CN112903593B - 一种基于序列结合的快速生化分析仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于序列结合的快速生化分析仪，属于传感器技术领域。该生化分析仪主要包括激光器、分束镜、柱面透镜、试剂容器、样品光纤、样品台、收集元件、探测光纤、光电探测单元、计算机。样品光纤为微结构光纤，采用序列结合的方式在微结构光纤内表面交联生化分子，即基于毛细效应将生化试剂吸入微结构光纤内，并与微结构光纤内表面位点结合，随后将生化试剂储存在光纤内。同时，利用微结构光纤表面体积比大的优点，可实现快速和高灵敏的生化检测。本发明提供的序列结合的快速生化分析仪检测速度快，灵敏度高，试剂用量少，可避免生物试剂的污染，可解决小尺寸结构传感器难以洗出的问题，可实现不同生化参量的检测。
Description
技术领域
本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种基于序列结合的快速生化分析仪，实现高灵敏度的生化检测。
背景技术
酶联免疫吸附试验(ELISA)作为免疫反应的金标准，已广泛应用于临床检测、生化分析、环境检测、食品安全等领域。通过液体孵育，将捕获抗体、蛋白质、检测抗体和发光物质一层一层地交联在固相表面，孵育完成后用清洗液洗去未结合的生物分子，避免非特异性结合。但现有的固相基底都是平面型，其表面体积比较小，分子扩散到表面进行结合的时间较长，表面位点数也有限，具有灵敏度低、耗时长、试剂用量大等缺点。微结构光纤由于其独特的微尺度效应，具有样品用量少、表面体积比大、易于集成等优点。将微结构光纤的表面作为固相基底，进行各项生化分析操作，可实现快速分析、减少试剂用量、易于集成。一方面，样品分子扩散到微结构光纤表面的距离短，使得扩散时间变短，从而可加快检测速度；另一方面，微结构光纤尺寸小，其具有较大的表面体积比，可提高灵敏度。因此，采用微结构光纤可有效缩减试剂消耗量、提升生化检测速率和检测灵敏度。但微结构光纤尺寸越小，其清洗过程也越困难。因此，本发明利用毛细效应实现了序列结合的光纤微流激光。
发明内容
本发明针对背景技术中提到的缺陷设计并制作了一种基于序列结合的快速生化分析仪。该生化分析仪具有快速、结构简单、测量精度高等特点。
一种基于序列结合的快速生化分析仪，包括泵浦光源模块Ⅰ、样品制备模块Ⅱ、检测模块Ⅲ和信号收集处理模块Ⅳ，共四个部分；
所述泵浦光源模块包括：激光器(1)、分束镜(2)、小孔光阑(3)、能量探头(4)、小孔光阑(5)、柱面透镜(6)，所述激光器(1)输出泵浦激光，经分束镜(2)将泵浦激光分为两束，其中一束经过小孔光阑(3)后通过能量探头(4)实时监测能量；另一束泵浦激光经过小孔光阑(5)，再经柱面透镜(6)会聚，垂直照射在样品光纤(8)上；所述小孔光阑(3)和(5)可对泵浦激光进行空间滤波和光束整形；所述能量探头(4)对脉冲泵浦光的能量进行实时监测；
所述样品制备模块包括：试剂容器(7)和样品光纤(8)，所述样品光纤(8)为微结构光纤，采用序列结合的方式制备，利用毛细效应将样品容器(7)中的生物试剂吸入微结构光纤内，并与微结构光纤内表面位点结合，随后将试剂储存在光纤内待检测；
所述检测模块包括：样品台(9)和样品光纤(8)，所述样品光纤(8)为微结构光纤，内部交联有生化试剂分子，样品台(9)用于精确控制光纤的空间位置；所述泵浦激光垂直入射到样品光纤(8)检测段的表面后，产生光信号输出，检测段位于样品光纤的进样端；
