CN111172232B - 一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器 - Google Patents

一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器 Download PDF

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Abstract

本发明属于传感器技术领域，具体为一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，用以解决现有光微流激光传感器的表面结合位点受限的问题。本发明通过静电吸附或者化学交联的方式将纳米颗粒固定于空心薄壁光纤的内壁，利用纳米颗粒大表面体积比的特点，显著增加传感器表面与传感分子的结合位点；结合光微流激光高灵敏度传感方法，进一步提高光微流激光传感的传感灵敏度；综上，本发明显著提高了传统光微流激光传感器检测方法的传感灵敏度，降低了传统光微流激光传感器检测方法的激光阈值，实现了更高灵敏度、更低光微流激光阈值的辣根过氧化物酶浓度传感器。

Description

一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器
技术领域
本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，实现高灵敏度辣根过氧化物酶浓度检测。
背景技术
在医学诊断、食品安全、水质检测等领域，广泛采用的检测手段为基于酶联免疫吸附试验(ELISA)的比色法、免疫层析法、荧光检测法、化学发光法，其原理为通过传感器表面固相抗原或抗体，与之对应的酶标抗原抗体通过特异性识别结合在传感器表面，通过检测最终固定在传感器表面的酶数量检测出待测抗原或抗体的浓度，而最常用的标记酶通常为辣根过氧化物酶。因此，在固相的基础上提高辣根过氧化物酶的传感灵敏度对于提高涉及领域通用传感技术的灵敏度尤为重要。
目前，一种新型的光微流激光检测方法受到研究者们的关注，由于谐振腔的高Q值，其输出激光信号对腔内检测物浓度非常敏感，使得其传感灵敏度远高于传统的比色法和荧光检测法的灵敏度。Fan课题组已经提出了在法布里珀罗腔内结合ELISA技术实现了白介素-6的高灵敏度检测，此时，影响光微流激光传感器的关键因素为传感器表面结合位点的数量。目前为止，还未有人提出在光微流激光传感器的基础上进一步提高其灵敏度的方法，特别是，通过纳米颗粒增加传感器表面结合位点从而进一步提高光微流激光传感器灵敏度的方法还未曾提及。
发明内容
本发明的目的在于针对现有光微流激光传感器的表面结合位点受限的问题，提供一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，用以实现辣根过氧化物酶浓度检测，且具有低激光阈值、高灵敏度的优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，包括：空心薄壁光纤、纳米颗粒及生物分子；其特征在于，所述纳米颗粒通过静电吸附或者化学交联的方式固定于空心薄壁光纤内壁，所述生物分子以静电吸附或化学交联的方式结合于纳米颗粒表面或空心薄壁光纤内壁，再以特异性识别的方式捕获传感分子。
进一步的，基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器，包括：空心薄壁光纤、表面氨基化纳米颗粒及NHS-biotin分子；其特征在于，所述空心薄壁光纤的内壁通过APTES引入氨基，所述表面氨基化纳米颗粒通过DSS交联剂(氨基对氨基交联方式)结合于氨基化空心薄壁光纤内壁，所述NHS-biotin分子通过NHS-氨基交联方式结合于表面氨基化纳米颗粒表面，用以特异性捕获Streptavidin-HRP分子。
进一步的，所述传感器的传感过程为：将传感器吸入待测Streptavidin-HRP溶液，孵育40-90分钟后，用PBS冲洗掉未捕获Streptavidin-HRP分子；再吸入ADHP底物混合试剂，避光静置30-60分钟，传感器内壁捕获的Streptavidin-HRP分子将催化ADHP底物产生染料分子；当泵浦激光照射在传感器上时，激发染料分子发光并在薄壁光纤内壁谐振，产生激光信号，经过信号采集与数据处理后得到传感信号。
进一步的，所述纳米颗粒修饰采用二氧化硅纳米颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒。
上述基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将空心薄壁光纤去除涂覆层后，泡在丙酮内备用；
步骤2：将空心薄壁光纤放在食人鱼溶液中浸泡2-14小时然后通过三次以上超纯水清洗和至少一次丙酮清洗后，浸入浓度为3％-10％的APTES丙酮溶液中孵育2-6小时，孵育完成后再用丙酮、无水乙醇分别清洗后备用；
步骤3：将表面氨基化空心薄壁光纤用DMSO清洗后，转入20-50mg/ml DSS DMSO溶液中孵育1-3小时，然后用DMSO清洗掉未固定DSS分子，并转移至5-500μg/ml表面氨基化纳米颗粒溶液中孵育40-90分钟，孵育完成后用PBS清洗；再转入1-5mM NHS-biotin PBS溶液内孵育20-40分钟，最后用PBS冲洗掉未固定NHS-biotin分子，并浸泡在PBS内待用。
