析SKBr3的外泌體表面抗原(即CD9、CD29、CD63以及CD81)的表現量，其檢測結果具有高的一致性，顯示本實施例的檢測方法的準確度高且誤差小。
另外，綜合圖9A至圖9D與圖10A至圖10D的結果可知，無論是利用耦合有Anti-Human CD9或Anti-Human Her2的多突狀 磁性微粒來結合SKBr3的外泌體，並搭配任三種帶有螢光標記的第二特異性抗體(即Anti-Human CD9-Alexa488、Anti-Human CD29-PE、Anti-Human CD63-PerCPCy5.5以及Anti-Human CD81-APC中的任三種)來分析外泌體表面抗原(即CD9、CD29、CD63以及CD81)的表現量，大致皆為CD9的表現量最高，且CD81的表現量略微高於或近似於CD63的表現量與CD29的表現量，顯示本實施例的檢測方法即便存在兩種以上的變異參數，所得到的檢測結果仍具有可比較性。
實施例5：臨床檢體的外泌體的表面抗原的檢測
圖11A至圖11D為分別使用耦合有不同的第一特異性抗體的實例2來同時檢測臨床檢體之血漿中的外泌體的CD9與CD63的表現量。其中，第一特異性抗體為Anti-Human CD9、Anti-Human Her2、Anti-Human EGFR或Anti-Human EpCAM，臨床檢體來自於8個良性腫瘤(Benign)的血漿、20個管狀型乳癌(Luminal)的血漿、8個Her2陽性型乳癌(Her2+)的血漿以及4個三陰性乳癌(TN)的血漿，有螢光標記的第二特異性抗體為Anti-Human CD9-Alexa488與Anti-Human CD63-PE。具體來說，本實施例以類似實施例3的實驗步驟來同時檢測臨床檢體中的外泌體的CD9與CD63，故於此不再贅述。而本實施例與實施例3的差異在於：在本實施例中，先將不同臨床檢體中的外泌體放置在含有EDTA的血漿中。接著，使用耦合有Anti-Human CD9的實例2來同時檢測外泌體的CD9與CD63的表現量，其結果如圖11A所示；使用耦 合有Anti-Human Her2的實例2來同時檢測外泌體的CD9與CD63的表現量，其結果如圖11B所示；使用耦合有Anti-Human EGFR的實例2來同時檢測外泌體的CD9與CD63的表現量，其結果如圖11C所示；使用耦合有Anti-Human EpCAM的實例2來同時檢測外泌體的CD9與CD63的表現量，其結果如圖11D所示。
由圖11A至圖11D的結果可知，針對不同的臨床檢體，本實施例的檢測方法仍可利用實例2(即耦合有Anti-Human CD9、Anti-Human Her2、Anti-Human EGFR或Anti-Human EpCAM的多突狀磁性微粒)以及二種帶有螢光標記的第二特異性抗體(即Anti-Human CD9-Alexa488與Anti-Human CD63-PE)來同時檢測外泌體上的二種外泌體表面抗原(即CD9與CD63)的表現量，以達到同時檢測多重分析物的目的。
實施例6：核酸的檢測
探針的耦合方法
在本實施例中，先將探針(Avian Influenza Virus primer，AIV探針)耦合至本實施例的多突狀磁性微粒，接著，加入標記有生物素(biotin)的核酸序列(AB待分析核酸或AIV待分析核酸)以進行分析。
在本實施例中，AIV探針具有序列辨識號：1的核酸序列、AB待分析核酸具有序列辨識號：2的核酸序列，而AIV待分析核酸具有序列辨識號：3的核酸序列，詳細序列如下表所示。
Figure 110148376-A0305-02-0039-11