所述信号收集处理模块包括：收集元件(10)、探测光纤(11)、光电探测单元(12)、计算机(13)，所述收集元件(10)将收集到的光信号耦合到探测光纤(11)中，光信号沿探测光纤(11)传输到光电探测单元(12)，光电探测单元(12)对光信号进行处理，并将处理结果输出到计算机(13)；
所述样品光纤为含有微孔结构的光纤，检测时所述样品制备模块中样品光纤的制备方法为：
步骤1：去除样品光纤涂覆层；
步骤2：采用样品光纤吸入捕获位点溶液，孵育完成后，采用清洗液和磷酸缓冲液清洗未结合在样品光纤表面的捕获位点；
步骤3：吸入待测蛋白溶液，保证样品光纤的检测段充满待测蛋白溶液，孵育完成后，依次吸入清洗液、磷酸缓冲液；
步骤4：吸入检测位点溶液，保证样品光纤的检测段充满检测位点溶液，孵育完成后，依次吸入清洗液、磷酸缓冲液。
进一步地，所述样品光纤的制备方法中在步骤2吸入捕获位点溶液后吸入石蜡油；步骤3吸入待测蛋白溶液后吸入石蜡油；所述步骤4中吸入检测位点溶液后吸入石蜡油作为阻隔液。
进一步地，所述样品光纤(8)的检测段的长度位于样品光纤进样端的第5mm-20mm处。
进一步地，所述样品光纤(8)为空芯光纤或者光子晶体光纤。
进一步地，激光器(1)输出脉冲激光或连续激光；脉冲激光波长在400nm至800nm之间，脉冲激光能量在0.01mJ至10mJ之间，连续激光输出功率在0.1mW至50mW之间。
进一步地，所述光电探测单元(12)为光电探测器或微型光谱仪；光电探测器经数据采集卡采集传感信号，微型光谱仪用光栅和CCD对传感信号进行解调。
本发明将微结构光纤作为固相基底，利用序列结合的方式将生物分子交联在光纤内表面。一方面，利用微结构光纤表面体积比大的优势，使其表面的生物分子固定位点变多，从而可增加灵敏度，从而实现高灵敏度的生化检测。另一个方面，利用光纤在长度方面的优势，采用序列结合的方式，将各类交联试剂利用毛细效应吸入光纤内，与光纤内表面位点结合后储存在光纤内部，可解决小尺寸结构传感器难以将交联试剂洗出的难题，并避免了生物污染。
本发明的有益效果为：
1、本发明提出的序列结合方式，将生物试剂利用毛细效应吸入微结构光纤内并与微结构光纤内表面位点结合，最后将试剂储存在光纤内，可避免生物试剂的污染，可解决小尺寸结构传感器难以洗出的问题。
2、本发明利用微结构光纤作为固相基底，提高了表面体积比，增加了生物分子的交联位点，可提高生化检测的灵敏度。
3、本发明利用微结构光纤尺寸小的特点，缩减了试剂消耗量，提高了集成度。
4、本发明提供的生化操作方法可改变生化检测原理和交联试剂种类，从而实现不同生化参量的检测。
附图说明
图1为本发明提供的基于序列结合的快速生化分析仪的结构示意图。
图2为本发明提供的基于序列结合的流程省略示意图。
图3为本发明提供的基于序列结合的石蜡油隔离流程省略示意图。
图4为本发明提供的基于序列结合的快速生化分析仪的激光强度与亲和素浓度关系曲线。
具体实施方法
本发明用于解决微结构光纤内难以清洗的问题。序列结合技术中，利用微结构光纤内各通道的毛细效应，将生化步骤中的试剂依次吸入微结构光纤内进行分子结合，交联过程完成后，试剂储存在光纤内，并继续利用毛细效应吸入下一步试剂进行结合，最后在微结构光纤表面完成生化分子的交联。此过程中，各项生化试剂无需从光纤内洗出，并依次储存在沿光纤长度方向的通道内。此技术解决了微结构光纤内难以洗出液体的难题，并保留了微结构光纤快速分析、样品消耗少、灵敏度高的优点，可通过不同的生化操作步骤用于各项生化分析。
本发明方法具体包括以下步骤：