更进一步的，包括上述传感器的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感系统，由泵浦模块、信号收集模块和传感模块组成；其特征在于，所述泵浦模块包括：纳秒激光器1、双平凸透镜组2、固定衰减片3、可调衰减片4、柱面镜5、样品台6、v型槽7与能量计12，所述信号收集模块包括：平凸透镜8、光阑9、滤光片10、光谱仪11，所述传感模块为所述基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器；所述v型槽7设置于样品台6上，所述传感模块放置于v型槽7中；
激光从纳秒激光器1出射后，通过双平凸透镜组2进行扩束，然后通过柱面镜5将圆形光斑压缩为线光斑，作为泵浦激光照射在传感模块上；传感模块产生激光信号，激光信号经过平凸透镜8收集、再通过滤光片10滤掉泵浦光信号后、由光谱仪11接收并传输到PC端13保存为光谱信号，后续数据处理后转化为传感信号；
所述固定衰减片3与可调衰减片4依次设置于双平凸透镜组2于柱面镜5之间、用于调节泵浦能量，能量计12用于监测泵浦激光能量强度；所述光阑9用于信号收集模块的位置调整。
本发明的有益效果在于：
本发明提供基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器及其制备方法、以及包括该传感器的传感系统；本发明结合纳米颗粒大表面体积比的优势和光微流激光高灵敏度传感的特点，通过DSS交联剂(氨基对氨基交联方式)将表面氨基化纳米颗粒结合于氨基化空心薄壁光纤内壁，利用纳米颗粒大表面体积比的特点，显著增加传感器表面与传感分子的结合位点；同时，结合光微流激光高灵敏度传感方法，进一步提高光微流激光传感的传感灵敏度；经过测试，本发明与传统光微流激光传感方法相比，本发明具有更低的激光阈值和更高的传感曲线斜率，故有更高的传感灵敏度。
综上，本发明显著提高了传统光微流激光检测方法的传感灵敏度，降低了传统光微流激光检测方法的激光阈值，实现了更高灵敏度、更低光微流激光阈值的辣根过氧化物酶浓度传感器；并且，传感过程中，所需待测样本体积很小、少于1μL。
附图说明
图1为本发明基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器的结构放大示意图。
图2为本发明基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器的结构示意图。
图3为本发明基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感系统装置图；其中，1为泵浦激光器，2为扩束用双平凸透镜组(其中，两个平凸透镜焦距分别为f1＝50mm、f2＝100mm、中间间距150mm)，3为固定衰减，4为可调衰减(最大衰减量1OD)，5为柱面镜(f＝100mm)，6为样品台，7为v型槽，8为平凸透镜(f＝75mm)，9为光阑，10为滤光片，11为光谱仪，12为能量计，13为PC端。
图4为实施例中本发明与对照组(不存在纳米颗粒，Streptavidin-HRP直接与空心薄壁光纤内壁引入的生物素分子连接)的阈值曲线对比，其中，Streptavidin-HRP浓度固定为1.5nM。
图5为实施例中本发明与对照组的传感曲线对比。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本实施例提供一种基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器，以及包括上述传感器的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感系统。
所述传感系统如图3所示，由泵浦模块、信号收集模块和传感模块组成；其中，所述泵浦模块包括：纳秒激光器1(532nm)、双平凸透镜组2(两个平凸透镜焦距分别为f1＝50mm、f2＝100mm)、固定衰减片3、可调衰减片4(最大衰减量1OD)、柱面镜5(f＝100mm)、样品台6、v型槽7与能量计12，所述信号收集模块包括：平凸透镜8(f＝75mm)、光阑9、滤光片10、光谱仪11，所述传感模块即为基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器；所述v型槽7设置于样品台6上，所述传感模块放置于v型槽7中，由v型槽(7)起到固定作用；
激光从纳秒激光器1出射后，通过双平凸透镜组2进行扩束，然后通过柱面镜5将圆形光斑压缩为线光斑照射在测试光纤上，双平凸透镜组2和柱面镜5组合，用于减小由于每次测试光纤位置放置不统一引入的测量误差，提高一次性检测的可重复性；所述固定衰减片3与可调衰减片4依次设置于双平凸透镜组2于柱面镜5之间、用于调节泵浦能量，并由能量计12监测泵浦激光能量强度；
当测试光纤内壁捕获有辣根过氧化物酶分子时，辣根过氧化物酶催化ADHP(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)底物混合试剂产生染料分子，泵浦激光照射在测试光纤上，激发内部染料分子发光并在薄壁光纤内壁谐振，产生激光信号，产生的激光信号经过平凸透镜8收集，然后通过滤光片10滤掉泵浦光信号后，激光信号被光谱仪11接收并传输到PC端13，保存为光谱信号，后续数据处理后可转化为传感信号；所述光阑9用于信号收集模块的位置调整，保证信号收集模块处于最佳位置。