在本實施例中，將AIV探針耦合至多突狀磁性微粒的步驟如下：(1)將1×106顆表面修飾有胺基的多突狀磁性微粒以200μL的MES緩衝溶液清洗三次。接著，將20mg的EDC、20mg的NHS及4mg的PAA溶解於400μL的MES緩衝溶液中，並與清洗後的多突狀磁性微粒混合。接著，於室溫下，以轉速1000rpm的試管振盪器(vortex)進行混合並反應30分鐘。接著，以磁鐵收集多突狀磁性微粒，並至少停留磁鐵1分鐘。移去反應溶液並重複以200μL的MES緩衝溶液清洗多突狀磁性粒子三次，再加入20μL AIV探針及80μL PBS溶液，在室溫下反應2小時，轉速1000rpm。(2)以磁鐵收集反應完成的多突狀磁性微粒，並至少停留磁鐵1分鐘。移去反應溶液，以Tris溶液(25mM Tris，pH 7.4)清洗多突狀磁性微粒三次，每次至少停留1分鐘，最後將耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒分散在100μL Tris溶液中。(3)使用細胞自動計數器計算多突狀磁性微粒濃度，得到濃度約為3~8×106/mL表面耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒。
以耦合有探針的多突狀磁性微粒進行核酸檢測
在本實施例中，利用耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒來檢測帶有生物素的AB待分析核酸或AIV待分析核酸，其步驟大致如下：(1)將30μL的Hybridization溶液(TEGO Hybridization溶液)與30μL的帶有生物素的AB待分析核酸或AIV待分析核酸的不同濃度(0.05μM、0.1μM、0.5μM、15μM、10μM)的溶液混合。接著，加入50μL(1250顆)表面耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒，並在60℃下以轉速1000rpm的試管振盪器(vortex)進行混合並反應30分鐘，其中，帶有生物素的AIV待分析核酸會與耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒中的AIV探針進行專一性的配對結合，以形成第一複合物。反應完成後，以磁鐵收集多突狀磁性微粒。接著，在移去反應溶液後，重複以200μL PBS溶液清洗兩次。(2)加入100μL帶有螢光的抗生物素抗體(Anti-Biotin PE)至多突狀磁性微粒，進行混合，並於室溫下反應30分鐘，其中，帶有螢光的抗生物素抗體會結合至上述第一複合物中的生物素，以形成第二複合物。反應完成後以磁鐵收集多突狀磁性微粒，移去反應溶液，重複以200μL的PBS緩衝溶液(PBS溶液，pH7.4)清洗兩次。(3)清洗完成後，加入150μL的PBS緩衝溶液，並以流式細胞儀進行螢光訊號分析，其結果如圖12A與圖12B所示。
如圖12A所示，由於帶有生物素的AB待分析核酸不會與耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒中的AIV探針結合，因此不會形成第一複合物，進而也不會形成第二複合物，所以所測得的 平均螢光強度趨近於0。
如圖12B所示，由於帶有生物素的AIV待分析核酸會與耦合有AIV探針的多突狀磁性微粒中的AIV探針進行專一性的配對結合，形成第一複合物，進而使得第一複合物中的生物素再與帶有螢光的抗生物素抗體結合形成第二複合物，因此可測得平均螢光強度。此外，平均螢光強度的數值基本上也會隨著帶有生物素的AIV待分析核酸的濃度提高而增加。
綜上所述，本揭露的微米粒子可藉由將形狀不規則的多個第一突起物設置於本體的表面，因而增加了微米粒子的表面積(即本體的表面積與第一突起物的表面積的總和)。藉此，可使本揭露的微米粒子可耦合較多的第一配體，以辨識並結合較多的標的物T，進而能增強偵測訊號以提高檢測的靈敏度。
此外，相較於多突狀微粒，由於本揭露的多突狀磁性微粒的磁性物質層的表面為粗糙表面(或具有小突起)，因而使得多突狀磁性微粒的表面(即本體的表面與第一突起物的表面)也為粗糙表面，因而使得多突狀磁性微粒可具有更多的表面積，進而使得多突狀磁性微粒可耦合更多的第一配體，並辨識與結合更多的標的物，以增強偵測訊號並提高檢測的靈敏度。再者，由於多突狀磁性微粒具有磁性，因而能縮短檢測的時間，並提升檢測的效率及便利性。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