本实施例的基于序列结合的快速生化分析仪包括泵浦光源模块1、样品制备模块2、样品检测模块3和信号收集处理模块4四个部分。所述泵浦光源模块包括：532nm脉冲激光器(1)、分束镜(2)、柱面透镜(6)，所述532nm脉冲激光器(1)输出脉冲泵浦光，利用分束镜(2)对脉冲泵浦光进行分束，其中一束通过小孔光阑(3)用于实时监测能量，另一束通过小孔光阑(5)对脉冲泵浦光进行空间滤波和光束整形，然后经柱面透镜(6)会聚，再垂直入射到样品光纤(8)上；同时，将收集元件(10)位置调好并固定，然后用探测光纤(11)将其与光谱仪(12)连接，使得光谱仪的输出信号传输至计算机(13)。
所述样品制备模块包括：离心管(7)和微结构光纤(8)，其中离心管内盛装有生化试剂，微结构光纤(8)浸在离心管内的试剂中利用毛细效应将其吸入。与光纤内表面的位点结合之后，继续将光纤浸入下一个试剂中，利用毛细效应吸入该试剂，并将上一试剂依次储存在光纤长度方向。
所述样品检测模块包括：微结构光纤(8)和样品台(9)。将微结构光纤的多孔内壁作为固相基底，各种生物试剂在其内部通过序列结合的方式交联。即生物试剂按照交联顺序利用毛细效应依次吸入光纤内，并沿着光纤长度方向储存，试剂上升的总高度通过插入试剂深度进行调节。样品台上采用v型槽和盖板来高重复性地控制光纤的空间位置，并使脉冲泵浦光垂直照射在光纤上。
将微结构光纤浸泡在丙酮中，去除其涂覆层，并在新鲜配置的食人鱼溶液(H2SO4：H2O2＝7：3，v/v)中浸泡12h。用去离子水清洗三次，每次5min，再用丙酮浸泡20min；利用微结构光纤的毛细效应吸入5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，孵育4h，用丙酮清洗3次，每次5min。微结构光纤内吸入200μM生物素琥珀酰亚胺酯溶液孵育30min，用清洗液和磷酸缓冲液分别清洗1次，得到生物素化的微结构光纤。
利用微结构光纤的毛细效应，向光纤内吸入不同浓度的亲和素溶液孵育10min。将光纤浸入清洗液内利用毛细效应吸入光纤，随后将磷酸缓冲液吸入光纤。再利用毛细效应向光纤内吸入1mg/mL的链霉亲和素-Cy3溶液孵育10min。链霉亲和素-Cy3溶液不排出光纤，继续利用毛细效应向光纤内依次吸入清洗液和磷酸缓冲液。最后，在微结构光纤进样端形成一层Cy3与亲和素的修饰层，再吸入磷酸缓冲液，待测试，如图2所示。通过测定离微结构光纤(8)进样端5-20mm的激光信号来排除液体间扩散的影响。由于亲和素与链霉亲和素都会特异性结合光纤内的生物素位点，因此最终的激光信号强弱与亲和素的浓度呈负相关关系。
上述的序列结合方法中，由于石蜡油与其余试剂不相溶，则相邻液体之间还可吸入石蜡油作为阻隔液来防止相邻液体之间的扩散，如图3所示。
将充满磷酸缓冲液的光纤(8)放置在样品台(9)上，如图1所示。其中，Cy3作为增益介质，微结构光纤作为谐振腔，利用激光发射强度来表征亲和素的浓度，亲和素浓度越小，激光强度越强。打开脉冲泵浦光源，以单脉冲泵浦的方式照射样品光纤(8)，记录下不同浓度的亲和素所对应的激光强度。每次测量时，观察能量探头(4)示数，以实时监测泵浦能量。再将不同浓度的亲和素与对应的激光强度绘制出一条标准曲线，如图4所示。
对于待测样品，重复上述测量步骤，将测得的激光强度与标准曲线进行比对，即可得到样品的具体浓度。