本实施例中，如图1、图2所示为本发明基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器(传感模块)与传统光纤微流激光传感器检测方法的结构对比图，图1为图2的放大示意图，其中，左图均为传统光纤微流激光传感器检测方法，右图均为本发明基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器；所述传统光纤微流激光传感器检测方法包括：空心薄壁光纤、NHS-biotin分子，所述空心薄壁光纤的内壁通过APTES引入氨基，所述NHS-biotin分子通过NHS-氨基交联方式结合于氨基化空心薄壁光纤内壁；本发明传感器包括：空心薄壁光纤、表面氨基化二氧化硅纳米球及NHS-biotin分子，所述空心薄壁光纤的内壁通过APTES引入氨基，所述表面氨基化二氧化硅纳米球通过DSS交联剂(氨基对氨基交联方式)结合于氨基化空心薄壁光纤内壁，所述NHS-biotin分子通过NHS-氨基交联方式结合于表面氨基化二氧化硅纳米球表面。
本实施例中，作为对照组的传统光微流激光传感器(不存在纳米颗粒)的制备工艺为：
步骤1：空心薄壁光纤清洗
空心薄壁光纤规格为外径159μm、壁厚3.8μm、长度2.5cm，去除涂覆层后，泡在丙酮内备用；
步骤2：氨基化
将空心薄壁光纤放在食人鱼溶液(V浓硫酸：V过氧化氢(30％)＝7:3混合溶液)中浸泡14小时；然后通过三次超纯水清洗和一次丙酮清洗后，浸入浓度为5％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)丙酮溶液中孵育2小时，孵育完成后再用丙酮、无水乙醇各清洗一次之后备用；
步骤3：将氨基化后的空心薄壁光纤用PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗后，转入1mMNHS-biotin(D-生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)PBS溶液内孵育30分钟；然后用PBS冲洗掉未固定的NHS-biotin分子，并浸泡在PBS内待用。
本发明基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器的制备工艺为：采用上述相同工艺进行空心薄壁光纤清洗与氨基化处理；
步骤3：将氨基化后的空心薄壁光纤用DMSO(二甲基亚砜)清洗后，转入50mg/mlDSS(二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯)DMSO溶液中孵育2小时，然后用DMSO清洗掉未固定的DSS分子，并转移至50μg/ml表面氨基化二氧化硅纳米球(SiO2-NH2、直径为60nm)水溶液中孵育60分钟，孵育完成后用PBS清洗；再转入1mM NHS-biotin PBS溶液内孵育30分钟，最后用PBS冲洗掉未固定的NHS-biotin分子，并浸泡在PBS内待用。
下面将本发明与对照组进行测试，以说明本发明的有益效果：
Streptavidin-HRP(Sav-HRP,链霉亲和素-辣根过氧化物酶)传感曲线测试实验：
Streptavidin-HRP原液浓度为75nM，首先用稀释液将其稀释为15nM、7.5nM、1.5nM、750pM、150pM、75pM六组浓度梯度；准备6根制样光纤，将其分别浸入6组浓度的Streptavidin-HRP中，孵育60分钟，Streptavidin-HRP分子通过streptavidin-biotin特异性结合的方式结合于空心薄壁光纤内壁；然后用PBS冲洗掉未固定的Streptavidin-HRP分子，并浸泡在PBS内待测。本发明采用赛默飞商用ADHP试剂盒(QuantaRedTM EnhancedChemifluorescent HRP Substrate【货号：15159】、增强型化学荧光HRP底物)，使用时将100μL稳定的过氧化物溶液、100μL增强剂溶液和2μL ADHP浓缩液混合均匀；然后取出待测光纤，排出内部液体，吸入混合后的ADHP底物混合试剂，放置于样品台上的v型槽中，避光静置30分钟后，开始测试。
如图4所示为两种制样光纤在Strepatvidin-HRP浓度固定为1.5nM时测得的阈值曲线，由图可见，对照组激光阈值在133.33μJ/mm2附近，而本发明传感器在同样浓度下测得的激光阈值在33.33μJ/mm2附近，在该Streptavidin-HRP浓度下，本发明显著降低了现有的光纤微流激光传感器检测方法的激光阈值。
如图5所示为两种制样光纤测得的Streptavidin-HRP浓度传感曲线，两种制样光纤测得的传感曲线线性范围均为75pM-15nM；经过数据拟合，两种制样光纤测得的两条传感拟合直线方程及决定系数分别为：
对照组：y＝7362*x-13790(R-Square＝0.9863)，
本发明：y＝11590*x-19550(R-Square＝0.991)；
拟合结果显示，两种制样光纤的strepatvidin-HRP传感曲线线性度均较好，决定系数均高于95％，并且，本发明传感器测得的传感曲线与对照组比较，其传感曲线斜率提高了57.4％，提高了传感灵敏度；
需要说明的是，本实施例中内容同样适用于其他结构的纳米材料如金纳米颗粒、银纳米颗粒等。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本说明书中所公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换；所公开的所有特征、或所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以任何方式组合。