S10、S20、S30、S40:步驟

Claims (14)

  1. 一種多重分析物的檢測方法，包括：提供微米粒子，所述微米粒子耦合有至少一種第一配體，且所述微米粒子包括：本體；以及形成於所述本體的表面的多個第一突起物，其中所述多個第一突起物的平均體積與所述本體的平均體積的比值為1x10-7至2x10-2，所述多個第一突起物的總體積占所述微米粒子整體體積的10-1至6x10-1；將所述微米粒子與包括有多種待分析物的樣品混合，以形成第一複合物；將所述第一複合物與帶有多種第一標記的多種第二配體混合，以使所述多種第二配體結合至所述第一複合物中的所述多種待分析物，並形成第二複合物；以及對所述第二複合物中的所述多種第一標記進行檢測。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述微米粒子為多突狀微粒，且所述多突狀微粒的所述本體由內而外包括共聚物核心、高分子層以及矽基層，所述共聚物核心的表面形成有多個第二突起物，且所述多個第二突起物的平均高度為100奈米至5000奈米。
  3. 如請求項1所述的方法，其中所述微米粒子為多突狀磁性微粒，且所述多突狀磁性微粒的所述本體由內而外包括共聚物核心、高分子層、磁性物質層以及矽基層，所述共聚物核心的 表面形成有多個第二突起物，且所述多個第二突起物的平均高度為100奈米至5000奈米。
  4. 如請求項1所述的方法，其中所述多個第一突起物的平均高度與所述本體的平均粒徑的比值為0.005至0.25。
  5. 如請求項1所述的方法，其中所述多個第一突起物的平均數量為5至500，所述微米粒子的平均粒徑為1微米至20微米。
  6. 如請求項1所述的方法，所述微米粒子為非圓球形。
  7. 如請求項1所述的方法，其中所述多種待分析物位於所述樣品的表面，且形成所述第一複合物的方式包括：使所述至少一種第一配體辨識並直接結合至位於所述樣品的所述表面的標的物。
  8. 如請求項7所述的方法，其中所述至少一種第一配體包括第一特異性抗體，而所述第一特異性抗體包括抗人類外泌體表面抗原抗體、抗人類血液細胞表面抗原抗體、抗人類免疫細胞表面抗原抗體、抗人類腫瘤細胞表面抗原抗體或前述之組合。
  9. 如請求項7所述的方法，其中所述樣品包括人類外泌體、人類血液細胞、人類免疫細胞、人類腫瘤細胞或前述之組合，而所述多種待分析物包括所述人類外泌體的表面抗原、所述人類血液細胞的表面抗原、所述人類免疫細胞的表面抗原、所述人類腫瘤細胞的表面抗原或前述之組合。
  10. 如請求項7所述的方法，其中所述多種第二配體包括多種第二特異性抗體，而所述多種第二特異性抗體包括抗人 類外泌體表面抗原抗體、抗人類血液細胞表面抗原抗體、抗人類免疫細胞表面抗原抗體、抗人類腫瘤細胞表面抗原抗體或前述之組合。
  11. 如請求項1所述的方法，其中所述至少一種第一配體包括多種第一配體，且形成所述第一複合物的方式包括：使所述多種第一配體辨識並直接結合至所述多種待分析物。
  12. 如請求項11所述的方法，其中所述多種第一配體包括多種核酸探針，而所述多種核酸探針包括多種引子或適體，所述多種待分析物包括帶有多種第二標記的多種核酸序列，所述多種第二標記包括生物素、多種抗原區域或前述之組合。
  13. 一種多重分析物的檢測方法，包括：提供微米粒子，所述微米粒子耦合有多種配體，且所述微米粒子包括：本體；以及形成於所述本體的表面的多個突起物，其中所述多個突起物的平均體積與所述本體的平均體積的比值為1x10-7至2x10-2，所述多個突起物的總體積占所述微米粒子整體體積的10-1至6x10-1；將所述微米粒子與包括有多種待分析物的樣品混合，以形成複合物，其中所述多種待分析物帶有多種標記；以及對所述複合物中的所述多種標記進行檢測。
  14. 如請求項13所述的方法，其中所述多種配體包括多種核酸探針，所述多種標記包括多種螢光標記、多種冷光標記或前述之組合，且所述多種待分析物包括多種核酸序列。
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