对于不同的待测物可选用不同的生化步骤和试剂，并利用毛细效应将试剂依次吸入微结构光纤实现序列结合。例如，需要实现“金标准”酶联免疫吸附测定，需要将捕获抗体、封闭试剂、抗原、检测抗体、酶标二抗利用毛细效应依次吸入微结构光纤，并孵育一定时间，最后吸入底物溶液进行光信号测定即可。因此，采用此方式也可以完成各种蛋白质浓度的快速和高灵敏测定。
Claims (6)
1.一种基于序列结合的快速生化分析仪，该生化分析仪包括泵浦光源模块Ⅰ、样品制备模块Ⅱ、检测模块Ⅲ和信号收集处理模块Ⅳ，共四个部分；
所述泵浦光源模块包括：激光器（1）、分束镜（2）、小孔光阑（3）、能量探头（4）、小孔光阑（5）、柱面透镜（6），所述激光器（1）输出泵浦激光，经分束镜（2）将泵浦激光分为两束，其中一束经过小孔光阑（3）后通过能量探头（4）实时监测能量；另一束泵浦激光经过小孔光阑（5），再经柱面透镜（6）会聚，垂直照射在样品光纤（8）上；上述的两个小孔光阑对泵浦激光进行空间滤波和光束整形；所述能量探头（4）对脉冲泵浦光的能量进行实时监测；
所述样品制备模块包括：试剂容器（7）和样品光纤（8），所述样品光纤（8）为微结构光纤，采用序列结合的方式制备，利用毛细效应将样品容器（7）中的生物试剂吸入微结构光纤内，并与微结构光纤内表面位点结合，随后将试剂储存在光纤内待检测；
所述检测模块包括：样品台（9）和样品光纤（8），所述样品光纤（8）为微结构光纤，内部交联有生化试剂分子，样品台（9）用于精确控制光纤的空间位置；所述泵浦激光垂直入射到样品光纤（8）检测段的表面后，产生光信号输出，检测段位于样品光纤的进样端；
所述信号收集处理模块包括：收集元件（10）、探测光纤（11）、光电探测单元（12）、计算机（13），所述收集元件（10）将收集到的光信号耦合到探测光纤（11）中，光信号沿探测光纤（11）传输到光电探测单元（12），光电探测单元（12）对光信号进行处理，并将处理结果输出到计算机（13）；
所述样品光纤为含有微孔结构的光纤，检测时所述样品制备模块中样品光纤的制备方法为：
步骤1：去除样品光纤涂覆层；
步骤2：采用样品光纤吸入捕获位点溶液，孵育完成后，采用清洗液和磷酸缓冲液清洗未结合在样品光纤表面的捕获位点；
步骤3：吸入待测蛋白溶液，保证样品光纤的检测段充满待测蛋白溶液，孵育完成后，依次吸入清洗液、磷酸缓冲液；
步骤4：吸入检测位点溶液，保证样品光纤的检测段充满检测位点溶液，孵育完成后，依次吸入清洗液、磷酸缓冲液。
2.如权利要求1所述的一种基于序列结合的快速生化分析仪，其特征在于，所述样品光纤的制备方法中在步骤2吸入捕获位点溶液后吸入石蜡油；步骤3吸入待测蛋白溶液后吸入石蜡油；所述步骤4中吸入检测位点溶液后吸入石蜡油作为阻隔液。
3.如权利要求1所述的一种基于序列结合的快速生化分析仪，其特征在于，所述样品光纤（8）的检测段的长度位于样品光纤进样端的第5mm-20mm处。
4.如权利要求1所述的一种基于序列结合的快速生化分析仪，其特征在于，所述样品光纤（8）为空芯光纤或者光子晶体光纤。
5.如权利要求1所述的一种基于序列结合的快速生化分析仪，其特征在于，激光器（1）输出脉冲激光或连续激光；脉冲激光波长在400nm至800nm之间，脉冲激光能量在0.01mJ至10mJ之间，连续激光输出功率在0.1mW至50mW之间。
6.如权利要求1所述的一种基于序列结合的快速生化分析仪，其特征在于，所述光电探测单元（12）为光电探测器或微型光谱仪；光电探测器经数据采集卡采集传感信号，微型光谱仪用光栅和CCD对传感信号进行解调。
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