Claims (5)

1.一种基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，包括：空心薄壁光纤、纳米颗粒及生物分子；其特征在于，所述光纤微流激光传感器为基于纳米颗粒的光纤微流激光辣根过氧化物酶浓度传感器，所述空心薄壁光纤的内壁通过APTES引入氨基，所述纳米颗粒采用表面氨基化纳米颗粒，表面氨基化纳米颗粒通过DSS交联剂结合于氨基化空心薄壁光纤内壁，NHS-biotin分子通过NHS-氨基交联方式结合于氨基化纳米颗粒表面、用以特异性捕获Streptavidin-HRP分子。
2.按权利要求1所述基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，其特征在于，所述传感器的传感过程为：将传感器吸入待测Streptavidin-HRP溶液，孵育40-90分钟后，用PBS冲洗掉未捕获Streptavidin-HRP分子；再吸入ADHP底物混合试剂，避光静置30-60分钟，传感器内壁捕获的Streptavidin-HRP分子将催化ADHP底物产生染料分子；当泵浦激光照射在传感器上时，激发染料分子发光并在薄壁光纤内壁谐振，产生激光信号，经过信号采集与数据处理后得到传感信号。
3.按权利要求1所述基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器，其特征在于，所述纳米颗粒采用二氧化硅纳米颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒。
4.按权利要求1所述基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将空心薄壁光纤去除涂覆层后，泡在丙酮内备用；
步骤2：将空心薄壁光纤放在食人鱼溶液中浸泡2-14小时；然后依次通过超纯水和丙酮清洗后，浸入浓度为3%-10%的APTES丙酮溶液中孵育2-6小时，孵育完成后再用丙酮、无水乙醇分别清洗后备用；
步骤3：将表面氨基化空心薄壁光纤用DMSO清洗后，转入20-50 mg/ml DSS DMSO溶液中孵育1-3小时，然后用DMSO清洗掉未固定DSS分子，并转移至50-500 μg/ml表面氨基化纳米颗粒溶液中孵育40-90分钟，孵育完成后用PBS清洗；再转入1-5 mM NHS-biotin PBS溶液内孵育20-40分钟，最后用PBS冲洗掉未固定NHS-biotin分子，并浸泡在PBS内待用。
5.基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器的传感系统，由泵浦模块、信号收集模块和传感模块组成；其特征在于，所述泵浦模块包括：纳秒激光器（1）、双平凸透镜组（2）、固定衰减片（3）、可调衰减片（4）、柱面镜（5）、样品台（6）、v型槽（7）与能量计（12），所述信号收集模块包括：平凸透镜（8）、光阑（9）、滤光片（10）、光谱仪（11），所述传感模块为权利要求1所述基于纳米颗粒的光纤微流激光传感器；所述v型槽（7）设置于样品台（6）上，所述传感模块放置于v型槽（7）中；
激光从纳秒激光器（1）出射后，通过双平凸透镜组（2）进行扩束，然后通过柱面镜（5）将圆形光斑压缩为线光斑，作为泵浦激光照射在传感模块上；传感模块产生激光信号，激光信号经过平凸透镜（8）收集、再通过滤光片（10）滤掉泵浦光信号后、由光谱仪（11）接收并传输到PC端（13）保存为光谱信号，后续数据处理后转化为传感信号；
所述固定衰减片（3）与可调衰减片（4）依次设置于双平凸透镜组（2）与柱面镜（5）之间、用于调节泵浦能量，并由能量计（12）监测泵浦激光能量强度；所述光阑（9）用于信号收集模块的位置调整。
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